Name: 신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 배우세요 쥐 뇌 미세혈관 분리법을 통해 혈액뇌장벽 분자 특성을 연구하는 방법을. 이 기술은 개별 동물에서 고품질 단백질을 분석하여 신경약리학 및 생리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 PTR에 건강의 국가 학회 (R01-NS084941)와 애리조나 생물 의학 연구 위원회 (ADHS16-162406)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. WA는 과거의 국가 연구소의 건강 교육 부여 (T32-HL007249)을 미리 박사 약속에서 지원 받았다.

아래에 설명 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다와 국립 보건원 (NIH) 및 동물 연구: Vivo에서 실험 (도착) 지침을 보고. 프로토콜에 대 한 절차 흐름은 그림 1에 묘사 된다.
1입니다. 설정 절차에 대 한
<ol><li>뇌 microvessel 버퍼 (BMB)를 준비 합니다. 54.66 g D-마 니 톨, 1.90 g EGTA, 깨끗 한 비 커에 1.46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (즉, 트리 스) 자료를 재 시작 합니다. 이온된 수의 1.0 L를 추가 합니다. 자력 교 반기를 사용 하 여 BMB 버퍼의 구성 요소를 믹스. 일단 솔루션을 철저 하 게 혼합 되어, pH 7.4 1.0 M HCl을 사용 하 여를 조정 합니다.</li>
	<li>동물을 마비 전에 26 %dextran (MW 75000) 솔루션 (w/v)을 준비 합니다. 다음 단계에 설명 된 대로 dextran 솔루션을 준비 합니다. 참고: 그것은 비판적으로 dextran 약 1.5-2 h 수성 버퍼에 분해를 걸릴 수 있기 때문에 미리이 솔루션을 준비 하는 것이 중요.<ol>
<li>깨끗 한 비 커에 가루 dextran (26 g 버퍼 100 mL 당) 밖으로 무게.</li>
		<li>BMB의 적절 한 양을 밖으로 측정 하 고, 깨끗 한 별도 비 커에 분배.</li>
		<li>천천히 BMB 붓고 가루 dextran을 포함 하는 비 커. 수동으로 BMB 유리 저 어 막대를 사용 하 여의 붓는 동안 가루 dextran을 믹스.</li>
		<li>사용 하 여 즉시 사전 1.0 M HCl와 7.4에 pH를 조정 합니다. 참고: 12 개별 Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 microvessels의 일반적인 격리 (남성 또는 여성; 나이의 3 개월, 200-250 g) dextran 솔루션 (즉, 52 g dextran BMB의 200 ml에서) 200 mL를 필요 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sprague-Dawley 쥐에서 뇌 조직 추출
<ol><li>케 타 민 (50 mg/kg, 2.5 mL/kg i.p.) 및 xylazine를 사용 하 여 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 다음과 같은 원하는 실험 치료 (10mg/mL; 2.5 mL/kg 나, p.). 마 취 제와 최종 농도 20 mg/mL 및 4.0 mg/mL의 0.9% 염 분에서 xylazine을 각각 희석. 잘린 IACUC 지침에 따라 날카롭게 단두대를 사용 하 여 동물을 안락사. 동일한 절차를 사용 하 여 둘 다 남성과 여성 Sprague-Dawley 쥐를 위해.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 단일 가로 컷 하 여 쥐 두개골에서 피부를 resect.</li>
	<li>Rongeurs를 사용 하 여 신중 하 게 두개골 플레이트를 제거 하 고 뇌를 노출.</li>
	<li>주걱을 사용 하 여 뇌를 제거 합니다. 뇌를 분리 고 격리 된 뇌 조직 50 mL 원뿔 튜브 BMB의 5 mL를 포함 합니다. 프로 테아 제 억제 물 사용 전에 즉시 BMB 버퍼의 1.0 mL 당 칵테일의 1.0 μ를 추가 합니다.</li>
</ol>3. 두뇌 처리
<ol><li>50 mL 원뿔 튜브의 뇌 조직 깨끗 한 페 트리 접시에 전송.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 롤 두뇌에 대뇌 피 질에 느슨하게 준수 외부 meninges 제거 하 12.5 cm 직경 필터 종이. 부드럽게 필터 종이 대 한 뇌 조직의 누르고 다시 조직 롤. 이 단계 동안 자주 필터 종이 켜십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 대뇌 반구에서 맥락 막 신경 총을 구분 합니다. 참고: 맥락 막 신경 총 대뇌 뇌 실의 표면에 지역화 된 맑은 액체로 조직으로 나타납니다.</li>
	<li>부드럽게 뇌 조직의 평평 하 고 나머지 meninges과 후 각 전구 집게를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	<li>장소 냉장된 유리 박격포로 대뇌 피 질의 뇌 조직. 박격포를 BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일의 5.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여, 3700 rpm에 선 위아래로 15를 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 합니다. 각 개별 샘플의 균질, 사이 유 봉 70% 에탄올을 사용 하 여 청소. 참고: 균질 선 속도 관점에서 일관 되 고 크기.</li>
	<li>레이블이 지정 된 원심 분리기 튜브에는 homogenate를 부 어.</li>
</ol>4. 원심 분리 단계
<ol><li>뇌 homogenate 포함 된 각 레이블이 원심 분리기 튜브를 26 %dextran 솔루션 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브를 두 번 반전 그리고 철저 하 게 소용돌이 샘플. 뇌 26 %dextran 솔루션 homogenate 솔루션의 철저 하 게 혼합 되도록 여러 각도 사용 하 여 각 샘플의 vortexing를 실시 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플 참고: 일부 분석에 대 한 그것은 뇌 microvessels 뇌 실질과 비교 하는 데 유용입니다. 뇌 실질에 단백질 식의 평가 해야 필요한이 원심 분리 단계 (즉, 뇌 parenchymal 분수)에서 상쾌한 수집 고 나중에 사용-80 ° C에 저장.</li>
	<li>진공 흡 인기를 사용 하 여 상쾌한을 제거 하 고 유리 파스퇴르 피 펫. 참고: 주의 펠 렛을 방해 하지로 이동 해야 합니다. 그렇지 않으면, 뇌 microvessels 수집의 수량이 줄어들 것입니다는이 절차에서 단백질 수확량 크게 줄어.</li>
	<li>BMB 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 (즉, 1.0 μ 프로 테아 제 억제 물 칵테일 BMB 버퍼의 1.0 mL 당)의 5.0 mL에 펠 릿을 resuspend. 철저 하 게 혼합 되도록 펠 릿 소용돌이입니다.</li>
	<li>각 원심 분리기 튜브와 소용돌이 4.1-4.2이이 프로토콜의 단계에서 설명한 대로 26 %dextran 8.0 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 5000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>진공 플라스 크, 유리 피 펫을 사용 하, 상쾌한 발음 하 고 뇌 microvessel를 포함 하는 펠 릿 방해 하지 확인 하십시오. 참고: 초과 소재 튜브 벽에 고착 했다 microvessels를 포함 하지 않는 해야 될 신중 하 게 청소 하 고 제거.</li>
	<li>두 번 추가는 4.8-4.5 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>일단 4 dextran 원심 분리 단계 완료 되었습니다, 그리고 각 펠 릿 및 resuspend 샘플을 소용돌이 BMB의 5.0 mL를 추가 합니다. 참고: 다음 단계 4.10의 완료, 전체 microvessels 단백질 지 방화의 분석에 대 한 수집할 수 있습니다. 이 여 50 μ 다시 중단된 microvessel 펠 릿의 aliquot 유리 현미경 슬라이드에 번짐 수행할 수 있습니다. Microvessels는 뒤에 얼음 처럼 차가운 에탄올에 고정 추가 10 분 슬라이드 이미징 연구에 필요한 때까지 4 ° C에 저장 된 다음 수 열 블록에 10 분 동안 95 ° C에서 열 고정.</li>
</ol>5. Ultracentrifugation 총 뇌 Microvascular 막의 샘플을 준비 하
<ol><li>냉장된 유리 균질 화기에 샘플을 전송.</li>
	<li>오버 헤드 전원 균질 화기를 사용 하 여 3000 rpm에서 선 위아래로 8-10을 사용 하 여 뇌 조직의 균질. 균질 10 mL 박격포와 유 봉 조직 분쇄기를 사용 하 여 수행 됩니다. 유 봉 각 개별 샘플의 균질에 따라 70% 에탄올을 사용 하 여 청소.</li>
	<li>Ultracentrifuge 튜브를 청소 하는 샘플을 전송 합니다. 번호와 각 개별 튜브 무게. 균형 그리고 ultracentrifuge로 터에 로드 하기 전에 튜브 쌍. 참고: 모든 무게와 ultracentrifuge 튜브의 해야 합니다 실시는 모자에 튜브 무게의 정확한 측정을 보장 하기 위해.</li>
	<li>4 ° c.에서 1 h 150000 x g 에서 원심 분리기 샘플</li>
	<li>상쾌한 발음 진공 플라스 크, 유리 피 펫 파스퇴르를 사용 하 여 모 세관 멤브레인 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 사용 하 여.</li>
	<li>펠 릿 크기에 따라 달라 집니다, 1:1 (v/v) 비율로 이온된 수와 BMB의 구성 된 저장소 버퍼의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 일반적으로 펠 릿 저장 버퍼의 400-500 μ에 resuspended 있다. 프로 테아 제 억제 물 칵테일 저장소 버퍼의 1.0 mL 당 1.0 μ의 비율에서 저장소 버퍼에 추가 합니다.</li>
	<li>펠 릿 저장 버퍼에 resuspend를 소용돌이 샘플.</li>
	<li>Using 유리 파스퇴르 피 펫, 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 관에 모 세관 막 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>바늘을 통해 패스 샘플 샘플은 철저 하 게 혼합 하 고 아무 셀룰러 집계 존재 5 x 주사기.</li>
	<li>-80 ° c까지 분석에 필요한 샘플을 저장 합니다. 참고: 각 microvessel 막 샘플의 단백질 콘텐츠 브래드포드 메서드를 사용 하 여 측정 됩니다.</li>
</ol>

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<li>Lochhead, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+increases+blood-brain+barrier+permeability+and+induces+alterations+in+occludin+during+hypoxia-reoxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress increases blood-brain barrier permeability and induces alterations in occludin during hypoxia-reoxygenation.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 30 (9), 1625-1636 (2010).</li>
<li>Lucke-Wold, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bryostatin-1+Restores+Blood+Brain+Barrier+Integrity+following+Blast-Induced+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Bryostatin-1 Restores Blood Brain Barrier Integrity following Blast-Induced Traumatic Brain Injury.</a> Mol Neurobiol. 52 (3), 1119-1134 (2015).</li>
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<li>Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inflammatory+hyperalgesia+modulates+morphine+delivery+to+the+brain%3A+a+role+for+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein.</a> J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).</li>
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<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서는 갓 쥐 뇌 조직에서 분리 된 microvessels에서 막 단백질 샘플 준비의 간단 하 고 효과적인 방법을 설명 합니다. 격리 된 microvasculature에서 쥐 뇌 microvessels의 격리 및 막 준비의 세대에 대 한 몇 가지 방법은 문학13,20,,2122 에 보고 되었습니다. , 24.이 이렇게 하나의 실험 동물에서 우수한 단백질 수확량을 가진 막 샘플의 준비를 수 있도록 최적화 되었습니다 비록 위에서 설명한 microvessel 격리 프로토콜 원칙적으로 비슷합니다. 이 사전 탈락 했다 필요 풀 microvessels을 3 개 이상 Sprague-Dawley 쥐에서 만족 스러운 단백질 농축 단백질 분석에 대 한...

혈액-뇌 장벽 (BBB) 중앙 신경 시스템 (CNS)와 조직의 순환 간의 인터페이스에 존재 하 고 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할. 구체적으로, 정확 하 게 제어 용 질 농도에 효율적으로 뇌 조직 CNS1의 상당한 변화 요구를 충족 하는 데 필요한는 그 영양분을 공급 하 고 뇌 세포 외 액에는 BBB 기능. 이러한 역할 의미 microvascular 내 피 세포의 수준에 있는 BBB 잠재적으로 유해한 xenobiotics 수 없습니다 하면서 뇌 실질에 액세스 하는 일부 물질을 사용할 수 있는 개별 메커니즘을가지고 있어야 합니다. 축적. 사실, microvascular 내 피 세포 fenestrated 하지 않습니다 하 고 비 선택적인 침투성2의 부족을 보장 제한 pinocytosis 전시. 또한, microvessel 내 피 세포 꽉 접점과 외화 접합 단백질 형태로 실제 인접 한 내 피 세포 사이의 "봉인"과 뇌에 혈액을 매개로 물질의 paracellular 확산을 크게 제한 하는 표현 실질입니다. 사실, 내 인 성 및 외 인 성 물질의 선택적인 침투성의 통풍 관 및 경과 전송기3기능 식이 필요합니다. 전반적으로, 단단한 접속점, 외화 교차점, 및 전송기는 BBB의 독특한 장벽 속성을 유지 하기 위해 콘서트에서 작동.
BBB는 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽이 다. 예를 들어 산소/reoxygenation 스트레스는 혈관 마커 등을 증가 paracellular 침투성와 관련 중요 한 꽉 접합 단백질 (즉, occludin, zonulae occluden-1 (조로-1))의 식을 조절 하 보였다 자당4,,56으로. 외상 성 뇌 부상7 설정 주변 염증 성 통증8,9에서 BBB에서 비슷한 관찰 되었습니다. 이 같은 질병 또한 BBB10,,1112,13,14에서 전송 메커니즘을 조절 수 있습니다. 실제로, 저 산소 증/reoxygenation 부상 향상 polypeptide 1a4 수송 유기 음이온의 기능 식 (Oatp1a4)에서 BBB,으로 이어질 수 있는 특정 Oatp 전송 기판의 혈액-뇌 전송에 상당한 증가 같은 taurocholate 및 틴이13. BBB 속성 pharmacotherapy 자체, 뇌에 약물 효과에 모두 깊은 변화 및 약물-약물 상호 작용에 대 한 기초를 형성 수 있습니다 메커니즘에 의해 변경할 수 있습니다. 예를 들어 뇌 microvascular 내 피 세포에 아 세트 아미노 펜 대상 핵 수용 체 신호 메커니즘 기능 표현의 중요 한 경과 전송 P-당단백질 (P-gp), 증가 하 고 수정 하는 시간에 따른 진통 모 르 핀에 의해 수 여 된 opioid 진통제 약물 설립된 P-gp 수송 기판15. BBB 변화, 질병 또는 약물에 의해 유도 될 수 있다, 그의 철저 한 이해는 또한 식별 및 이러한 수정을 제어 하는 특정 규제 메커니즘의 필요 합니다. 사실, 이산 신호 경로 꽉 접합 단백질16,17 및 전송기15, 의 분자 표현 제어 하는 두뇌 microvascular 내 피 세포에서 발견 되었습니다 18,19. 함께 찍은, 이러한 관측 복잡 한 분자 경로 BBB 꽉 접합의 규제와 건강 및 질병에 전송기에 관련 된 나타냅니다.
BBB의 연구에 중요 한 도전 막 샘플의 후속 준비 및 실험 동물에서 파생 된 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하 고 효과적인 방법의 절대적인 요구 사항입니다. 이 샘플은 모두 뇌 microvascular 내 피 세포에 농축 하 고 다른 세포 유형의 존재에 제한 준비 되어야 한다. 지난 몇 년 동안 설치류 두뇌에서 microvasculature의 격리에 대 한 여러 방법론 과학 문학13,20,,2122에 보고 되었습니다. 이 문서에서는 간단 하 고, 강력한, 및 쥐 두뇌에서 microvessels의 격리 및 단백질 발현의 분석에 사용할 수 있는 내 피 막 농축 샘플의 준비에 대 한 재현 방법. 이 microvessel 격리 프로토콜의 한 장점은 개별 실험 동물에서 충분 한 단백질 수율과 높은 품질의 샘플 준비를 얻을 수 있습니다. 단백질 표정에 간 동물 다양성의 고려 수 있습니다. BBB에서 단백질 변경의 진정한 크기의 과대평가 (또는-추정) 수 이제 피할 수 있기 때문에이 프로토콜에는 이러한 사전은 크게 BBB 연구의 견고성을 향상. 또한, 여러 원심 분리 단계 dextran 포함 뉴런 등 원치 않는 세포 성분의 제거를 촉진 하는 동안 실험 샘플에서 microvessels의 향상 된 농축 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>#P8340</td><td>뇌 미세혈관 완충액의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>D-만니톨</td><td>시그마-알드리치</td><td>#M4125</td><td>뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>#E3889</td><td>뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>트리즈마 염기</td><td>시그마-알드리치</td><td>#T1503</td><td>뇌 미세혈관 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>덱스트란 (MW 75,000)</td><td>Spectrum Chemical Mftg Corp</td><td>#DE125</td><td>뇌 실질에서 미세혈관을 분리하기 위한 원심분리 단계에 사용되는 덱</td></tr><tr><td>스트란 Zetamine</td><td>MWI Animal Health</td><td>#501072</td><td>전신 마취제</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Western Medical Supply</td><td>#5530</td><td>전신 마취제</td></tr><tr><td>0.9% 식염수 Western</td><td>Medical Supply</td><td>N/A</td><td>전신 마취제 희석제</td></tr><tr><td>여과지 (직경 12.5cm)</td><td>VWR</td><td>#28320-100</td><td>뇌 조직에서 수막을 제거하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>#60.540.386</td><td>덱스트란 원심분리 단계</td></tr><tr><td>피어싱&트레이드에 사용되는 일회용 튜브; Coomassie Plus(Bradford) 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23236</td><td>멤브레인 제제의 단백질 농도 측정</td></tr><tr><td>Wheaton Overhead Power Homogenizer</td><td>DWK Life Sciences</td><td>#903475</td><td>시료 균질화에 필요</td></tr><tr><td>10.0ml 유리 모르타르 및 유봉 조직 분쇄기</td><td>DWK Life</td> <td>Sciences#358039</td><td>시료 균질화에 필요</td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H1758</td><td>완충액의 pH 조정에 필요</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#23210</td><td>Bradford 분석을 위한 단백질 표준</td></tr><tr><td>표준 펜치</td><td>Fine Science Tools</td><td>#91100-12</td><td>뇌 조직 해부에 사용</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>#16020-14</td><td>뇌를 분리하기 위해 두개골을 여는 데 사용</td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#352070</td><td>분리 후 뇌 조직을 수집하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>유리 파스퇴르 피펫</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>#13-678-20C</td><td>덱스트란 스핀 후 세포 파편의 흡인에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>에탄올, 무수</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#459836</td><td>조직 분쇄기를 청소하는 데 사용됩니다. 증류수로</td></tr> <tr><td>70%로 희석합니다.초원심분리기 튜브</td><td>Beckman-Coulter</td><td>#41121703</td><td>시료의 초원심분리에 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

A Simple and Reproducible Method to Prepare Membrane Samples from Freshly Isolated Rat Brain Microvessels

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 다양 한 병 태 생리 및 약리 자극에 응답 하는 동적 장벽 조직. 이러한 자극 으로부터 발생 하는 이러한 변경 고 수 있습니다 크게 뇌에 약물 전달 조절, 확장 하 여, 질병의 원인이 상당한 도전 중앙 신경 치료에서 (CNS). Pharmacotherapy에 영향을 주는 많은 BBB 변화를는 지역화 된 내 피 세포의 수준에서 단백질을 포함 한다. 실제로, 건강 및 질병에 BBB 생리학에 이러한 지식은이 막 단백질의 연구에 상당한 관심을 촉발 했다. 기초 과학 연구의 관점에서이 실험 동물에서 수확 하는 뇌 조직에서 microvessels의 격리에 대 한 간단 하지만 강력 하 고 재현할 수 방법에 대 한 요구를 의미 합니다. 갓 격리 된 microvessels에서 막 샘플을 준비 하기 위하여 샘플 준비 내 피 세포에 농축 되어야 하지만 다른 세포 유형 (즉, 이다, microglia, 신경, 혈관 단위의 존재 제한 필수적 이다 pericytes)입니다. 추가 혜택 개별 동물에서 실험적인 인구에서 단백질 식의 진정한 변화를 캡처하기 위해 샘플을 준비 하는 기능입니다. 이 원고에서 쥐 뇌 microvessels의 고립과 막 샘플의 준비에 대 한 활용 방법에 관한 세부 정보는 제공 됩니다. Microvessel 농축, 파생, 샘플에서 dextran 샘플 버퍼에 포함 된 4 개의 원심 분리 단계를 사용 하 여 이루어집니다. 이 프로토콜은 그들의 자신의 특정 응용 프로그램에 대 한 다른 실험실에 의해 쉽게 적응 수 있습니다. 이 프로토콜에서 생성 된 샘플 크게 생리 적, 병 태 생리, 약리 자극 응답 BBB의 이해를 원조 할 수 있는 단백질 분석 실험에서 강력한 실험 데이터를 얻을를 보였다.

쥐 뇌 microvessels의 격리 및 microvessel 막 샘플의 준비에 대 한 실험 흐름은 그림 1에 표시 됩니다. 여기에 제시 된 절차를 사용 하 여, 쥐 두뇌에서 그대로 microvessels의 성공적인 절연 설명 된다 (그림 2A). 이러한 혈관 원심 dextran와 ultracentrifugation 막 샘플 (즉, 다음 준공 단계 4.10) 준비를 개시 직전의 완료 후 얻은 했다. 이 이미지는 microvessel Oatp1a4, 두뇌 microvascular 내 피 세포2,11,13의 원형질 막에 잘 표현 될 표시 되었습니다 전송에 대 한 항 체를 사용 하 여 스테인드입니...

여기, 쥐 뇌 microvessels의 격리에 대 한 고 막 샘플의 준비에 대 한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 허용 단백질와 개별 동물에서 항복 하는 풍부한 microvessel 생산의 명확한 장점이 있습니다. 샘플은 다음 뇌 microvascular 내 피에 강력한 단백질 분석에 사용할 수 있습니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic barrier tissue that responds to various pathophysiological and pharmacological stimuli. Such changes resulting ...

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 혈액-뇌 장벽의 분자 특성을 이해하는 것을 목표로 하는 생화학적 연구를 위해 쥐의 뇌에서 대뇌 미세혈관을 분리하는 것입니다. 이 방법은 건강과 질병에서 밀접 접합 단백질 및 내인성 수송체의 조절, 국소화 및 발현과 같은 혈액-뇌 장벽 생리학 및 신경 약리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 동물 간의 단백질 발현의 자연적인 다양성을 고려하면서 개별 동물에서 충분한 수의 고품질 미세혈관을 분리할 수 있다는 것입니다.이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 뛰어난 학부생인 Bianca Reilly입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Sprague-Dawley 쥐를 안락사시키고 목을 베인 후, 수술용 가위를 사용하여 쥐의 두개골에서 피부를 한 번 가로 절개하여 절제합니다. 롱거스를 사용하여 조심스럽게 두개골 플레이트를 제거하고 뇌를 노출시킵니다.그런 다음 주걱으로 장기를 제거합니다. 대뇌를 분리하고 분리된 뇌 조직을 50ml 원뿔형 튜브에 BMB 5ml와 프로테아제 억제제 칵테일 5.0마이크로리터를 넣습니다. 티슈를 처리하려면 깨끗한 페트리 접시에 옮기십시오.그런 다음 겸자를 사용하여 직경 12.5cm의 여과지에 뇌를 부드럽게 굴려 대뇌 피질에 느슨하게 붙어있는 외부 수막을 제거합니다. 이 단계에서는 뇌 조직 표본에서 모든 수막 조직이 제거되었는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 수막은 뇌 조직에서 쉽게 분리될 수 있는 투명한 막 조직으로 시각화할 수 있습니다.뇌 조직을 여과지에 부드럽게 누르고 조직을 다시 굴리면서 이 단계에서 여과지를 자주 돌립니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 맥락막신경총을 대뇌 반구에서 분리합니다. 그런 다음 뇌 조직을 다시 부드럽게 평평하게 만들고 집게를 사용하여 백질에 인접한 후각 전구를 제거합니다.피질의 뇌 조직을 차가운 유리 절구에 넣습니다. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 BMB 5ml를 첨가합니다. 오버헤드 파워 균질화기를 사용하여 절구공이를 모르타르에 삽입하고 3, 700rpm에서 15번의 상하 스트로크를 사용하여 뇌 조직을 균질화합니다.그런 다음 균질액을 라벨이 부착된 원심분리기 튜브에 붓습니다. 샘플 사이에 70% 에탄올을 사용하여 유봉을 청소하십시오. 원심분리를 수행하려면 뇌 균질액이 포함된 각 라벨이 부착된 원심분리 튜브에 8.0ml의 26%덱스트란 용액을 추가합니다.튜브를 두 번 뒤집은 다음 샘플을 완전히 와류로 만듭니다. 뇌 균질화 용액과 26% 덱스트란 용액의 철저한 혼합을 보장하기 위해 여러 각도를 사용하여 각 샘플의 와류를 수행합니다. 샘플을 5, 000g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다.상층액을 흡인하고 펠릿을 프로테아제 억제제 칵테일로 5.0ml의 BMB에 재현탁합니다. 그런 다음 펠릿을 소용돌이하여 철저한 혼합을 보장합니다. 다음으로, 각 원심분리기 튜브에 8.0ml의 26%덱스트란을 첨가하고 방금 설명한 대로 와류를 일으킵니다.그런 다음 샘플을 다시 원심분리합니다. 진공 플라스크와 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 뇌 미세혈관을 포함하는 펠릿이 파괴되지 않았는지 확인합니다. 펠릿을 프로테아제 억제제로 BMB에 재현탁시킨 다음 26% 덱스트란을 2회 더 현탁시킵니다.최종 원심분리 후 각 펠릿과 와류에 5.0ml의 BMB를 첨가하여 샘플을 재현탁시킵니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 쥐의 뇌에서 온전한 미세혈관을 성공적으로 분리했습니다. 이 이미지에서 미세혈관은 뇌 미세혈관 내피 세포의 원형질막에서 잘 발현되는 수송체인 Oatp1a4에 대한 항체를 사용하여 염색됩니다.웨스턴 블롯(western blot)에서 입증된 바와 같이, 암컷 Sprague-Dawley 쥐에서 채취한 미세혈관의 멤브레인 제제에는 뇌 미세혈관 구조의 마커 단백질인 CD31이라고도 하는 PECAM-1이 풍부하게 함유되어 있습니다. 이 프로토콜을 최적화하는 동안 2단계 및 4개의 dextran 원심분리 단계를 사용하여 준비된 멤브레인 샘플에서 PECAM 농축이 관찰되었습니다. Bradford 단백질 분석에 의해 결정되고 이 표에 나열된 바와 같이, 멤브레인 제제는 일반적으로 밀리리터당 5.0mg에서 밀리리터당 10.0mg 사이의 단백질 농도를 산출합니다.단백질 값은 BSA를 표준으로 사용하여 생성된 표준 곡선을 기반으로 결정되었습니다. 여기에 보이는 것은 BBB 수송 단백질 Glut1에 대한 서쪽 얼룩입니다. 각 멤브레인 샘플에서 이 고도로 발현된 BBB 단백질에 대해 54킬로달톤의 투명한 단일 밴드가 검출되었습니다.이 그래프는 수컷 쥐와 암컷 쥐의 BBB에서 Glut1의 더 높은 발현을 보여줍니다. 나트륨/칼륨 ATPase의 발현에는 수컷과 암컷 동물 간에 차이가 관찰되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 2시간에서 2시간 반 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안, 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 샘플을 얼음 위에 보관하고 원심분리 단계 후 마이크로혈관 펠릿에서 상층액을 흡입할 때 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 미세혈관 샘플에서 공동 면역침전 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 혈액-뇌 장벽에서 동일한 단백질 복합체 내 다른 단백질의 연관성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후,이 기술은 혈액 뇌 장벽 생리학 및 신경 약리학 분야의 연구자들이 건강 및 신경 질환의 설치류 모델에서 혈액 뇌 장벽의 분자 특성을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 건강과 질병에 대한 혈액 뇌 장벽 생물학에 대한 자신의 연구를 위해 쥐의 뇌에서 고품질 미세혈관을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 밀도 구배 원심분리와 효소 소화 메호드의 조합을 사용하여 쥐의 뇌에서 미세혈관을 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 미세혈관은 콜라겐과 피브로넥틴 매트릭스로 사전 코팅된 배양 플라스크에서 배양하여 내피 세포 콜로니를 얻을 수 있습니다.

쥐 뇌 미세혈관에서 내피 세포 배양: 쥐 뇌의 미세혈관에서 내피 세포를 분리 및 배양하는 절차

이 비디오는 쥐의 뇌에서 혈액뇌장벽(BBB)을 구성하는 온전한 혈관과 뉴런 및 신경교세포를 분리하는 것을 보여줍니다. 분리된 혈관은 뇌 항상성을 유지하는 데 있어 혈관의 역할을 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.

쥐 뇌 혈관 분리: 쥐 뇌 샘플에서 온전한 혈관을 분리하는 프로토콜

이 비디오는 쥐의 뇌에서 미세아교세포를 분리하고 배양하는 방법을 보여줍니다. 그것은 미세아교세포에 특이적인 단클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여 다른 신경 세포와 비신경 세포에서 미세아교세포를 분리하는 것을 수반합니다.

Isolation and Culture of Microglia from Rat Brains using Serum-Free 배지를 이용한 쥐 뇌로부터의 미세아교세포(Microglia)

이 비디오는 안락사된 쥐로부터 뇌 미세혈관을 분리하는 과정을 보여줍니다. 여기에는 뇌 해부, 조직 세척, 기계적 소화, 그리고 미세혈관의 순수한 분획을 분리하기 위한 반복적인 원심분리가 포함됩니다.

쥐의 뇌에서 신경혈관 단위를 분리하는 방법

이 비디오는 효소 분해와 기계적 분쇄를 사용하여 얼어붙은 쥐의 뇌 조직을 단세포 현탁액으로 해리하는 방법을 보여줍니다. 준비된 세포는 유세포 분석 또는 유전자 발현 분석과 같은 다운스트림 응용 분야를 위해 에탄올로 고정되고 투과화됩니다.

Obtaining a Single-Cell Suspension from Frozen Rat Brain Tissue

본 연구의 목적은 쥐의 동계 내피 세포와 성상 세포의 공동 문화를 포함하는 생체 BBB 모델의 재현성을 확인하는 것이 었습니다. 내피 세포 단일 층은 높은 봉사자 낮은 LY 투과성을 발표했다. 특정 TJ 단백질의 발현은 염증과 운송 및 수용체의 기능에 기능적인 응답은 평가했다.

설정 - 업<em&gt; 체외</em쥐 뇌 혈관 벽의&gt; 모델 (BBB)​​ : BBB 불 침투성 및 수용체 매개 운송에 초점

우리는 쥐의 뇌의 혈관 구획을 정화할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 고립된 뇌 혈관에는 긴밀한 연접으로 연결되어 있고 연속적인 기저 층막, 주위 세포, 혈관 평활근 세포 및 혈관 주위 성상교세포로 둘러싸인 내피 세포가 포함됩니다.

마우스 뇌 혈관의 정화

여기 설명 (1) 갓 그대로 뇌 내 피 "튜브" 및 내 피 칼슘과 막 내 피 파생 hyperpolarization 동안 잠재적인의 (2) 동시 측정을 분리에 대 한 프로토콜이 있습니다. 또한, 이러한 메서드는 내 피 세포 칼슘 및 개별 또는 대화형 실험 변수로 전기 신호의 약리 튜닝 수 있습니다.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

우리는 신경 터미널에서 시 냅 스 소포 분포의 형태학 적 분석을 위한 고해상도 전자 현미경을 얻기 위해 신생아 쥐 뇌 조직을 처리 하는 절차를 설명 합니다. 이러한 방법으로 얻은 마이크로 그래프는 다양 한 세포 구성 요소와 그 차원 구조적 관계의 형태를 연구 하는 데에도 사용 될 수 있습니다.

신경 말단에서 시 냅 스 소포 분포의 미세 구조 형태학 적 분석을 위한 신생아 쥐 뇌 조직의 제조

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

우리는 뮤린 대뇌 골혈구의 추출을위한 프로토콜을 제시한다. 항생제 없는 농축 지향 pericyte 추출에 따라, 이 프로토콜은 높은 순도와 높은 수율을 제공 하는 생체 외에서 연구에 대 한 귀중 한 도구, 따라서 사용 하는 실험 동물의 수를 감소.

마우스에서 대뇌 골후혈구를 분리하는 고출력 방법

배우세요 쥐 뇌 미세혈관 분리법을 통해 혈액뇌장벽 분자 특성을 연구하는 방법을. 이 기술은 개별 동물에서 고품질 단백질을 분석하여 신경약리학 및 생리학 연구에 활용됩니다.

신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

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