신선 하 게 고립 된 쥐 두뇌 Microvessels에서 막 샘플을 준비 하는 간단 하 고 재현할 수 방법

이 절차의 전반적인 목표는 포유류 혈액-뇌 장벽의 분자 특성을 이해하는 것을 목표로 하는 생화학적 연구를 위해 쥐의 뇌에서 대뇌 미세혈관을 분리하는 것입니다. 이 방법은 건강과 질병에서 밀접 접합 단백질 및 내인성 수송체의 조절, 국소화 및 발현과 같은 혈액-뇌 장벽 생리학 및 신경 약리학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 개별 동물 간의 단백질 발현의 자연적인 다양성을 고려하면서 개별 동물에서 충분한 수의 고품질 미세혈관을 분리할 수 있다는 것입니다.

이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 뛰어난 학부생인 Bianca Reilly입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 Sprague-Dawley 쥐를 안락사시키고 목을 베인 후, 수술용 가위를 사용하여 쥐의 두개골에서 피부를 한 번 가로 절개하여 절제합니다. 롱거스를 사용하여 조심스럽게 두개골 플레이트를 제거하고 뇌를 노출시킵니다.

그런 다음 주걱으로 장기를 제거합니다. 대뇌를 분리하고 분리된 뇌 조직을 50ml 원뿔형 튜브에 BMB 5ml와 프로테아제 억제제 칵테일 5.0마이크로리터를 넣습니다. 티슈를 처리하려면 깨끗한 페트리 접시에 옮기십시오.

그런 다음 겸자를 사용하여 직경 12.5cm의 여과지에 뇌를 부드럽게 굴려 대뇌 피질에 느슨하게 붙어있는 외부 수막을 제거합니다. 이 단계에서는 뇌 조직 표본에서 모든 수막 조직이 제거되었는지 확인하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 수막은 뇌 조직에서 쉽게 분리될 수 있는 투명한 막 조직으로 시각화할 수 있습니다.

뇌 조직을 여과지에 부드럽게 누르고 조직을 다시 굴리면서 이 단계에서 여과지를 자주 돌립니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 맥락막신경총을 대뇌 반구에서 분리합니다. 그런 다음 뇌 조직을 다시 부드럽게 평평하게 만들고 집게를 사용하여 백질에 인접한 후각 전구를 제거합니다.

피질의 뇌 조직을 차가운 유리 절구에 넣습니다. 그런 다음 프로테아제 억제제 칵테일과 함께 BMB 5ml를 첨가합니다. 오버헤드 파워 균질화기를 사용하여 절구공이를 모르타르에 삽입하고 3, 700rpm에서 15번의 상하 스트로크를 사용하여 뇌 조직을 균질화합니다.

그런 다음 균질액을 라벨이 부착된 원심분리기 튜브에 붓습니다. 샘플 사이에 70% 에탄올을 사용하여 유봉을 청소하십시오. 원심분리를 수행하려면 뇌 균질액이 포함된 각 라벨이 부착된 원심분리 튜브에 8.0ml의 26%덱스트란 용액을 추가합니다.

튜브를 두 번 뒤집은 다음 샘플을 완전히 와류로 만듭니다. 뇌 균질화 용액과 26% 덱스트란 용액의 철저한 혼합을 보장하기 위해 여러 각도를 사용하여 각 샘플의 와류를 수행합니다. 샘플을 5, 000g 및 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다.

상층액을 흡인하고 펠릿을 프로테아제 억제제 칵테일로 5.0ml의 BMB에 재현탁합니다. 그런 다음 펠릿을 소용돌이하여 철저한 혼합을 보장합니다. 다음으로, 각 원심분리기 튜브에 8.0ml의 26%덱스트란을 첨가하고 방금 설명한 대로 와류를 일으

그런 다음 샘플을 다시 원심분리합니다. 진공 플라스크와 유리 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 뇌 미세혈관을 포함하는 펠릿이 파괴되지 않았는지 확인합니다. 펠릿을 프로테아제 억제제로 BMB에 재현탁시킨 다음 26% 덱스트란을 2회 더

최종 원심분리 후 각 펠릿과 와류에 5.0ml의 BMB를 첨가하여 샘플을 재현탁시킵니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜을 사용하여 쥐의 뇌에서 온전한 미세혈관을 성공적으로 분리했습니다. 이 이미지에서 미세혈관은 뇌 미세혈관 내피 세포의 원형질막에서 잘 발현되는 수송체인 Oatp1a4에 대한 항체를 사용하여 염색됩니다.

웨스턴 블롯(western blot)에서 입증된 바와 같이, 암컷 Sprague-Dawley 쥐에서 채취한 미세혈관의 멤브레인 제제에는 뇌 미세혈관 구조의 마커 단백질인 CD31이라고도 하는 PECAM-1이 풍부하게 함유되어 있습니다. 이 프로토콜을 최적화하는 동안 2단계 및 4개의 dextran 원심분리 단계를 사용하여 준비된 멤브레인 샘플에서 PECAM 농축이 관찰되었습니다. Bradford 단백질 분석에 의해 결정되고 이 표에 나열된 바와 같이, 멤브레인 제제는 일반적으로 밀리리터당 5.0mg에서 밀리리터당 10.0mg 사이의 단백질 농도를 산출합니다.

단백질 값은 BSA를 표준으로 사용하여 생성된 표준 곡선을 기반으로 결정되었습니다. 여기에 보이는 것은 BBB 수송 단백질 Glut1에 대한 서쪽 얼룩입니다. 각 멤브레인 샘플에서 이 고도로 발현된 BBB 단백질에 대해 54킬로달톤의 투명한 단일 밴드가 검출되었습니다.

이 그래프는 수컷 쥐와 암컷 쥐의 BBB에서 Glut1의 더 높은 발현을 보여줍니다. 나트륨/칼륨 ATPase의 발현에는 수컷과 암컷 동물 간에 차이가 관찰되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 2시간에서 2시간 반 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안, 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 샘플을 얼음 위에 보관하고 원심분리 단계 후 마이크로혈관 펠릿에서 상층액을 흡입할 때 주의해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 미세혈관 샘플에서 공동 면역침전 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 혈액-뇌 장벽에서 동일한 단백질 복합체 내 다른 단백질의 연관성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 개발 후,이 기술은 혈액 뇌 장벽 생리학 및 신경 약리학 분야의 연구자들이 건강 및 신경 질환의 설치류 모델에서 혈액 뇌 장벽의 분자 특성을 탐구 할 수있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 건강과 질병에 대한 혈액 뇌 장벽 생물학에 대한 자신의 연구를 위해 쥐의 뇌에서 고품질 미세혈관을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.