생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

이 모델은 상부 소화관에 대한 숙주 미시방향을 설정하는 다음 단계입니다. 이를 통해 기계론적 연구 문제를 해결할 수 있으며 식품, 제약, 기능 식품 산업 및 독성학에 많은 기회를 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 위장 시스템의 모델과 복잡한 미생물 군집을 포함한 숙주 마이크로 인터페이스를 결합한다는 것입니다.

그것은 매우 적용 가능하며 매우 유연합니다. 이 방법론은 병원체 생존력 및 후속 정보를 평가하기 위해 다른 세포 유형을 사용하여 채택할 수 있습니다. 변화는 또한 프로바이오틱스 혼합물의 집락 능력을 지원하고 궁극적으로 박테리아가 전신 순환에 미치는 잠재적인 영향을 돕는 데 사용될 수 있습니다.

시작하려면 배지를 오토클레이브한 다음 헤멘 밀리리터당 5마이크로그램과 메나디온 밀리리터당 1마이크로그램을 추가합니다. 9ml의 배지를 Hungate 튜브에 분배하고 고무 마개와 알루미늄 캡으로 튜브를 닫습니다. 그런 다음 90% 질소와 10% 이산화탄소의 혼합물로 튜브를 세척합니다.

주사기를 사용하여 1ml의 혐기성 매체를 회수하고 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 박테리아 종의 단일 군체를 선택하고 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 콜로니를 혐기성 변형 BHI로 옮기고 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다.

배양 후 여과된 멸균 PBS를 사용하여 배양액을 10에서 밀리리터당 5번째 세포로 희석합니다. 그런 다음 Cyber Green propidium iodide stain과 함께 유세포 분석을 사용하여 세포 수를 측정합니다. 마이크로바이옴 군집 구성과 생존력을 평가하는 것은 실험에서 편향을 피하는 데 필수적입니다.

플라스크에서 세포 배양 배지를 제거한 다음 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS 5ml를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 2ml의 트립신 EDTA 용액을 세포에 추가합니다. 플라스크를 부드럽게 움직여 용액을 분배합니다.

그런 다음 트립신 용액 1.5ml를 제거하고 플라스크를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 세포가 분리되었는지 현미경으로 확인한 후 플라스크에 5ml의 보충된 세포 배양 배지를 추가하여 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 균일한 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 즉시 50 μl의 세포 현탁액과 멸균 0.4% 트리판 블루 용액을 KCO2 세포의 경우 1:1 부피 대 부피 비율로 혼합하여 HT29MTX 동안 1:5 부피 대 부피로 합니다.

피펫팅으로 혼합하고 현탁액을 계수 챔버에 로드한 후 현미경으로 세포를 계수합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 KCO2 및 HT29MTX 세포 현탁액을 준비한 후 현탁액을 균질화하고 해당 부피의 KCO2 및 HT29MTX 세포를 보충된 세포 배양 배지가 있는 미리 채워진 멸균 용기에 추가합니다. 미리 준비된 챔버의 정점 쪽에서 사전 배양된 배지를 흡입합니다.

피펫팅으로 세포 현탁액을 부드럽게 혼합하고 1.5ml를 챔버 인서트의 정점 구획으로 옮기고 세포 현탁액을 1-3개의 웰마다 혼합하여 일정한 균질화를 보장합니다. 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 움직인 다음 오른쪽에서 왼쪽으로 움직여 웰에 세포를 고르게 퍼뜨립니다. 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 플레이트의 움직임을 반복합니다.

세포의 앉는 것은 우물에서 균일한 확산을 보장하기 위해 세포 현탁액의 지속적인 균질화로 수행되어야 합니다. ASA를 시작하기 전에 상피 장벽 무결성을 측정하려면 측정을 시작하기 전에 계층 장비가 완전히 충전되었는지 확인하십시오. 전원 공급 장치에서 계층 장비를 분리하고 플라스틱 오토클레이브 백으로 덮습니다.

가방에 구멍을 뚫어 전극을 미터의 입력 포트에 삽입합니다. 그런 다음 계층 장비를 흐름 캐비닛으로 옮기기 전에 가방에 70% 에탄올을 분사하십시오. 전극을 소독하려면 전극 팁을 70% 에탄올에 15분 동안 담그십시오.

팁을 15초 동안 자연 건조시킨 다음 세포 배양 배지를 사용하여 전극을 헹굽니다. 셀이 흐름 캐비닛 내부의 실온에 도달하도록 합니다. 미터가 충전기에서 분리되어 있는지 확인한 다음 모드 스위치를 옴으로 설정하고 전원 스위치를 켭니다.

짧은 팁은 인서트에 넣고 긴 팁은 웰 밖으로 나오도록 전극을 담궈 셀 저항을 측정합니다. 전극을 플레이트 인서트와 90도 각도로 유지하십시오. 구강 소화를 시뮬레이션하려면 3ml의 박테리아 군집을 50ml 멸균 튜브에 옮기고 3ml의 시뮬레이션된 타액 또는 SSF와 혼합합니다.

인간 타액 9A형의 알파-아밀라아제 75mg과 돼지 위 2형의 뮤신 리터당 2g을 추가합니다. 혼합물을 섭씨 37도 및 100RPM에서 2분 동안 배양합니다. DNA 추출 및 유세포 분석 정량화를 위해 2mL 시료를 수집합니다.

위 소화를 시뮬레이션하려면 3밀리리터의 박테리아에 4밀리리터의 시뮬레이션된 위액 또는 SGF를 추가합니다. 필요한 경우 1개의 몰 HCl을 사용하여 pH를 3으로 조정합니다. 샘플을 섭씨 37도 및 100RPM에서 2분 동안 배양합니다.

그런 다음 2밀리리터 샘플을 수집합니다. 소장 소화를 위해 박테리아에 4밀리리터의 모의 장액 또는 SIF를 첨가합니다. 필요한 경우 수산화나트륨을 사용하여 pH를 조정하십시오.

그런 다음 섭씨 37도 및 100RPM에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 그리고 2 밀리리터 샘플을 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 소장 소화의 세포 밀도를 세척하고 조정한 후 트랜스웰 시스템에서 정점 배지를 제거하고 박테리아 현탁액 1.5ml를 추가합니다.

일반적인 세포 배양 조건에서 2시간 동안 시스템을 공동 배양합니다. 배양 후에는 비디오 앞부분에서 설명한 것처럼 상피 장벽의 무결성을 평가하기 위해 계층 값을 측정합니다. 0.5 밀리리터의 10 밀리몰 n-아세틸시스테인과 HPSS를 첨가하여 HT29MTX에서 생성된 점액을 용해시키고 부착된 박테리아를 회수합니다.

교반하면서 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양합니다. 마이크로 원심분리기 튜브에서 NAC HPSS를 회수하고 1ml의 DPBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 단층 위에 0.5mL의 0.5%triton-x100을 첨가하고 피펫팅으로 세포를 파괴합니다.

그런 다음 1 분 동안 와류에서 액체를 빠르게 복구하십시오. 세제로 박테리아 세포가 손상되지 않도록 하려면 속도가 중요합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 샘플을 분석합니다.

여기에 보고된 바와 같이, 개별 균주에서 온전한 세포의 수는 합성 군집이 형성되기 전에 밀리리터당 약 10에서 8번째 세포였던 반면, 다종 소우주는 군집이 형성되는 동안 90% 이상의 생존 가능한 세포를 포함하고 있었습니다. 살아있는 사(live-dead) 정량화에 기초하여, 각 소화 단계 후에 박테리아 생존율은 위 통로 중 산성 pH와 소장 소화액에 포함된 바이오 염의 결과로 감소합니다. 위와 소장 소화의 가혹한 조건은 박테리아를 생존 가능한 세포로 전환할 수 있지만 성장하거나 분열하지 않는 살아있는 박테리아인 배양 가능한 세포에서는 그렇지 않을 수 있습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이, 점막 계면에서 회복된 생존 가능한 세포는 유세포 분석 플롯에서 파란색으로 표시됩니다. 그러나 이러한 점액 샘플이 도금될 때 성장이 관찰되지 않았습니다. 박테리아가 더 높은 생존율을 보이는 부분은 플레이트 카운팅에 의해 밝혀진 세포 파편입니다.

군집의 수는 가변적일 수 있지만 대사 활성 박테리아의 존재는 덜 희석된 샘플에서 발견됩니다. 이 개발 후, 이 기술은 영양유전체학 또는 약물미생물학(pharmacomicrobiomics) 분야의 연구자들에 의해 숙주를 미시적으로 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이 프로토콜에 따라 전사체 또는 대사 분석과 같은 다른 기술을 수행하여 그에 따라 성공적인 집락화 과정에서 기계론적 이해를 얻을 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 숙주 세포와 나머지 마이크로바이옴 사이의 혼선을 포함한 소화 과정을 대표하는 복잡한 체외 모델을 구축하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 병원성 박테리아와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 생물 안전 예방 조치를 고려하는 것이 중요하다는 것을 잊지 마십시오.