전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

이 방법은 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 검토하는 연구와 같은 신경 과학 분야뿐만 아니라 내분비학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다른 조직과 분리된 뇌에 대한 내분비 신호의 직접적인 영향을 조사할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 집게를 사용하여 플라스틱 배양 접시의 하단 중앙을 긁어 해부 후 유충 뇌의 복부 신경절을 쉽게 장착할 수 있도록 움푹 들어간 곳을 만듭니다.

이쑤시개로 움푹 들어간 곳의 양쪽에 초강력 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 접착제에 텅스텐 막대를 부착합니다. 그런 다음 퍼티와 같은 재사용 가능한 작은 접착제 조각을 사용하여 움푹 들어간 곳을 둘러싼 원형 벽을 만듭니다. 유충의 뇌를 해부하기 위해 알을 낳은 후 90-120시간 후에 유충을 채취하여 증류수로 최소 3회 세척하여 부착된 음식물 찌꺼기를 제거합니다.

다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 정사각형 1.5인치 시계 유리에 유충을 놓습니다. 집게를 사용하여 유충의 중간 부분을 부드럽게 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 입 고리를 부드럽게 잡고 당겨 뇌를 포함하는 유충의 앞부분을 신체의 나머지 부분과 분리합니다.

그런 다음 집게로 앞쪽 끝을 잡고 유충을 뒤집습니다. 뇌에 붙어 있는 상상의 디스크, 지방체, 고리선과 같은 외부 조직을 제거합니다. 뇌와 입 부분을 부드럽게 분리하십시오.

그런 다음 이미징 챔버에서 이전에 준비한 접착 링 내부에 200마이크로리터의 PBS를 적용합니다. PBS로 절개된 뇌를 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 빨아들여 이미징 챔버로 옮깁니다. 이미징 챔버에서 복부 신경절에서 뻗어 나온 근육 섬유를 잡고 텅스텐 와이어 아래의 움푹 들어간 곳에 뇌를 부드럽게 삽입합니다.

그런 다음 텅스텐 와이어를 약간 위로 당겨 뇌를 이미징을 위한 올바른 위치에 배치합니다. 칼슘 형광 이미지를 획득하려면 뇌 이식이 포함된 이미징 챔버를 현미경 아래에 놓습니다. PBS에 닿을 때까지 대물렌즈를 내리고 명시야 조명 아래에서 뇌를 배치하고 초점을 맞춥니다.

형광등으로 전환하고 GCaMP 성공 레이블이 지정된 셀의 초점을 조정합니다. 수냉식 모드에서 512 x 512 픽셀의 해상도에서 250ms/프레임으로 수집을 시작합니다. 그런 다음 노출 시간을 조정하여 CCD 카메라 다이내믹 레인지 내에서 형광 값을 얻되 16비트 이미지에서 1000개 이상의 임의 단위 이상을 얻습니다.

이미징 파라미터가 결정되면 펩타이드를 투여하기 1분 전에 이미지를 촬영하여 baseline 신호 강도를 검출합니다. 그런 다음, 준비된 펩타이드 용액 100마이크로리터를 애벌레 수조에 피펫팅하여 테스트 펩타이드를 직접 도포합니다. 몇 분 동안 GCaMP 성공 방출을 기록합니다.

데이터를 분석하려면 분석 소프트웨어를 열고 펩타이드 적용 전의 첫 번째 프레임을 참조 이미지로 사용합니다. 그런 다음 플러그인, TurboReg를 선택합니다. 직렬 이미지 파일을 Source(소스)로 선택하고 참조 이미지를 Target(대상)으로 선택합니다.

다음으로 Rigid Body와 Accurate를 각각 처리 방법과 품질을 확인합니다. 그런 다음 배치를 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다. 이미지 트레이에서 Analyze(분석), Tools(도구), ROI Manager(ROI 관리자)를 사용하여 여러 관심 영역을 선택합니다.

그런 다음 ROI Manager 창에서 More(추가), Multi Measure(다중 측정), OK(확인)를 클릭하여 픽셀 강도를 측정합니다. 이 실험에서 야생형 뇌는 CCHa2, Ghrelin, Nociceptin에 노출된 반면, CCHa2 수용체 돌연변이 뇌는 CCHa2에 노출되었습니다. 인슐린 생산 세포의 GCaMP6 신호는 250ms/프레임에서 컨포칼 현미경으로 검출되었으며, 다음은 선택한 시점의 정지 이미지입니다.

각 시점에서 기준선 신호 강도에 대한 ROI 강도의 변화 비율이 표시되었습니다. ROI는 동일한 초점면에서 감지된 세포체에 설정됩니다. 실선은 5개에서 10개 샘플의 평균을 나타내고, 점선은 평균의 표준 오차의 상한과 하한을 표시합니다.

음영 처리된 영역은 실험에서 신호의 변동을 나타냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 준비된다면 한 시간 안에 끝낼 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 뇌 샘플이 손상되지 않도록 신속하게 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차는 수용체 특이성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 유전학과 결합할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 시스템은 준비하기 쉽고 재사용할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 스크리닝과 같은 경우에 유용합니다.

개발 후 이 기술은 내분비학 및 신경과학 분야의 연구자들이 초파리의 뇌 기능을 제어하는 호르몬 네트워크를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.