Name: 전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: 학습하세요 Drosophila 뇌의 칼슘 이미징을 통해 내분비 신호에 대한 신경 반응을 시각화하는 방법을. 이 기술은 호르몬 네트워크와 수용체 특이성 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 지원 연구비에 의해 과학적 연구에 대 한 (15 K 07147, 17 K 07419) JSP에서 (히로시 종합, 히로코 사노), (하이), 이나 모리 재단 연구 그랜트와 공동 사용/연구 센터의 프로그램 발달 의학에 분자 발생 학, 유전학, (HS)에 쿠마 모토 대학 연구소. 우리 이미징 시스템을 사용 하 여 그들의 도움에 대 한 박사 아즈사 삿포로 야마다 다 이치 씨 감사 합니다.

1입니다. 애벌레 뇌 Explants의 준비
<ol><li>이미징 챔버를 확인 합니다. 참고: 안정적인 녹음 두뇌 explants 곁 수 있어야 합니다. 여기, 낮은-비용, 손으로 만든 이미징 챔버는 Ca2 + 이미징 시스템에 사용 됩니다.<ol>
<li>집게를 사용 하 여 쉽게 장착 (1.3, 그림 1단계)를 만드는 애벌레 두뇌의 복 부 신경 절에 대 한 덴트를 만드는 플라스틱 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 하단 중앙 스크래치.</li>
		<li>이쑤시개와 덴트의 양쪽에 superglue의 작은 방울을 놓고 접착제를 텅스텐 막대 (0.125 m m, 6 ~ 7 m m 길이)를 연결 합니다.</li>
		<li>퍼 티 같이 재사용할 수 있는 접착제의 작은 조각을 사용 하 여, 확인 (10 m m 직경에서 및 높이 3 m m) 원형 벽 주변 덴트 (그림 1). 참고: 벽 내부의 공간 나중으로 채워질 것 이다 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 0.14 M NaCl, KCl, 0.0027 M 0.01 M 포43-, 25 ℃에서 pH 7.4 ± 0.05).</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 준비 참고: 칼슘 이미징, 칼슘 표시기, GCaMP6s, 표현 된다 세포 유형의 관심, 일반적으로 조직의 특정 GAL4 UAS-GCaMP6s의 조합을 사용 하 여 이루어집니다. 신호 후보 수용 체를 통해 중재 된다 되도록 GCaMP6s 수용 체에 결함이 있는 돌연변이 또한 표현 된다.<ol>
<li>다른 genotypes 야생 타입 등 돌연변이 대 한 실험 비교 필요한 경우 GCaMP6 식 수준 변화와 발달 단계에 따른 생리 적 차이 피하기 위해 일치 시험 애벌레 나이.</li>
		<li>포함 하는 음식의 표면에 계란-누워 있도록 8 h에 대 한 표준 비행 거리 음식 문화 유리병에 부모의 파리 (30 파리 각 섹스에 대 한)을 유지. 25 ° C와 60-70% 상대 습도에서 12 h 빛 어두운 주기에서 질량에는 문화 애벌레</li>
	</ol>
</li>
	<li>애벌레는 두뇌의 해 부<ol>
<li>(AEL) 누워 계란 후 90-120 h, 애벌레를 수집 하 고 그들에 게 부착 식품 이물질 제거를 증류수와 적어도 3 번을 씻어.</li>
		<li>장소는 1.5 인치 사각 시계 유리에 유 충은 얼음 차가운 PBS 가득합니다. 참고: 다음 두 단계 해 현미경이 시계 유리에 수행 됩니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 부드럽게 유 충의 중간 부분을 잡아. 다른 집게를 사용 하 여 입 후크를 유 충을 포함 하는 시체의 나머지 부분에서 뇌의 앞쪽 부분을 부드럽게 입 고리를 당겨. 참고: 또는, 수술가 위 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>겸 자에 의해 앞쪽 끝을 누른 유 충을 안으로 밖으로 설정 합니다. 외부 조직 imaginal 디스크, 지방 기관, 링 선 등 뇌에 연결을 제거 합니다. 부드럽게는 mouthparts에서 뇌를 분리 합니다.</li>
		<li>PBS의 200 µ L 이미징 챔버에 퍼 티 같은 재사용 접착제의 링의 안쪽에 적용 됩니다. 부드럽게 파스퇴르 피 펫에 PBS 가진 해 부 뇌를 빨 아 하 고 이미징 챔버로 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두뇌 이미징 챔버로 설정<ol>
<li>집게를 사용 하 여 복 부 신경에서 연장 하는 근육 섬유를 잡아. 텅스텐 와이어 아래 덴트에 두뇌를 부드럽게 삽입 합니다.</li>
		<li>다른 집게를 사용 하 여, 풀 텅스텐 와이어를 약간 장소 두뇌 이미징 (그림 1)에 대 한 올바른 위치에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Ca2 + 형광 이미지 수집
참고: PBS에 몰입 하는 뇌 explants는 몇 군데 물 침수 렌즈 X 20을 갖춘 형광 현미경을 사용 하 여 (없음 = 0.5). PBS는 뇌에서 세포를 활성화 하지 않습니다. Z 축 이미지, 필요한 경우 활성화 압 전 렌즈 발동기로 대물 렌즈 마운트입니다. 회전 디스크 confocal 머리는 시간 분해능을 향상 하는 데 사용 됩니다. 낮은 조명 촬영에 대 한 전 하 결합 소자 카메라 멀티 전자 현미경에 장착 됩니다. GCaMP6s 형광 이미징 (여기/방출: 488/509 nm) 여기 dichroic 빔 스플리터와 방출 필터 488 nm 레이저를 요구 한다 (예., 528 ± 38 nm 대역 대역 통과 필터).
<ol><li>포함 하는 현미경 뇌 explant 이미징 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>그것은 PBS를 건드리면 때까지 대물 렌즈를 낮춥니다. 필드 밝은 조명 아래 뇌 놓고 초점으로 그것을. 형광 빛을 전환 하 고 GCaMP6s 라는 세포에 초점을 조정 합니다. 참고:는 GCaMP6s의 기저 녹색 형광 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>250 ms에서 수집을 시작/냉각 모드 적절 한 수집 소프트웨어를 사용 하 여 512 × 512 픽셀의 해상도에서 프레임 (예., µManager). 16 비트 이미지 (동적 범위 0-65535) CCD 카메라의 동적 범위에서 형광 값을 1000 (임의의 단위) 보다 낮게 하지 노출 시간을 조정 합니다. 참고: 낮은 노출 시간에 GCaMP6s의 사진-표백을 최소화 하기 위해 사용 해야 합니다. 그것은 GCaMP6의 식 수준 및 탐지 시스템의 감도에 따라 노출 시간 각 실험에 최적화 되어야 합니다. 그것은 사용 하 여 우리의 실험에서 100 ms dilp2 > GCaMP6s. Z-섹션 주어진된 이미징 깊이 대 한 필요한 경우, 여러 z 섹션 이미지 노출 시간과 프레임 간격에 따라 취득 수 있습니다. 카메라 공간 해상도 충분 한 경우, 노출 시간을 줄이기 위해 범주화 크기 (하나의 디지털 픽셀으로 범주화 하는 칩에 레지스터의 수)를 증가 한다.</li>
	<li>이미지 매개 변수를 확인 하는 펩 티 드 관리 기준 신호 강도 (F0)를 검색 하기 전에 1 분 동안 이미지 걸릴.</li>
	<li>적용 테스트 펩 티 드. 이 위해, PBS에서 펩 티 드 솔루션의 100 µ L를 녹이 고 직접 최적 농도를 애벌레 욕조에 플라스틱. 참고: 펩 티 드 솔루션 천천히 주입 되어야 한다 (예를 들어, 흐름 속도 20 µ L/s)는 피 펫을 사용 하 여 목욕 솔루션으로. 없는 합성 펩 티 드 PBS에 녹아 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록 합니다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
참고: 영상 데이터는 오프 라인으로 ImageJ로 분석 된다. 시간 경과 화상 진 찰 동안 pipetting 이동 애벌레 뇌를 발생 합니다. 따라서, 직렬 이미지의 위치 착오 분석 하기 전에 수정 해야 합니다. 수정 된 ImageJ 플러그인, TurboReg를 사용 하 여 다음과 같이 수행할 수 있습니다.
<ol><li>분석 소프트웨어를 열고 (펩 티 드 응용 프로그램) 전에 첫 번째 프레임 참조 이미지를 사용 합니다.</li>
	<li>플러그인을 선택 | 등록 | TurboReg.</li>
	<li>원본 으로 직렬 이미지 파일 및 대상으로 참조 이미지를 선택 합니다.</li>
	<li>체크 리 짓 바디 (병렬 변위 및 이미지의 회전)와 정확한 ("빠른"는 빠른 분석 하지만 거친 대신) 처리 방법 및 품질, 각각.</li>
	<li>일괄 이미지 처리 시작을 클릭 합니다.</li>
	<li>분석을 사용 하 여 관심사 (ROIs)의 여러 영역을 선택 | 도구 | 투자 수익 관리자 ImageJ에.</li>
	<li>더 많은 를 클릭 하 여 픽셀 강도 측정 | 다중 측정 | 확인 ROI 관리자 창에서.</li>
	<li>Δ/F0 를 계산 = (F-F0) /F0, 어디 F 투자 수익 강도, 자극의 시간에서 이며 F0 특정 실험 이벤트 직전 시간대에 강도 (예를 들어, 30 프레임 앞에 자극 증상)입니다.</li>
	<li>반복 실험 여러 뇌 샘플을 사용 하 여, 평균 및 각 시간 지점에서 평균 (SEM)의 표준 오차를 통계 처리를 수행 합니다.</li>
</ol>

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<li>Cao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+optical+electrophysiology+in+intact+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits.</a> Cell. 154 (4), 904-913 (2013).</li>
<li>Nikolaev, V. O., Bunemann, M., Hein, L., Hannawacker, A., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+single+chain+cAMP+sensors+for+receptor-induced+signal+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel single chain cAMP sensors for receptor-induced signal propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37215-37218 (2004).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+pHluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophysical Journal. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of Neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

캘리포니아2 + 이미징 방법을 여기에 설명 된 뇌에서 호르몬의 기능을 테스트 하기 위한 유용한 시스템입니다. Vivo에서 두뇌 다양 일 분 비 장기에서 호르몬을 받습니다. 더하여, 두뇌는 끊임없이 자연 신경 활성화를 일으키는 원인이 되는 감각 정보를 오름차순 인식. 이 비보 전 시스템 같은 노이즈를 제거 하 고 vivo에서 영상 보다 더 나은 신호/잡음 비율을 생성 합니다. 이 시스템에 단독으로 또는 조합에서 분자를 테스트할 수 있습니다. 펩 티 드 호르몬 이외에 천연 또는 합성 화합물을 포함 하 여 모든 수용 성 분자는 두뇌 explant에 적용할 수 있습니다.
캘리포니아2 + 이미징, 뇌 explants 곁에 있이 필요가 있다. 이 위해 젤 매트릭스 낮은 녹는 포인트 agarose 또는 섬유 소 되었습니다 사용 이전16,<sup...

기관 대 기관 통신 환경 변화에 대처 하기 위해 항상성 유지 하기 위한 진화론 보존된 전략 이다. 인간, 순환으로 내 분 비 동맥에서 호르몬 arereleased의 다양 한. 이러한 호르몬의 많은 신진 대사 과정 및1,2먹이 등 기본적인 동작을 조절 하는 두뇌의 시상 하 부 대상. 많은 호르몬 포유류 모델을 사용 하 여 발견 되었습니다. 그러나, 그들의 행동, 특히 있는 그들이 참여, interorgan 네트워크의 메커니즘 크게 불분명 남아 있습니다.
초파리 melanogaster 기관 대 기관 통신 공부에 대 한 유용한 모델로 떠오르고 있다. 곤충, 많은 생리 적인 과정은 호르몬에 의해 제어 됩니다. 초기 연구 성장과 변형에 초점을 맞추고 큰 곤충을 사용. 이 연구에서 제거 또는 특정 장기의 이식 예측 간 장기 신호 분자;의 존재 나중에, 젊은 호르몬 (JH), Prothoracicotropic 호르몬 (PTTH), 및 Ecdysone 화학적 정화3,,45했다. 세포 신호 펩 티 드의 큰 가족 곤충 라이프 사이클6,7동안 다양 한 생리 적 행사에 참여 하 생각 된다. 이러한 펩 티이 드의 대부분 비록 특정 GPCRs 처음 전통적인 방법을 사용 하 여 식별 하기 어려운 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs)에서 작동 합니다. 초파리 전체 게놈 순서8 의 간행물이 이었다 초파리 생리 활성 펩 티 드는 다른 곤충에서 발견 된에 그들의 상 동에 따라 식별을 사용 하는 획기적인. 또한, 여러 가지 펩 티 드에 대 한 수용 체는 GPCRs GPCR 리간드 바인딩 분석 셀-문화-기반을 사용 하 여 게놈에 예측에서 확인 되었다. 다음, 식 분석 예측 기관 대 기관 경로 이러한 펩 티 드와 수용 체에 의해 elicited. 특히, 상 상속 펩 티 드 수용 체의 많은 두뇌, 두뇌 펩 티 드 호르몬9의 주요 목표는 제안 표현 됩니다. 또한, 초파리 에서 유전자 고급 도구 펩 티 드 GPCR 조합의 생리 적 역할의 id에 공헌 했다. 예를 들어, GAL4 및 LexA 기반 이진 transcriptional 시스템 활성화 유전자 최저 또는 overexpression 공간 및 일시적으로 제어 방식. GAL4, 효 모에서 확인 된 녹음 방송 요인 특정 cis 규제 시퀀스 라는 상류 활성화 순서 (UAS)에 바인딩합니다. GAL4/UAS 시스템에서 드라이버 라인 제공 조직 관련 또는 단계 특정 GAL4 표현과 응답자 선 관심 또는 드라이브 shRNA 식 구조 유전자의 상류 UAS 운반. LexA/LexAop 시스템 비슷한 메커니즘을 기반으로 합니다. 조직의 특정 펩 티 드-최저와 조직 특정 GPCR 최저 동물의 phenotypic 분석 펩 티 드 GPCR 신호 모드와 행동의 사이트에 대 한 정보를 알아낼 수 있습니다. 그러나, 유전자 데이터에 의해서만 도달 될 수 있는 결론 제한 됩니다. 다른 한편으로, 특정 펩 티 드 호르몬의 상 상속 대상 조직 또는 세포 유형으로 좁혀입니다, 일단 비보 전 칼슘 기관 explants 이미징 펩 티 드 GPCR 신호에 의해 중재 기관 대 기관 통신 명료 하 사용할 수 있습니다. Gq 결합 GPCR의 활성화, 세포내 캘리포니아2 + 농도10응급실 캘리포니아2 + 의 출시로 인해 증가 된다. 뇌, 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을 올린다. 이러한 Ca2 + 증가 칼슘 센서, GCaMP, 캘리포니아2 + 형광 방출11결과의 구조적 변화를 겪 습에 의해 감지할 수 있습니다.
이 문서에서는, 초파리 뇌를 사용 하 여 이미징 방법 explants 칼슘 설명 되어 있습니다. 특정 뉴런을 활성화 하는 펩 티 드의 능력을 테스트 하기 위해 테스트 펩 티 드 GCaMP 표현 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 confocal 현미경 검사 법에 의해 모니터링 됩니다. GPCR의 참여는 GPCR 부족 돌연변이 두뇌를 사용 하 여 동일한 분석 결과 수행 하 여 다음 확인 된다. 이미징 및 유전학의이 조합은 펩 티 드에 의해 기관 대 기관 통신에 대 한 정확한 정보를 제공 합니다-GPCRs. 가능 수정 및이 프로토콜의 응용 프로그램 또한 토론 된다.

<table><tbody><tr><td>텅스텐 막대</td><td>AM 시스템, Sequim, WA, USA</td><td>717000</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik, Paris, France</td><td>3049100</td><td>퍼티와 같은 재사용 가능한 접착제</td></tr><tr><td>시계 유리, 사각형, 1 5/8 in</td><td>Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, USA</td><td>742300</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan</td><td>T900</td><td>인산염 완충염</td></tr><tr><td>CCHa2</td><td>SCRUM Inc., Tokyo, Japan</td><td></td><td>Custum-synthesized peptide</td></tr><tr><td>Ghrerin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4372-s</td><td></td></tr><tr><td>Nociceptin</td><td>Peptide institute Inc., Osaka, Japan</td><td>4313-V</td><td></td></tr><tr><td>Axio Imager A2</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>Axio Imager A2</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>대물렌즈 W N-Achroplan 20x/0.5 M27</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, Germany</td><td>420957-9900-000</td><td>침수 대물 렌즈</td></tr><tr><td>P-725 PIFOC 대물 스캐너 장거리 이동 범위</td><td>Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>압전 활성화 렌즈 무버</td></tr><tr><td>컨포칼 스캐너 유닛 CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japan</td><td>CSU-W1</td><td>스피닝 디스크 컨포칼 헤드</td></tr><tr><td>ImagEM C9100-13</td><td>Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan</td><td>C9100-13</td><td>EM-CCD 카메라</td></tr><tr><td>OBIS 488 nm LS 60 mW</td><td>Coherent, Santa Clara, CA, USA</td><td>1178770</td><td>488-nm 레이저</td></tr><tr><td>488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5</td><td>dichroic beam splitter</td></tr><tr><td>528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter</td><td>Semrock, Rochester, NY, USA</td><td>FF01-528/ 38-25</td><td>방출 필터</td></tr><tr><td>&마이크로; Open</td><td>Imaging, Inc.</td> 매니저<td>해당 없음</td><td>https://micro-manager.org</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>미국 국립보건원(National Institutes of Health)</td><td>해당 없음</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>TurboReg</td><td>Philippe Th&eacute; venaz, Biomediccal Imaging Group, 스위스 로잔 연방공과대학</td><td>N/A</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr></tbody></table>

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

내 분 비 신호에 의해 기관 대 기관 통신 예를 들어 뇌에 주변에서은 항상성 유지 하기 위한 필수. 내 분 비 연구 모델 동물로, 초파리 melanogaster, 어떤은 정교한 유전자 도구 및 게놈 정보, 점점 사용 되고있다. 이 문서에는 초파리 뇌 explants의 칼슘 이미징 하는 방법을 설명합니다. 이 메서드는 직접 뇌에 호르몬의 신호 감지 수 있습니다. 그것은 잘 알려진 많은 펩 티 드 호르몬 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs), 누구의 활성화 세포내 캘리포니아2 +농도 있는 증가 일으키는 통해 행동. 신경 활성화는 또한 세포내 캘리포니아2 + 레벨을, 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 바인딩과 그물 (ER)에 저장 된 자료를 올린다. 칼슘 센서, GCaMP, 이러한 Ca2 + 변화를 모니터링할 수 있습니다. 이 방법에서는, GCaMP의, 신경에 표현 하 고 GCaMP을 표현 하는 애벌레 뇌를 해 부하 고 교양 비보 전. 테스트 펩 티 드 다음 뇌 explant에 적용 되 고 형광 변화 GCaMP에 장착 된 CCD 카메라 회전 디스크 confocal 현미경을 사용 하 여 검색. 이 메서드를 사용 하 여 모든 수용 성 분자는 시험 될 수 있다, 그리고 신경 활성화와 관련 된 다양 한 셀룰러 이벤트 적절 한 형광 표시기를 사용 하 여 이미지 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 수정 하 여 이미지 다른 초파리 장기 나 다른 동물의 장기를이 메서드를 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용 하는 펩 티 드 호르몬, CCHa2에 의해 뇌 인슐린 생산 세포 (IPCs)의 정품 인증 시험 되었다. 야생-타입 두뇌의 IPCs GCaMP6s로 표시 했다 dilp2-GAL412 (박사 Rulifson 선물), UAS-GCaMP6s13 (김 박사 선물)의 조합을 사용 하 여. 애벌레 두뇌 explants 합성 CCHa2 펩 티 드로 치료 했다 그리고 GCaMP6s에서 형광 실시간으로 기록 했다. 이 실험에서 이미지는 단일 초점 평면에서 얻은 했다. 각 IPC 클러스터 포함 약 14 셀14, 그리고 6 셀에 3에서 신호 감지 했다. GCaMP6s 신호 강도 CCHa2 행정 (그림 2영화 1) 극적으로 증가 되었...

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

이 방법은 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 검토하는 연구와 같은 신경 과학 분야뿐만 아니라 내분비학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 다른 조직과 분리된 뇌에 대한 내분비 신호의 직접적인 영향을 조사할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 집게를 사용하여 플라스틱 배양 접시의 하단 중앙을 긁어 해부 후 유충 뇌의 복부 신경절을 쉽게 장착할 수 있도록 움푹 들어간 곳을 만듭니다.이쑤시개로 움푹 들어간 곳의 양쪽에 초강력 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 접착제에 텅스텐 막대를 부착합니다. 그런 다음 퍼티와 같은 재사용 가능한 작은 접착제 조각을 사용하여 움푹 들어간 곳을 둘러싼 원형 벽을 만듭니다. 유충의 뇌를 해부하기 위해 알을 낳은 후 90-120시간 후에 유충을 채취하여 증류수로 최소 3회 세척하여 부착된 음식물 찌꺼기를 제거합니다.다음으로, 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 정사각형 1.5인치 시계 유리에 유충을 놓습니다. 집게를 사용하여 유충의 중간 부분을 부드럽게 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 입 고리를 부드럽게 잡고 당겨 뇌를 포함하는 유충의 앞부분을 신체의 나머지 부분과 분리합니다.그런 다음 집게로 앞쪽 끝을 잡고 유충을 뒤집습니다. 뇌에 붙어 있는 상상의 디스크, 지방체, 고리선과 같은 외부 조직을 제거합니다. 뇌와 입 부분을 부드럽게 분리하십시오.그런 다음 이미징 챔버에서 이전에 준비한 접착 링 내부에 200마이크로리터의 PBS를 적용합니다. PBS로 절개된 뇌를 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 빨아들여 이미징 챔버로 옮깁니다. 이미징 챔버에서 복부 신경절에서 뻗어 나온 근육 섬유를 잡고 텅스텐 와이어 아래의 움푹 들어간 곳에 뇌를 부드럽게 삽입합니다.그런 다음 텅스텐 와이어를 약간 위로 당겨 뇌를 이미징을 위한 올바른 위치에 배치합니다. 칼슘 형광 이미지를 획득하려면 뇌 이식이 포함된 이미징 챔버를 현미경 아래에 놓습니다. PBS에 닿을 때까지 대물렌즈를 내리고 명시야 조명 아래에서 뇌를 배치하고 초점을 맞춥니다.형광등으로 전환하고 GCaMP 성공 레이블이 지정된 셀의 초점을 조정합니다. 수냉식 모드에서 512 x 512 픽셀의 해상도에서 250ms/프레임으로 수집을 시작합니다. 그런 다음 노출 시간을 조정하여 CCD 카메라 다이내믹 레인지 내에서 형광 값을 얻되 16비트 이미지에서 1000개 이상의 임의 단위 이상을 얻습니다.이미징 파라미터가 결정되면 펩타이드를 투여하기 1분 전에 이미지를 촬영하여 baseline 신호 강도를 검출합니다. 그런 다음, 준비된 펩타이드 용액 100마이크로리터를 애벌레 수조에 피펫팅하여 테스트 펩타이드를 직접 도포합니다. 몇 분 동안 GCaMP 성공 방출을 기록합니다.데이터를 분석하려면 분석 소프트웨어를 열고 펩타이드 적용 전의 첫 번째 프레임을 참조 이미지로 사용합니다. 그런 다음 플러그인, TurboReg를 선택합니다. 직렬 이미지 파일을 Source(소스)로 선택하고 참조 이미지를 Target(대상)으로 선택합니다.다음으로 Rigid Body와 Accurate를 각각 처리 방법과 품질을 확인합니다. 그런 다음 배치를 클릭하여 이미지 처리를 시작합니다. 이미지 트레이에서 Analyze(분석), Tools(도구), ROI Manager(ROI 관리자)를 사용하여 여러 관심 영역을 선택합니다.그런 다음 ROI Manager 창에서 More(추가), Multi Measure(다중 측정), OK(확인)를 클릭하여 픽셀 강도를 측정합니다. 이 실험에서 야생형 뇌는 CCHa2, Ghrelin, Nociceptin에 노출된 반면, CCHa2 수용체 돌연변이 뇌는 CCHa2에 노출되었습니다. 인슐린 생산 세포의 GCaMP6 신호는 250ms/프레임에서 컨포칼 현미경으로 검출되었으며, 다음은 선택한 시점의 정지 이미지입니다.각 시점에서 기준선 신호 강도에 대한 ROI 강도의 변화 비율이 표시되었습니다. ROI는 동일한 초점면에서 감지된 세포체에 설정됩니다. 실선은 5개에서 10개 샘플의 평균을 나타내고, 점선은 평균의 표준 오차의 상한과 하한을 표시합니다.음영 처리된 영역은 실험에서 신호의 변동을 나타냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 제대로 준비된다면 한 시간 안에 끝낼 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 뇌 샘플이 손상되지 않도록 신속하게 준비해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 절차는 수용체 특이성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 유전학과 결합할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 시스템은 준비하기 쉽고 재사용할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 스크리닝과 같은 경우에 유용합니다.개발 후 이 기술은 내분비학 및 신경과학 분야의 연구자들이 초파리의 뇌 기능을 제어하는 호르몬 네트워크를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 생활 antennal 엽에서 냄새 evoked 칼슘 반응을 측정하고 분석하기 위해 설립 기법을...

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

이 비디오는 GCaMP를 사용하여 초파리 뉴런의 생체 내 칼슘 이미징을 설명합니다. 주요 프로토콜 클립은 후각 조절 실험 중 버섯체 뉴런에서 GCaMP 형광의 변화를 기록하는 방법을 보여줍니다.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

이 비디오는 파리에서 시냅스적으로 국소화된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징 방법을 보여줍니다. 현미경 검사를 위해 파리를 준비하고, 후각 조절을 수행하고, 냄새로 인한 칼슘 유입을 시각화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

초파리 뇌 구조에서 칼슘 과도 현상을 연구하기 위한 생물 발광 이미징

초파리의 앞다리와 주둥이는 미각 감각 뉴런의 풍부한 레퍼토리를 포함하고 있습니다. 여기에서는 칼슘 이미징을 사용하여 미각 페로몬의 외인성 적용 시 살아있는 파리의 앞다리와 주둥이에 있는 감각 뉴런의 생리적 반응을 측정하는 방법을 제시합니다.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.

에서 이미징 칼슘<em&gt; 초파리</em&gt; 계란 활성화에

여기에서 우리는 Drosophila 학습 및 기억의 맥락에서 pre-및/또는 후성 칼슘이 구상될 수 있는 프로토콜을 제시합니다. 합성 국소화 된 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징은 이러한 유형의 연관 학습의 기초가되는 시냅스 가소성이 결정될 수 있도록 고전적인 후각 조절 패러다임과 결합됩니다.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

우리는 고정을 위해 국소 조직 접착제를 사용하여 초파리 유충 후각 뉴런에 대한 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 안정성을 향상시켜 신뢰할 수 있는 생체 내 및 생체 외 실험을 용이하게 합니다. 맞춤형 R 스크립트는 칼슘 신호를 분석하여 상세한 신경생리학적 연구를 위한 효율적인 플랫폼을 제공합니다.

3령 초파리 멜라노가스터 유충에서 후각 회로 뉴런의 생체 내 및 생체 외 칼슘 이미징

학습하세요 Drosophila 뇌의 칼슘 이미징을 통해 내분비 신호에 대한 신경 반응을 시각화하는 방법을. 이 기술은 호르몬 네트워크와 수용체 특이성 연구에 활용됩니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

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