드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

이 방법은 미세 유체 시스템 및 분자 생명 공학 분야의 결합 기술(예: 미세 유체 장치 및 비대칭 PCR 방법)의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 고균화 된 미세 구체의 효율적인 생성과 추가 분리 단계없이 단일 좌초 DNA의 생산입니다. 이 기술의 의미는 다양한 질병의 진단 또는 치료로 확장됩니다.

단일 가닥 DNA의 생성은 ap-ta-mo-sis assays의 핵심이기 때문에 검출 및 치료에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 MEMS의 3차원 미세 유체 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 질병의 검출 및 치료에 사용되는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 제대로 역 방향으로 흐르는에서 유체를 제어하는 데 어려움을 겪을 것이다.

이 방법의 시각적 데모는 유동 초점 형상및 생성된 마이크로스피어의 응고에서 마이크로스피어 형성을 관찰하는 데 매우 중요합니다. 첫째, 염기 폴리머와 촉매를 10 대 1 비율로 혼합하여 액체 PDMS 프리 폴리머 20 밀리리터를 준비합니다. 액체 PDMS의 10 밀리리터를 미세 유체 네트워크의 상부에 대한 실리콘 웨이퍼에 준비된 SU-8 금형에 붓습니다.

바닥 플랫 부품의 경우 금형 구조없이 실리콘 웨이퍼에 동일한 양의 액체 PDMS를 붓습니다. 액체 PDMS 프리 폴리머로 코팅 된 두 개의 실리콘 웨이퍼를 예열 된 핫 플레이트에 놓고 섭씨 75도에서 30 분 동안 치료하십시오. 이에 따라 SU-8 금형에서 경화 된 PDMS 층을 수동으로 벗깁니다.

1.5mm 직경의 둥근 구멍 펀칭 도구를 복제된 미세 유체 네트워크의 오일 포트에 정렬하여 미크론 스케일 흐름 채널을 거시적 유체 샘플과 상호 결합합니다. 그런 다음 수동으로 관통 구멍을 펀치. 펀칭 공정을 세 번 반복한 후, 샘플당 몇 초 동안 핸드헬드 코로나 치료기를 사용하여 상하 PDMS 층 모두에서 친수성 표면 처리를 수행합니다.

PDMS-PDMS 접합 공정을 위해 핫플레이트에서 플라즈마 처리된 PDMS 층 2개와 열 이 90도에서 30분간 가열합니다. 소용돌이와 간략하게 원심분리기 표준 단일 좌초 DNA 아크라디트 라벨 프로브와 19 대 1 아크릴아미드 비스 스톡 솔루션. 40%의 아크릴아미드 비스 용액 25마이크로리터, 단일 가닥 DNA 10마이크로리터, 5X TBE 버퍼 10마이크로리터, 5마이크로리터의 물을 혼합하여 솔루션을 준비합니다.

20% 암모늄 아황산염의 50 마이크로리터와 함께 2개의 솔루션을 준비하십시오. 솔루션 1개와 솔루션 2개로 개별적으로 채워진 두 개의 주사기를 개별적으로 준비하고 주사기 펌프에 장착하여 솔루션 흐름을 미세유체 플랫폼으로 유입시 소개합니다. 마이크로피어의 표면 응고를 위해 0.4%TEMED와 혼합된 미네랄 오일을 준비합니다.

미네랄 오일로 유리 병을 채운 후 유리 병의 캡에 공압 및 유체 포트에 두 개의 튜브를 미세 유체 저장소로 삽입합니다. 마이크로 유체 장치에서 유리 병과 오일 포트 사이에 튜브를 연결합니다. 주사기 펌프에서 두 가지 솔루션을 공급하기 위해 마이크로 유체 장치의 두 솔루션 포트에 튜브를 연결합니다.

그런 다음 생성된 마이크로피어를 비커로 전송하기 위해 튜브를 콘센트 포트에 삽입합니다. 다음으로 주사기 펌프의 유량을 시간당 0.4 ~0.7 밀리리터로 설정합니다. 레귤레이터를 사용하여 압축기의 압축 공기 압력을 조정합니다.

핫플레이트에 마그네틱 스터드 바가 있는 유리 비커를 놓고 회전 속도를 설정합니다. 주사기 펌프를 작동하고 전자기 밸브의 온-오프 제어를 사용하여 외부 압축기에서 발생하는 압축 공기를 유리 병에 공급합니다. 디지털 현미경을 사용하여, 유리 비커에서 생성된 마이크로스피어의 흐름 중심 형상 및 응고에서 마이크로스피어의 형성을 관찰한다.

마이크로스피어의 형성을 관찰하는 것은 미세구와 미세 유체 시스템을 생산하는 이 연구에서 중요한 과정이기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이에 따라, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 마이크로스피어의 100마이크로리터를 이송한다. 그런 다음 부드러운 원심 분리 및 파이펫팅을 통해 상체를 제거합니다.

100 마이크로몰러의 최종 농도를 달성하기 위해 1X TE 버퍼의 100 마이크로 리터를 사용하여 무료 프로브 변형 cyanine-3을 다시 중단합니다. 다음으로, AP 중합 마이크로스피어를 함유한 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 보완 프로브 변형 cyanine-310 마이크로몰어를 추가합니다. 튜브를 몇 번 탭하여 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 혼합하고 배양합니다.

인큐베이션을 따라, 상체를 폐기하고 파이펫팅을 통해 잔류 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 TE 버퍼 500 마이크로리터로 세 번 헹구습니다. 75x50mm 유리 슬라이드에 마이크로스피어를 놓고 이미징 전에 알루미늄 호일로 덮습니다.

40배율을 가진 광 현미경을 사용하여 현미경 계수를 통해 약 25개의 미세구를 얻습니다. 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 시약을 결합합니다. 샘플을 열순환기에 넣고 적절한 조건하에서 비대칭 PCR을 시작합니다.

비대칭 PCR 후 상체의 컬렉션은 마이크로 스피어와 단일 가닥 DNA를 생성하기위한 주요 과정이기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 증폭 후 각 샘플에 6X 로딩 버퍼의 8개의 마이크로리터를 추가합니다. 각 샘플의 15 마이크로리터를 2%의 아가로즈 젤로 로드합니다.

그런 다음 1X TAE 버퍼에서 35분 동안 100볼트에서 전기전도를 수행합니다. 혼성 마이크로스피어를 홀더에 놓고 공초점 현미경의 단계에 홀더를 부착합니다. 레이저를 선택하고 레이저 제어에서 켭니다.

현미경 제어에서 객관적인 렌즈를 선택합니다. 그런 다음 구성 컨트롤에서 시아닌-3 및 채널에 대해 원하는 필터를 선택합니다. 마지막으로 실험을 시작하고 샘플을 관찰합니다.

제조 된 폴리머 액적 기반 의 미세 유체 플랫폼은 두 개의 PDMS 층으로 구성됩니다. 3종의 미세유체 채널 네트워크는 유동에 초점을 맞춘 형상, 1및 2개의 혼합 용 용하채널을 생성하는 마이크로스피어, 마이크로스피어 응고를 위한 중합 채널 을 생성하는 데 사용됩니다. 광물 오일의 지속적인 흐름을 위한 실험실 기반 공압 제어 시스템과 용액 흐름을 위한 두 개의 주사기 펌프가 미세유체 플랫폼에서 마이크로스피어를 생성하는 데 사용되었습니다.

마이크로스피어가 5프라임 아크라디트 DNA 프로브로 올바르게 기능화되면, 이러한 형광 이미지에 도시된 하이브리드화 실험 중에 표면에 형광 활성이 보장되어야 한다. 중합체화가 올바르게 발생하지 않으면 광학 마이크로스피어 이미지는 마이크로스피어 내부의 내부 오염을 나타낼 것입니다. DNA 올리고 프로브로 마이크로스피어의 3D 표면을 조작하는 것은 훨씬 더 빠른 과정이며, 온-플로우 마이크로스피어 합성 플랫폼은 단일 좌초 된 DNA 증폭 및 정화를위한 도구를 제공 할 수 있습니다.

처음 공합된 5프라임 AP는 보완적인 템플릿으로 어닐링한 후 DNA 중합화를 위한 3가지 프라임 하이드록실 엔드를 제공한다. 이중 좌초 된 DNA 오염 물질은 비대칭 PCR 실험에서 관찰되었다. 마이크로스피어 PCR로부터 축적된 결과 단일 좌초 DNA는 겔 전기전도 분석을 통해 합성 크기 마커와 비교하여 입증되었다.

이 절차를 시도하는 동안 이 메서드에서 증폭 주기, 어닐링 온도 및 프로브 시퀀스를 획득하는 데 일반적으로 필요한 프로토콜 및 조정에 대한 사전 지식이 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 분자 생명 공학 및 생명 의학에 있는 2개의 지구를 연결하는 진단 그리고 치료의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 아크릴아미드 솔루션으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험실 코트를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.