Name: 드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 배우세요 드롭릿 기반 미세유체 플랫폼에서 폴리아크릴아미드 미세구체를 이용한 마이크로스피어 PCR 증폭 기법으로 이중가닥 DNA 분리 없이 단일가닥 DNA를 효율적으로 생산하는 방법을. 이 기술은 질병 진단 및 치료에 활용됩니다.

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이 연구 "협동 연구 프로그램 농업 과학 기술 개발 (프로젝트 번호에 대 한 권리는 프로젝트에 의해 지원 됩니다. PJ0011642) "농촌 진흥청, 한국에 의해 자금. 이 연구는 또한 부분적으로 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 미래 계획, 한국 투자의 부여 (NRF-2017R1A2B4012253)에 의해 지원 됩니다. 이 연구는 또한 크리에이 티브 및 사역의 무역, 산업 및 에너지, 한국 투자 산업 컨버전스에 대 한 교육 프로그램의 교부 금 (N0000717)에 의해 지원.

1입니다. PDMS 미세 플랫폼의 제조
<ol><li>베이스 폴리머와 볼륨의 비율은 10: 1에 촉매를 혼합 하 여 액체 PDMS prepolymer의 20 mL를 준비 합니다. 미세 네트워크의 위쪽 부분에 대 한 실리콘 웨이퍼에 준비 수 8 금형에 액체를 PDMS의 10 mL를 붓으십시오. 아래 평평한 부분에 대 한 같은 양의 액체 PDMS 몰드 구조 없이 실리콘 웨이퍼에 붓는 다. 참고: 미세 네트워크 설계 CAD 프로그램에 및 다음 일반적인 포토 리소 그래피 과정 (참조 추가 숫자)를 사용 하 여 마스터를 조작 하기 위해는 포토 마스크를 변환. 이 마스터는 실리콘 웨이퍼11에 부정적인 감광 수-8 형의 구성입니다.</li>
	<li>핫 플레이트에 치료 30 분 동안 75 ° C에 액체 PDMS prepolymer와 코팅 2 실리콘 웨이퍼를 배치 합니다.<ol>
<li>수동으로 수-8 형에서 치료 PDMS 레이어를 벗기다. 1.5 m m 직경 구멍 구멍을 뚫는 도구 매크로 액체 샘플 미크론 규모 흐름 채널 인터페이스 복제 미세 네트워크에 오일 포트를 라운드를 맞춥니다. 펀치 구멍을 통해 밖으로 수동으로.</li>
		<li>펀칭 두 솔루션 및 출구 포트의 형성에 대 한 세 번 과정 반복.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상단 및 하단 PDMS 레이어 샘플 당 몇 초 동안 휴대용 코로나 처리기12 를 사용 하 여 친수성 표면 처리를 수행 합니다.<ol>
<li>PDMS PDMS 접합 과정에 대 한 뜨거운 접시를 사용 하 여 30 분 동안 두 개의 플라즈마 치료 PDMS 레이어 및 90 ° C에서 열을 스택. 구조 결합 및 누설 테스트 조작된 장치에 대 한 3 개의 입구 포트에 주사기 펌프를 사용 하 여 압력된 물 공급.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Polyacrylamide 올리고 스피어의 생산
<ol><li>준비 구슬-혼합 표 1에 자세히 설명 합니다.</li>
	<li>소용돌이 짧게 분리기 표준 ssDNA acrydite 프로브 (Ap, 100 μ M) 및 acrylamide:bis (19:1) 재고 솔루션을 표시.</li>
	<li>솔루션을 준비 나 혼합 하 여 40% 아크릴의 25 μ 두번째 솔루션, ssDNA (acrydite 프로브)의 10 μ, 10 μ (1.1 M Tris 900 m m borate; 25 mM EDTA), 5 x TBE 버퍼의 물 5 μ. 20% 염화 persulfate의 50 μ와 솔루션 II를 준비 합니다.</li>
	<li>2 준비 주사기 개별적으로 어 솔루션 II, 솔루션으로 가득 하 고 미세 플랫폼에 솔루션 흐름을 소개 하는 펌프에 탑재. 미네랄 오일 0.4% 혼합 준비 TEMED는 스피어의 표면 응고에 대 한. 참고: TEMED 자유 래 디 칼 안정제로 유명 하다. 자유 래 디 칼 아크릴 중 합을 진작 하기 위해 암모늄 persulfate (AP)와 폴리머 형성의 속도 가속화할 수 있습니다.</li>
	<li>지속적인 흐름을 생성 하기 위해 미네랄 오일의 4 mL 유리병을 채우십시오.</li>
	<li>미세 저수지 유리 병의 모자에 있는 2 개의 포트를 2 개의 튜브를 삽입: 공기 압축기 및 마이크로 채널 네트워크에 압력된 유를 공급 액체 포트에서 유리 병에 압축 공기를 적용 하기 위한 공기 포트 유리 병. 관 유리 제 병 및 미세 장치에 오일 포트 사이 연결 합니다.<ol>
<li>주사기 펌프에서 두 솔루션을 공급 하기 위하여 미세 장치에서 두 개의 솔루션 포트에 튜브를 연결 합니다. 삽입 튜브 출구 포트를 비 커에 생성 된 스피어를 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.4-0.7 mL/h. 조정 압축 공기 압력 레 귤 레이 터 (82-116 kPa)를 사용 하 여 압축기의 주사기 펌프의 유량을 설정 합니다. 뜨거운 접시에 유리 비 커에 자력 막대의 회전 속도 (500 rpm)를 설정 합니다. 주사기 펌프 하며 전자기 밸브13의 ON/OFF 제어를 사용 하 여 유리 병에 외부 압축기에 의해 생성 된 압축 공기를 공급 한다.</li>
	<li>디지털 현미경으로 흐름 초점 기하학에서 스피어의 형성 및 유리 비 커에 생성 된 스피어의 응고를 준수 합니다. 참고: 크기와 생산 속도 스피어의 솔루션 및 미네랄 오일 흐름에 대 한 적용 압력 flowrate에 따라 (표 2).
</li>
</ol>3. 수행 Polyacrylamide 올리고 스피어 계산
<ol><li>Hemocytometer 정량화에 대 한 유리 hemocytometer에 polyacrylamide 올리고-스피어와 장소의 수성 해결책의 작은 금액 (약 100 μ) 고 부드럽게 세 챔버의 잘 스피어 정지를 채우기. 주: 자세한 내용은 http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer를 참조 하십시오.</li>
	<li>현미경과 손을 집계 카운터를 사용 하 여 16 사각형의 한 세트에 스피어를. 그리고 챔버의 다음 세트는 hemocytometer 이동 16 코너의 모든 4 개의 집합 계산 됩니다 때까지 계산을 수행 합니다.</li>
	<li>평균 스피어 개수를 확인 하 고 원래는 구슬에에서 스피어의 수를 계산.</li>
	<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 스피어의 100 μ를 전송. (400 x g) centrifuging 부드럽고 pipetting 통해 상쾌한을 제거 합니다.</li>
</ol>4. Polyacrylamide Oligomicrosphere의 표면에 DNA 교 잡 수행
참고: 한 동일한 DNA 조사는 5'-NH2-5'-acrytide 수정 대신 그룹 추가 솔루션으로 나 동시에 Ap를 포함 하는 스피어에 대 한 테스트. DNA 교 잡 결과 그림 2에 표시 됩니다. 어두운 방에 Cy3 표시 보완 oligonucleotide 프로브 (모자) 솔루션을 두어야 한다.
<ol><li>Cy3 모자 1xTE 버퍼의 100 μ를 사용 하 여 resuspend (TE 버퍼: 10 mM Tris 및 1μM EDTA, pH 8.0) 100 μ M의 최종 농도 달성 하기 위하여. 예를 들어 테 버퍼와 알루미늄 호 일로 덮여 microcentrifuge 튜브에 100 mL에 1 pmol 캡의 resuspend. 주: 스트랜드 시퀀스 표 3를 참조 하십시오.</li>
	<li>Ap copolymerized 스피어를 포함 하는 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 100 μ M의 Cy3 모자를 추가 합니다.</li>
	<li>몇 번 튜브를 가볍게 혼합 하 고 1 시간에 대 한 어둠 속에서 실 온에서 품 어.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 pipetting 통해 잔여 버퍼를 제거 합니다.</li>
	<li>TE 버퍼의 500 μ로 세 번 씻어.</li>
	<li>Microcentrifuge 튜브를 부드럽게 눌러 스피어를 resuspend. 그런 다음 단계 4.4 반복 합니다.</li>
	<li>유리 슬라이드 (75 m m x 50 m m)와 이미징 이전 알루미늄 호 일 덮개에 스피어를 놓습니다.</li>
</ol>5. 비대칭 PCR ssDNA를 증폭에 대 한
<ol><li>분석할 ssDNA를 증폭에 대 한 비대칭 PCR 시 약 믹스를 준비 합니다. 얼음에 표 4 에서 시 약 녹여 얼음, Taq 중 합 효소 효소 (50 U / µ L)를 유지 하지 않습니다 하지만 오히려 필요할 때까지-20 ° C에서 그것을 저장.</li>
	<li>부드럽게 소용돌이 모든 시 약 후 간단히 원심 10000 x g 10에서 튜브와 s.</li>
	<li>에 설명 된 대로 모든 시 약을 결합 표 4.
</li>
	<li>샘플을 thermocycler에 놓고 다음과 같은 조건에서 비대칭 PCR을 시작: 25 주기 (95 ° C 30에 대 한 s, 52 ° C 30에 대 한 s, 그리고 30 대 72 ° C s), 5 분, 85 ° C 4 ° c.에서 개최</li>
</ol>6입니다. 스피어-PCR ssDNA를 증폭에 대 한
참고:이 섹션에서는 PCR 반응 관에 ssDNA를 증폭에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 스피어 PCR 반응 반응 볼륨의 50 μ에서 수행 했다. SsDNA를 증폭 하는 데 사용 하는 자세한 시퀀스는 표 5에 나열 됩니다. 이 경우에, 스피어의 표면에 Ap 상호 보완적인 방식으로 무작위 DNA 템플릿에 anneal 수 있습니다. 이 보완 DNA 가닥 (센스 DNA 가닥, 그림 3) 생산을 위한 매우 중요 한 단계입니다. 확장 하는 DNA는 스피어 PCR 증폭에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다.
<ol><li>스피어 PCR 시 약 믹스를 준비 합니다. 얼음; 표 6 에서 시 약을 녹여 그러나, Taq 중 합 효소 효소 얼음에 보관 하지 마십시오. -20 ° C까지 필요에 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>부드럽게 소용돌이 모든 시 약 후 간단히 원심 10000 x g 10에서 튜브와 s.</li>
	<li>미세한 계산을 통해 약 25 스피어를 얻을. 참고: 한 반응 관에서 스피어의 수 40 X 확대와 함께 가벼운 현미경을 사용 하 여 계산 됩니다. 약 25 스피어는 스피어 PCR 증폭에 사용 됩니다. 더 자세한 정보는 3 단계.</li>
	<li>에 설명 된 대로 모든 시 약을 결합 표 6.
</li>
	<li>샘플을 thermocycler에 놓고 다음과 같은 조건에서 비대칭 PCR을 시작: 25 주기 (95 ° C 30에 대 한 s, 52 ° C 30에 대 한 s, 그리고 30 대 72 ° C s), 5 분, 85 ° C 4 ° c.에서 개최</li>
	<li>다음 증폭, 버퍼 로드 x 6의 8 μ를 추가 하 고 각 샘플의 15 μ 2 %agarose 젤으로 로드. 다음, 1에서 35 분 100 V에서 전기 영동을 수행 x TAE (트리 스-아세테이트-EDTA, 40mm 트리 아세테이트, 1 m m EDTA, pH 8.2) 버퍼.</li>
</ol>7. confocal 현미경 검사 법 수집
참고: 스피어 DNA 프로브 교 잡의 결과 confocal 현미경 아래 몇 군데. 이미지 분석 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.
<ol><li>현미경의 단계로 교배 스피어를 수정 했다.</li>
	<li>(헬륨/네온 레이저, 543 nm 선) 레이저를 선택 하 고 레이저 제어에서 그것을 켜십시오.</li>
	<li>현미경 제어에서 대물 렌즈를 선택 합니다.</li>
	<li>Cy3 및 채널 구성 제어에서 원하는 필터를 선택 합니다.</li>
	<li>실험을 시작 하 고 샘플을 관찰. Confocal 현미경에 대 한 설정은 표 7에 요약 되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
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<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
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<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
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<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

DsDNA의 오염 물질 ssDNA 증폭에 큰 문제입니다. 기존의 비대칭 PCR 증폭15dsDNA 증폭을 최소화 하기 어려운 남아 있다. 또한, ssDNA를 생성 하기 위한 기술적인 개선 샘플 처리량의 효율성을 증가 있게가지고, 비록 ssDNA 절연의 높은 비용 및 불완전 한 정화 수확량 때문에 여전히 문제입니다.
비대칭 PCR ssDNA를 작업할 때 사용 하는 가장 어려운 방법 중 하나입니다. 이 메서드는 부동 한 양의 뇌관 (예, 20: 1 비율) 많은 양의 ssDNA 생성 하려면 적용 됩니다. 그러나, 모든 증폭 반응 ssDNA를 최적화 하기 매우 어렵습니다. 따라서, 부산물 (dsDNA) resultants4에서 제거 되어야 합니다.
추가 분리 단계 없이 ssDNA를 생성 하기 위해 우리는 acrydite 혼성 방법에 따라 ...

단일 가닥 DNA (ssDNA) DNA-DNA 교 잡1,2에 대 한 본질적인 속성 때문 분자 인식 요소 (MRE)으로 광범위 하 게 고려 하고있다. SsDNA 합성 시스템의 개발 생물학 응용 DNA microarrays3, oligotherapeutics, 진단 및 보완 상호 작용4,5에 따라 통합 분자 감지 등 발생할 수 있습니다.
날짜 하려면, 마이크로미터 스케일 폴리머 입자는 성공적으로 시연 미세 장치를 사용 하 여. 여러 미세 기술 아닌 환경6,7연속 흐름에 매우 동질적인 스피어를 생산에 대 한 강력한 것으로 입증 되었습니다.
이 외 의 연구에서 8, copolymerizable 올리고 스피어와 ssDNA 증폭의 미세 합성에 대 한 미세 물방울 기반 플랫폼으로 알려졌다. 2 개의 PDMS (입니다) 층의 미세 플랫폼 구성: 스피어 및 아래쪽 평면 부분을 생성 하기 위한 미세 채널 네트워크와 위쪽 부분. 이 세 종류의 PDMS 유체 채널 구성: 1) 물방울 생성에 대 한 채널, 2)는 뱀 두 가지 솔루션, 혼합 채널과 채널 3)는 연속 중 합 스피어 응고에 대 한 초점을 맞추고 흐름. 일단 2 개의 혼합할 수 없는 흐름 PDMS 유체 채널에 소개는, 좁은 구멍 구조를 통해 흐름을 강제로 있습니다. 채널 형상, 유량, 점도 등 흐름 동작 크기와는 스피어의 형태에 영향을 줍니다. 따라서, 주요 액체 스트림 미 monospheres9,10으로 나눌 수 있습니다.
여기, 자세한 스피어-PCR 프로토콜 ssDNA의 증폭에 대 한 제공 됩니다. 첫째, 미세 물방울 기반 장치 설계 과정을 설명 합니다. 그런 다음, 어떤 polyacrylamide에 스피어 수 수 functionalized 무작위 DNA 템플렛으로 보완 하는 방식에서 하는 방법 설명 했다. 마지막으로, 스피어-PCR 프로토콜 ssDNA를 증폭에 대 한 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>액상 폴리디메틸실록산, PDMS</td><td>다우코닝</td><td>Sylgard 184</td><td>칩의 구성 요소</td></tr><tr><td>40 % 아크릴 아미드 : 비스 용액 (19 : 1)</td> <td>바이오 라드</td><td>1610140</td><td>공중합 가능한 올리고 - 마이크로 스피어</td></tr><tr><td>과황산 암모늄의 구성 요소, APS</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A3678</td><td>아크릴 아미드의 경화제 : 비스 용액</td></tr><tr><td>N, N, N&prime, N&prime, -Tetramethylethylenediamine, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>과황산 암모늄 촉매</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>표 1. 솔루션 III. 마이크로스피어 시약의 구성 요소</td></tr>: <tr><td>Cy3 표지, 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브,</td><td>Bioneer</td>, <td>합성</td>, <td>표 3. 시퀀스 정보&nbsp;</td></tr><tr><td>ssDNA 아크릴다이트 표지 프로브</td><td>Bioneer</td><td>합성</td><td>표 1. 솔루션 I. 미세구 시약의 구성 요소</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; TE 완충액의 T1016</td><td>구성 요소, pH 완충 용액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>TE 완충액의 구성 요소, 이온 제거(Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>ssDNA 증폭</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>미세구 표면의 올리고뉴클레오티드 노출 식별</td></tr><tr><td>, 광학 현미경</td>, <td>Nikon Instruments, Inc.</td><td>Eclipse 80i</td><td>Caculating 수 미세구</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>ssDNA 증폭</td></tr><tr><td>휴대용 코로나 처리기</td><td>Electro-Technic</td><td>BD-20AC 실험실 코로나 처리기</td><td>친수성 표면 처리</td></tr> 핫 플레이트 액체 PDMS 주사기 펌프 kd Scientific <tr><td></td><td></td> 78-1100 경화<td>를 위한</td>하나의 <td>HI-1000</td> 가열판으로</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Solution I 및 Solution II 압축기의 균일한 흐름</td></tr><tr><td></td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Solution III의 흐름 제어</td></tr><tr><td>Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma Aldrich Z359629</td><td></td><td>미세구 수 계산</td></tr></tbody></table>

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 dna amplicons 위한 스피어 pcr 증폭

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

드롭릿 기반 마이크로 제어 크기와 취득된 스피어의 형태를 제공 하는 미세 채널에서 균질 스피어의 안정적인 생산 가능 스피어 acrydite DNA 프로브 copolymerized 성공적으로 조작 했다. 비대칭 PCR, exonuclease 소화와 streptavidin 입히는 자성 구슬에 격리 같은 다른 방법은 단일 가닥 DNA (ssDNA) 합성에 사용할 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법을 효율적으로 많은 양의 매우 순화 된 ssDNA 사용할 수 없습니다. 여기, 우리가 어떻게 ssDNA 수 수 효율적으로 증폭 및 구분 dsDNA에서 단순히 PCR 반응 관에서 pipetting 스피어-PCR 프로토콜을 설명 합니다. SsDNA의 증폭 DNA microarray 및 DNA SELEX (지 수 풍부에 의하여 ligands의 체계적인 발전) 프로세스에 대 한 잠재적인 약으로 적용할 수 있습니다.

2 개의 PDMS 층 (그림 1a) 조립된 고분자 드롭릿 기반 미세 플랫폼에 의하여 이루어져 있다. 미세 채널 네트워크의 3 종류 스피어를 생성 하는 데 사용 된다: 1) 흐름 초점 기하학과 같이 그림 1b, 2)는 사 문석 어 솔루션 II, 솔루션을 혼합에 대 한 채널과 채널 3) 합 스피어에 대 한 응고입니다. 모든 채널의 높이 60 μ m 이었다. 혼합 및 중 합 채널 길이 되었고 74.35 mm 94.45 m m, 각각. 2 개의 혼합할 수 없는 액체 흐름 및 미네랄 오일 흐름을 위해 하나 아닌 너비 100 μ m 및 200 μ m, 각각 있었다. 스피어 형성에 사용 되는 오리 피스 구조 50 μ m 길이 및 25 μ m 폭 이었다. 디퓨저 구조 각도 37 ° 이었다. 미네랄 오일의 연속 흐름에 대 한 실험실 기반 공 압 제어 시스템 및 솔루션 흐름 (<st...

이 작품에는 미세 물방울 기반 플랫폼의 제조와 스피어 PCR 확대를 위한 polyacrylamide 스피어의 응용 프로그램에 대 한 방법을 제공 한다. 스피어 PCR 방법 단일 가닥 DNA amplicons 이중 가닥 DNA를 분리 하지 않고 얻을 수 있습니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

이 방법은 미세 유체 시스템 및 분자 생명 공학 분야의 결합 기술(예: 미세 유체 장치 및 비대칭 PCR 방법)의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 고균화 된 미세 구체의 효율적인 생성과 추가 분리 단계없이 단일 좌초 DNA의 생산입니다. 이 기술의 의미는 다양한 질병의 진단 또는 치료로 확장됩니다.단일 가닥 DNA의 생성은 ap-ta-mo-sis assays의 핵심이기 때문에 검출 및 치료에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 MEMS의 3차원 미세 유체 시스템에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 질병의 검출 및 치료에 사용되는 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로,이 방법에 새로운 개인은 제대로 역 방향으로 흐르는에서 유체를 제어하는 데 어려움을 겪을 것이다.이 방법의 시각적 데모는 유동 초점 형상및 생성된 마이크로스피어의 응고에서 마이크로스피어 형성을 관찰하는 데 매우 중요합니다. 첫째, 염기 폴리머와 촉매를 10 대 1 비율로 혼합하여 액체 PDMS 프리 폴리머 20 밀리리터를 준비합니다. 액체 PDMS의 10 밀리리터를 미세 유체 네트워크의 상부에 대한 실리콘 웨이퍼에 준비된 SU-8 금형에 붓습니다.바닥 플랫 부품의 경우 금형 구조없이 실리콘 웨이퍼에 동일한 양의 액체 PDMS를 붓습니다. 액체 PDMS 프리 폴리머로 코팅 된 두 개의 실리콘 웨이퍼를 예열 된 핫 플레이트에 놓고 섭씨 75도에서 30 분 동안 치료하십시오. 이에 따라 SU-8 금형에서 경화 된 PDMS 층을 수동으로 벗깁니다.1.5mm 직경의 둥근 구멍 펀칭 도구를 복제된 미세 유체 네트워크의 오일 포트에 정렬하여 미크론 스케일 흐름 채널을 거시적 유체 샘플과 상호 결합합니다. 그런 다음 수동으로 관통 구멍을 펀치. 펀칭 공정을 세 번 반복한 후, 샘플당 몇 초 동안 핸드헬드 코로나 치료기를 사용하여 상하 PDMS 층 모두에서 친수성 표면 처리를 수행합니다.PDMS-PDMS 접합 공정을 위해 핫플레이트에서 플라즈마 처리된 PDMS 층 2개와 열 이 90도에서 30분간 가열합니다. 소용돌이와 간략하게 원심분리기 표준 단일 좌초 DNA 아크라디트 라벨 프로브와 19 대 1 아크릴아미드 비스 스톡 솔루션. 40%의 아크릴아미드 비스 용액 25마이크로리터, 단일 가닥 DNA 10마이크로리터, 5X TBE 버퍼 10마이크로리터, 5마이크로리터의 물을 혼합하여 솔루션을 준비합니다.20% 암모늄 아황산염의 50 마이크로리터와 함께 2개의 솔루션을 준비하십시오. 솔루션 1개와 솔루션 2개로 개별적으로 채워진 두 개의 주사기를 개별적으로 준비하고 주사기 펌프에 장착하여 솔루션 흐름을 미세유체 플랫폼으로 유입시 소개합니다. 마이크로피어의 표면 응고를 위해 0.4%TEMED와 혼합된 미네랄 오일을 준비합니다.미네랄 오일로 유리 병을 채운 후 유리 병의 캡에 공압 및 유체 포트에 두 개의 튜브를 미세 유체 저장소로 삽입합니다. 마이크로 유체 장치에서 유리 병과 오일 포트 사이에 튜브를 연결합니다. 주사기 펌프에서 두 가지 솔루션을 공급하기 위해 마이크로 유체 장치의 두 솔루션 포트에 튜브를 연결합니다.그런 다음 생성된 마이크로피어를 비커로 전송하기 위해 튜브를 콘센트 포트에 삽입합니다. 다음으로 주사기 펌프의 유량을 시간당 0.4 ~0.7 밀리리터로 설정합니다. 레귤레이터를 사용하여 압축기의 압축 공기 압력을 조정합니다.핫플레이트에 마그네틱 스터드 바가 있는 유리 비커를 놓고 회전 속도를 설정합니다. 주사기 펌프를 작동하고 전자기 밸브의 온-오프 제어를 사용하여 외부 압축기에서 발생하는 압축 공기를 유리 병에 공급합니다. 디지털 현미경을 사용하여, 유리 비커에서 생성된 마이크로스피어의 흐름 중심 형상 및 응고에서 마이크로스피어의 형성을 관찰한다.마이크로스피어의 형성을 관찰하는 것은 미세구와 미세 유체 시스템을 생산하는 이 연구에서 중요한 과정이기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 이에 따라, 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브로 마이크로스피어의 100마이크로리터를 이송한다. 그런 다음 부드러운 원심 분리 및 파이펫팅을 통해 상체를 제거합니다.100 마이크로몰러의 최종 농도를 달성하기 위해 1X TE 버퍼의 100 마이크로 리터를 사용하여 무료 프로브 변형 cyanine-3을 다시 중단합니다. 다음으로, AP 중합 마이크로스피어를 함유한 멸균 1.5 밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 보완 프로브 변형 cyanine-310 마이크로몰어를 추가합니다. 튜브를 몇 번 탭하여 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 혼합하고 배양합니다.인큐베이션을 따라, 상체를 폐기하고 파이펫팅을 통해 잔류 버퍼를 제거합니다. 그런 다음 TE 버퍼 500 마이크로리터로 세 번 헹구습니다. 75x50mm 유리 슬라이드에 마이크로스피어를 놓고 이미징 전에 알루미늄 호일로 덮습니다.40배율을 가진 광 현미경을 사용하여 현미경 계수를 통해 약 25개의 미세구를 얻습니다. 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 시약을 결합합니다. 샘플을 열순환기에 넣고 적절한 조건하에서 비대칭 PCR을 시작합니다.비대칭 PCR 후 상체의 컬렉션은 마이크로 스피어와 단일 가닥 DNA를 생성하기위한 주요 과정이기 때문에 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 증폭 후 각 샘플에 6X 로딩 버퍼의 8개의 마이크로리터를 추가합니다. 각 샘플의 15 마이크로리터를 2%의 아가로즈 젤로 로드합니다.그런 다음 1X TAE 버퍼에서 35분 동안 100볼트에서 전기전도를 수행합니다. 혼성 마이크로스피어를 홀더에 놓고 공초점 현미경의 단계에 홀더를 부착합니다. 레이저를 선택하고 레이저 제어에서 켭니다.현미경 제어에서 객관적인 렌즈를 선택합니다. 그런 다음 구성 컨트롤에서 시아닌-3 및 채널에 대해 원하는 필터를 선택합니다. 마지막으로 실험을 시작하고 샘플을 관찰합니다.제조 된 폴리머 액적 기반 의 미세 유체 플랫폼은 두 개의 PDMS 층으로 구성됩니다. 3종의 미세유체 채널 네트워크는 유동에 초점을 맞춘 형상, 1및 2개의 혼합 용 용하채널을 생성하는 마이크로스피어, 마이크로스피어 응고를 위한 중합 채널 을 생성하는 데 사용됩니다. 광물 오일의 지속적인 흐름을 위한 실험실 기반 공압 제어 시스템과 용액 흐름을 위한 두 개의 주사기 펌프가 미세유체 플랫폼에서 마이크로스피어를 생성하는 데 사용되었습니다.마이크로스피어가 5프라임 아크라디트 DNA 프로브로 올바르게 기능화되면, 이러한 형광 이미지에 도시된 하이브리드화 실험 중에 표면에 형광 활성이 보장되어야 한다. 중합체화가 올바르게 발생하지 않으면 광학 마이크로스피어 이미지는 마이크로스피어 내부의 내부 오염을 나타낼 것입니다. DNA 올리고 프로브로 마이크로스피어의 3D 표면을 조작하는 것은 훨씬 더 빠른 과정이며, 온-플로우 마이크로스피어 합성 플랫폼은 단일 좌초 된 DNA 증폭 및 정화를위한 도구를 제공 할 수 있습니다.처음 공합된 5프라임 AP는 보완적인 템플릿으로 어닐링한 후 DNA 중합화를 위한 3가지 프라임 하이드록실 엔드를 제공한다. 이중 좌초 된 DNA 오염 물질은 비대칭 PCR 실험에서 관찰되었다. 마이크로스피어 PCR로부터 축적된 결과 단일 좌초 DNA는 겔 전기전도 분석을 통해 합성 크기 마커와 비교하여 입증되었다.이 절차를 시도하는 동안 이 메서드에서 증폭 주기, 어닐링 온도 및 프로브 시퀀스를 획득하는 데 일반적으로 필요한 프로토콜 및 조정에 대한 사전 지식이 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 기술은 분자 생명 공학 및 생명 의학에 있는 2개의 지구를 연결하는 진단 그리고 치료의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 아크릴아미드 솔루션으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 장갑과 실험실 코트를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

이 동영상은 DNA 샘플에서 indel 돌연변이를 식별하는 데 있어 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응의 역할을 보여줍니다. ddPCR의 높은 정밀도와 감도는 낮은 수준에서도 샘플에 존재하는 희귀 돌연변이를 정확하고 일관되게 검출할 수 있습니다. 게놈의 여러 영역에서 indel 돌연변이를 식별하고 정량화할 수 있으며, 이를 통해 돌연변이의 메커니즘과 이러한 돌연변이의 기능적 결과에 대한 귀중한 통찰력을 얻을  수 있습니다.

타겟 유전자의 Indel 돌연변이 검출을 위한 디지털 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오는 단일 튜브 반응에서 올리고뉴클레오타이드로 코팅된 고분자 미세구를 사용하여 단일 가닥 DNA를 증폭하는 기술을 설명합니다. 이 과정을 통해 DNA 염기서열분석 및 마이크로어레이 분석에 추가로 사용할 수 있는 순수한 단일 가닥 DNA가 생성됩니다.

Microsphere Polymerase Chain Reaction to Amplify single-stranded DNA(단일 가닥 DNA를 증폭하기 위한 마이크로스피어 중합효소 연쇄 반응)

이 동영상은 임상 진단 및 예후를 위한 조기 바이오마커로서 서로 다른 백혈구 집단에서 메틸화된 DNA 영역을 동시에 정량화하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응 기술을 보여줍니다.

백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

단일 셀 시퀀싱 생물 학적 시스템, genotypic이 보여 하지만 현재 기술 커뮤니티 구성 및 기능의 깊은 프로 파일링에 필요한 처리량 부족. 여기, 우리는 미세 워크플로 시퀀싱에 대 한 설명 &gt; 다양 한에서 50000 단일 셀 게놈 세포 인구.

단일 셀 게놈 시퀀싱 초고 처리량 미세 플랫폼

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

물방울 분석은 분석 화학, 효소 진화 및 단일 세포 분석에 유용하지만 일반적으로 액적을 형성하기 위해 미세 유체학이 필요합니다. 여기서는 액적 저술을 수행하기 위한 미세유체없는 접근 방식인 입자 템플릿 유화제를 설명합니다.

입자 템플릿 유화제를 통해 미세 유체가 없는 물방울 분석을 가능하게 합니다.

배우세요 드롭릿 기반 미세유체 플랫폼에서 폴리아크릴아미드 미세구체를 이용한 마이크로스피어 PCR 증폭 기법으로 이중가닥 DNA 분리 없이 단일가닥 DNA를 효율적으로 생산하는 방법을. 이 기술은 질병 진단 및 치료에 활용됩니다.

드롭릿 기반 미세 접근 및 단일 가닥 DNA Amplicons 위한 스피어 PCR 증폭

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