Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

본 생체 접합법의 전반적인 목표는 이황화 결합을 포함하는 바이러스 유사 입자에 형광 기능화를 수행하는 것입니다. 이 방법은 기능화가 가능한 아미노산 잔기의 수가 제한적인 바이러스 유사 입자의 생체 접합 반응에서 핵심적인 질문들에 대한 해답을 제시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단 한 번의 반응을 통해 새로운 기능기 도입과 접합 유도 형광체 형성을 동시에 수행할 수 있다는 점입니다. Q-Beta 외에도, 본 반응은 이황화 결합을 보유한 모든 바이러스 유사 입자에 적용 가능할 것으로 판단됩니다.

Q-Beta 박테리오파지를 발현시키는 절차를 시작하기 전, 1:1 비율의 표백제:에탄올 용액으로 벤치 영역을 닦아냅니다. 무균 환경에서 E.coli BL21 단일 콜로니를 SOB 배지에 첨가하여 3 mL 스타터 배양액 두 개를 만듭니다. 배양액을 37 °C, 상대습도 0%인 배양실에서 250 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 진탕기에서 3 mL 스타터 배양액 두 개를 꺼내어 무균 환경에서 각각의 스타터 배양액을 1 L의 신선한 SOB 배지가 담긴 2 L 배플 삼각 플라스크에 붓습니다. 접종된 배지가 담긴 플라스크 두 개를 37 °C, 상대습도 0%인 배양실의 진탕기에 놓고 250 rpm으로 배양합니다. 박테리아가 600 nm에서의 광학 밀도 또는 OD 600 값이 0.9에서 1.0에 도달할 때까지 배양합니다. 이는 보통 약 5시간이 소요됩니다. 배양액이 원하는 OD 600 값에 도달하면, P1000 피펫을 사용하여 각 플라스크에 1 M IPTG 1 mL를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 플라스크를 온실 내 진탕기에 두고 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날 아침, 쉐이커에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크의 내용물을 1L 병으로 옮긴 후, 4°C에서 20,621 ×g로 1시간 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리가 완료되면, 박테리아를 사멸시키기 위해 약 5mL의 표백제가 들어 있는 플라스크에 상층액을 부어 버립니다.

세포 펠릿을 수집하려면, 스패튤러를 사용하여 원심분리 병 바닥에서 세포 펠릿을 긁어낸 후 50-milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.

Q-Beta 정제 절차를 시작하려면, 각 세포 펠렛을 20~30 mL의 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7)으로 재현탁합니다. 이때 재현탁액에 덩어리가 없는지 확인하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 마이크로플루이다이저(microfluidizer) 프로세서를 사용하여 세포를 용해합니다. 입자의 수율을 높이기 위해 세포 용해 과정을 최소 2회 반복하십시오. 용해물을 250 mL 원심분리 병으로 옮기고 4 °C에서 20,621 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 상층액의 부피를 mL 단위로 측정합니다. 해당 값에 0.265를 곱한 뒤, 그 양만큼의 황산암모늄(g)을 상층액에 첨가합니다. 자석 교반자를 넣고 4 °C, 200 rpm의 교반기에서 최소 1시간 동안 교반하여 단백질을 침전시킵니다. 250 mL 병을 사용하여 4 °C에서 20,621 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 상층액은 버리고 펠렛을 약 40 mL의 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7)으로 재현탁합니다. 조제된 샘플에 동일한 부피의 1:1 클로로포름:n-부탄올 혼합액을 첨가하고 몇 초간 볼텍싱하여 섞습니다. 혼합물을 38 mL 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 20,621 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상단의 수성층을 회수합니다. 이때 수성층과 유기층 사이에 형성된 젤 형태의 층이 섞이지 않도록 주의하십시오.

다음으로, 미리 만들어 둔 65~40% sucrose gradient를 해동합니다. 각 gradient에 추출액 약 2 mL를 로딩합니다.

4°C에서 99,582 ×g로 16시간 동안 자유 감속(free deceleration) 조건으로 초원심분리합니다. 초원심분리가 완료되면 각 튜브 하단에 LED 라이트를 비추어 푸른색 밴드가 보이는지 확인합니다. 긴 바늘 주사기를 사용하여 이 입자들을 회수합니다. 회수한 입자들을 4°C에서 370,541 ×g로 2.5시간 동안 초원심분리하여 펠렛(pellet)화합니다. 정제된 입자로 형성된 결과 펠렛은 투명해야 합니다. 상층액을 버리고 pH 7의 0.1 M 인산칼륨 완충액으로 펠렛을 재현탁합니다.

이 도식은 시연될 접합 과정을 보여줍니다. Q-Beta 1mg에 포함된 이황화물 대비 10당량의 Tris(2-carboxyethyl)phosphine 또는 TCEP를 사용하여 상온에서 1시간 동안 모든 이황화물을 환원시켜 환원된 Q-Beta 캡시드를 생성합니다. Q-Beta의 이황화물을 환원시키기 직전에 신선한 TCEP 용액을 준비하십시오.

TCEP 0.002 g을 초순수 1 mL에 녹여 100X 스톡 용액을 제조합니다. 5 mg/mL Q-Beta 200 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 그런 다음, 100X TCEP 스톡 용액 20 µL를 해당 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

그동안, 환원된 이황화 결합을 다시 연결하는 후속 반응을 위해 디브로모-말레이미드 폴리에틸렌 글리콜(dibromo-maleimide polyethylene glycol) 또는 DB-PEG 용액을 준비합니다. DB-PEG 0.0017 g을 dimethylformamide 100 µL에 녹입니다. 여기에 pH 5의 10 mM sodium phosphate 용액 680 µL를 첨가합니다. 다음으로, 환원된 Q-Beta를 DB-PEG 용액에 넣고 휴대용 365 nm UV 램프 아래에서 혼합 과정을 관찰합니다. 혼합 즉시 밝은 노란색 형광이 나타나야 합니다. 반응물을 로티세리(rotisserie)에 올려 상온에서 하룻밤 동안 반응시킵니다.

다음 날 아침, 4°C에서 3,283 ×g로 20분 동안 1X PBS를 사용하는 원심분리 필터로 반응 혼합물을 정제합니다. 마지막으로, 비환원 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동과 네이티브 아가로스 겔 전기영동을 통해 접합 여부를 확인합니다.

Q-Beta에 DB-PEG의 접합은 UV 및 Coomassie blue 염색을 통한 비환원성 SDS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인하였습니다. 모든 형광 밴드가 Coomassie blue 염색 부위와 동일한 위치에서 나타나, 접합이 성공적으로 이루어졌음을 보여주었습니다. Q-Beta-PEG 접합체의 무결성은 네이티브 아가로스 겔 전기영동과 투과 전자 현미경으로 확인하였습니다.

위쪽 현미경 사진은 Q-Beta-maleimide(Q-Beta-M)를, 아래쪽 현미경 사진은 Q-Beta-PEG를 보여줍니다. 0.1 M 인산칼륨 완충액에서 Q-Beta-M과 Q-Beta-PEG의 형광 분광 분석 결과, 들뜸 최대 파장은 약 400 nm, 방출 최대 파장은 약 540 내지 550 nm로 나타났습니다. 무혈청 DMEM 배지에서 마우스 대식세포와 Q-Beta-PEG를 함께 배양한 후 핵 염색을 실시한 결과, 공국소화(co-localization) 이미지에서 노란색 형광 입자가 세포 내로 섭취되었으며 배양 4시간 후에도 추적이 가능함을 보여줍니다.

이와 대조적으로, 기능화되지 않은 Q-Beta 바이러스 유사 입자는 형광이 거의 나타나지 않습니다.

이 프로토콜은 연구자가 4일 이내에 Q-Beta를 정제하고 하룻밤 동안 리브리징 결합 반응(re-bridging conjugation reaction)을 수행하는 데 도움을 줍니다. 이 절차를 수행할 때, 결합 반응은 pH 5와 같은 산성 조건에서 가장 잘 일어난다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 Q-Beta VLP를 정제하고 dibromo-maleimide 화합물을 사용하여 이황화 결합을 재가교함으로써 형광 표지된 VLP를 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 개발 이후, 이 기술은 연구자들에게 박테리오파지 Q-Beta의 외부 표면을 이중 기능화하는 데 사용할 수 있는 추가적인 기능적 핸들을 제공하였습니다.