Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

이 생체 접합 방법의 전반적인 목표는 바이러스와 유사한 입자를 포함하는 이황화물을 형광 기능화하는 것입니다. 이 방법은 기능화될 수 있는 제한된 수의 아미노산 잔기를 가진 바이러스 유사 입자에 대한 생체 접합 반응의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 하나의 반응을 사용하여 새로운 작용기를 도입할 수 있고 동시에 접합 유도 형광단을 형성할 수 있다는 것입니다.

QBeta 외에도 이 반응은 이황화 결합을 가진 모든 바이러스 유사 입자에 적용될 수 있다고 생각합니다. QBeta 박테리오파지 발현 절차를 시작하기 전에 1:1 표백제:에탄올 용액으로 벤치 영역을 닦아냅니다. 무균 환경에서 E.coli BL21의 단일 콜로니를 SOB 배지에 추가하여 두 개의 3ml 스타터 배양을 만듭니다.

섭씨 37도, 상대 습도 0%의 방에서 밤새 250rpm으로 흔들어 배양물을 성장시킵니다. 다음 날, 셰이커에서 3밀리리터 스타터 배양물을 모두 제거하고 무균 환경에서 각 스타터 배양물을 1리터의 신선한 SOB 배지가 있는 2리터 당황한 삼각 플라스크에 붓습니다. 접종된 배지의 두 플라스크를 섭씨 37도 및 0% 상대 습도 방에서 250rpm의 셰이커에 놓습니다.

박테리아가 600나노미터 또는 OD 600에서 0.9에서 1.0의 광학 밀도에 도달할 때까지 성장시킵니다. 이 작업은 보통 5시간 정도 걸립니다. 배양액이 원하는 OD 600에 도달하면 P1000 피펫을 사용하여 각 플라스크에 1ml의 1몰 IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다.

셰이커의 플라스크를 따뜻한 방에 밤새 두십시오. 다음 날 아침, 셰이커에서 플라스크를 제거하고 각 플라스크의 내용물을 1리터 병에 옮긴 다음 섭씨 4도에서 중력의 20배, 621배로 1시간 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리가 완료되면 상층액을 약 5ml의 표백제가 든 플라스크에 부어 박테리아를 죽여 버리십시오.

세포 펠릿을 수집하려면 주걱을 사용하여 원심분리기 병 바닥에서 세포 펠릿을 긁어내고 펠릿을 50ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. QBeta 정제 절차를 시작하려면 각 세포 펠릿을 20-30 밀리리터의 0.1 몰 인산칼륨 완충액, pH 7로 다시 현탁시킵니다. 재중단에 덩어리가 없는지 확인합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 microfluidizer 프로세서를 사용하여 세포를 용해합니다. 입자의 수율을 증가시키기 위해 세포를 적어도 두 번 용해시킵니다. 용해물을 250ml 원심분리기 병에 넣고 섭씨 4도에서 중력 20, 621배로 1시간 동안 원심분리합니다.

상등액의 부피를 밀리리터 단위로 측정합니다. 그 값에 0.265를 곱한 다음 그 양을 황산 암모늄 그램 단위의 상등액에 추가합니다. 교반 막대를 추가하고 섭씨 4도에서 200rpm으로 교반 플레이트에서 최소 1시간 동안 교반하여 단백질을 침전시킵니다.

250밀리리터 병에 담긴 원심분리기는 20도에서 섭씨 4도에서 중력의 621배로 한 시간 동안 작동한다. 상등액을 버리고 펠릿을 약 40ml의 0.1몰 인산칼륨 완충액, pH 7로 다시 현탁합니다. 조잡한 샘플에 동일한 부피의 1 : 1 chloroform:n-Butanol을 추가하고 몇 초 동안 볼텍싱하여 혼합합니다.

혼합물을 38ml 튜브로 옮깁니다. 20, 621 회 섭씨 4도에서 30 분 동안 중력의 배로 원심 분리기. 피펫을 사용하여 상단 수성층을 회수합니다.

수성 층과 유기 층 사이에 형성된 젤 같은 층을 취하지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 6 개의 5-40 % 사전 제작 된 자당 그라디언트를 해동합니다. 각 그래디언트에 약 2ml의 추출물을 로드합니다.

99, 582 배 중력에서 섭씨 4도에서 16 시간 동안 자유 감속으로 초원심 분리기. 초원심분리가 완료되면 각 튜브 아래에 발광 다이오드 조명을 비추어 파란색 띠가 보이는지 확인합니다. 긴 바늘 주사기를 사용하여 이러한 입자를 회수하십시오.

2.5 시간 동안 섭씨 4도에서 370, 541 배 중력으로 입자를 울트라 펠릿화합니다. 정제된 입자의 결과 펠릿은 투명해야 합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 0.1몰 인산칼륨 완충액, pH 7로 다시 현탁합니다.

이 개략도는 시연될 접합을 보여줍니다. QBeta 1mg에 포함된 이황화물에 비해 10개의 Tris(2-carboxyethyl)phosphine 또는 TCEP를 사용하여 모든 이황화물을 환원시켜 1시간 내에 실온에서 환원된 QBeta 캡시드를 생성합니다. QBeta에서 이황화물을 환원시키기 직전에 새로운 TCEP 용액을 준비합니다.

0.002g의 TCEP와 1ml의 초순수를 용해시켜 100X 스톡 용액을 만듭니다. QBeta 1밀리리터당 5밀리그램 200마이크로리터를 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다. 그런 다음 20마이크로리터의 100X TCEP 스톡 용액을 마이크로 원심분리기 튜브에 추가합니다.

실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그 동안, 감소된 이황화물을 재가교하는 추후 반응을 위해 dibromomaleimide 폴리에틸렌 글리콜 또는 DB-PEG 용액을 준비합니다. 0.0017g의 DB-PEG를 100마이크로리터의 디메틸포름아미드에 용해시킵니다.

680 마이크로 리터의 10 밀리 몰 인산나트륨 용액, pH 5를 추가합니다. 다음으로, 환원된 QBeta를 DB-PEG 용액에 첨가하고 휴대용 365나노미터 UV 램프에서 혼합 과정을 관찰합니다. 혼합할 때 밝은 노란색 형광이 즉시 보여야 합니다.

룻밤 동안 로티세리에서 실온에서 반응을 진행하십시오. 다음날 아침, 3, 283 배 중력에서 3, 4 섭씨 온도에서 20 분 동안 2X PBS를 사용하여 원심 필터로 반응 혼합물을 정제합니다. 마지막으로, 비환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 천연 아가로스-겔 전기영동으로 접합을 모니터링합니다.

QBeta에 대한 DB-PEG의 접합은 UV 및 Coomassie blue 염색 하에서 비환원 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 확인되었습니다. 모든 형광 띠는 Coomassie blue staining과 함께 국소화되어 성공적인 접합을 나타냅니다. QBeta-PEG 접합체의 무결성은 천연 아가로스 젤 전기영동 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었습니다.

상단 현미경 사진은 QBeta-maleimide 또는 QBeta-M이고 하단 현미경 사진은 QBeta-PEG입니다. 0.1몰의 인산칼륨 완충액에서 QBeta-M 및 QBeta-PEG의 형광 분광법은 약 400나노미터의 최대 여기와 약 540-550나노미터의 방출 범위를 보여주었습니다. QBeta-PEG를 무혈청 DMEM 배지에서 마우스 대식세포 세포와 함께 배양한 후 뉴클레오스테인(nucleostaining)을 실시한 결과, 공동 국소화(co-localization) 이미지를 통해 노란색 형광 입자가 세포에 흡수되었으며 배양 4시간 후 추적할 수 있음을 확인할 수 있습니다.

대조적으로, 기능하지 않는 QBeta 바이러스 유사 입자는 무시할 수 있는 형광을 보입니다. 이 프로토콜은 연구자들이 4일 만에 QBeta를 정제하고 밤새 재가교 접합 반응을 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 접합 반응은 pH 5와 같은 산성 조건에서 가장 잘 작동한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 QBeta VLP를 정제하고 이황화 결합을 디브로모말레이미드 화합물과 다시 연결하여 형광 표지된 VLP를 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 연구원들에게 박테리오파지 QBeta의 외부 표면을 이중 기능화하는 데 사용할 수 있는 추가 기능 핸들을 제공했습니다.