Name: Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 배우세요 디브로모말레이미드-아 황산 화학을 이용해 Qβ 바이러스 같은 입자에 형광 PEGylation을 유도하는 생체결합 방법을. 이 기술은 세포 연구용 형광 프로브 개발에 활용됩니다.

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J.J.G.는 그들의 지원에 대 한 국립 과학 재단 (DMR-1654405) 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 (CPRIT) (RP170752s)을 인정 한다.

1입니다. 준비
<ol><li>Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 만들고 접시12부.</li>
	<li>
변환 BL21(DE3) wtQβ 외 투 단백질 시퀀스를 포함 하는 pET28 플라스 미드와.
	<ol>
<li>대장균 BL21(DE3) 유능한 세포를 얼음 목욕에 녹여 Microcentrifuge 튜브에서 셀의 장소 50 μ.</li>
		<li>1 개의 관으로 플라스 미드의 2 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 끄 적. 다음 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>열-충격 45 셀 정확히 42 ° c.에 있는 물 욕조에 s 열 충격 직후 얼음 욕조에 다시 튜브를 배치 하 고 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>어떤 항생제를 포함 하지 않는 파운드 미디어의 950 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 60 분 200 rpm에서 문화를 흔들어</li>
		<li>(대)와 파운드 한 천 배지에서 문화의 100 μ 접시 하 고 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어 필요할 때 백색 식민지를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슈퍼 최적의 국물 (흐 느낌) 미디어를 확인 합니다.
	<ol>
<li>압력솥 L 2 개의 삼각 플라스 크를 당황 하 게 제시카 주기.</li>
		<li>무 균 환경에서 밖으로 무게 추가 tryptone의 20.0 g, 5.0 g의 효 모 추출 물, 무수 황산 마그네슘의 2.469 g 0.584 g 염화 나트륨의 및 각 플라스 크에 염화 칼륨 0.186 g.</li>
		<li>볼륨 1 L를 함께 초순 각 플라스 크에 고압 액체 주기.</li>
		<li>흐 느낌 미디어는 압력가 마로 소독 후 실내 온도 도달 하면, 미디어의 각 리터를 대 (100 mg/mL)의 1 mL을 추가 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 m M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)을 확인 합니다.
	<ol>
<li>초순의 500 ml에서 이수소 칼륨 68.045 g을 용 해 하 여 1 M 칼륨 이수소 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>칼륨 초순 물 500 mL에 염기의 87.09 g을 용 해 하 여 1 M 칼륨 염기 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>1 리터 병에 칼륨 이수소 솔루션 및 칼륨 염기의 61.5 mL 38.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>7.00, 필요한 경우에 pH를 조정 하 고 1 나의 볼륨을</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 m M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)에 5-40% 자당 그라디언트를 확인 합니다.
	<ol>
<li>50 mL 원심 분리기 튜브에서 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)에 용 해 하는 5-40% (5% 단위로 증가) 자당으로 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>긴 바늘 주사기를 사용 하 여 38 mL 라운드-하단 폴 리 카보 네이트 튜브의 하단에 5% 자당 해결책의 3.3 mL를 입금 하 고 5 개의 다른 튜브에 대 한이 반복 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 3.3 mL 튜브의 하단에 10% 자당 해결책의 보증금과 그라디언트를 방해 하지로 바늘을 조심 스럽게 제거. 다른 5 개의 튜브를 반복 합니다. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>3.3 mL 레이어 자당 솔루션, 그라디언트를 방해 하지 않는 신중 하면서 각 관에서 40%로 15%에서 증가의 입금을 계속 합니다.</li>
	<li>완료 되 면, 호 기온 변화도의 정상을 커버 하 고-80 ° c.에 저장</li>
</ol>2입니다. Qβ의 표현
<ol><li>1:1 표 백제/에탄올 벤치 영역을 닦으십시오.</li>
	<li>무 균 환경에서 흐 느껴 울 다 미디어의 3 mL에 대장균 BL21(DE3)의 단일 식민지를 추가 하 여 무 균 환경에서 2 개의 3 mL 스타터 문화를 확인 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 0% 상대 습도 (rH) 룸에서 250 rpm에서 통에 하룻밤 성장.</li>
	<li>
개 자식 미디어에서 선발 문화 예방:
	<ol>
<li>두 3 mL 스타터 문화 셰이 커 고, 무 균 환경에서 2 중으로 각 시 동기 문화를 부 어 2 L 1 l 각 신선한 흐 미디어의 삼각 플라스 크를 당황 하 게.</li>
		<li>37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 통에 접종된 미디어를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 0.9-1.0에 도달할 때까지 37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 통에 박테리아를 성장.</li>
	<li>1 M 이소프로필 β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) P1000 피 펫을 사용 하 여 단백질 발현을 유도 하는 것의 1 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 셰이 커에는 미디어를 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>미디어에서에서 제거 흔드는 다음 아침 및 원심 분리기를 사용 하 여 1000 mL 병 20,621 × g에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 수확 합니다.</li>
	<li>
삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿을 수집 합니다.
	<ol>
<li>박테리아를 죽 일 백제의 약 5 mL로 플라스 크에는 상쾌한 하 거 라. 이것은 폐기물 이다.</li>
		<li>주걱을 사용 하 여 원심 분리기 병의 하단에서 셀 펠 릿을 긁 고 50ml 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 넣어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. Qβ의 정화
<ol><li>Resuspend 셀 펠 릿 ~ 20-30 mL의 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00).</li>
	<li>물의 resuspension 없는 덩어리는 다는 것을 확인 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 microfluidizer 프로세서를 사용 하 여 세포를 lyse ( 재료의 표참조). 입자의 수확량을 증가 시키기에 두 번 이상 세포를 lyse.</li>
	<li>4 ° c.에 1 시간에 250 mL 20,621 x g에서 원심 분리기 병에는 lysate 원심</li>
	<li>펠 릿을 삭제 하 고 상쾌한 ml에서의 볼륨을 측정 한다. 0.265로 그 값을 곱하면 고는 상쾌한 황산 암모늄의 g의 금액 추가.</li>
	<li>단백질에 밖으로 침전 시키기 위하여 200 rpm에서 저 어 접시에 적어도 1 시간에 4 ° C에서 저 어.</li>
	<li>20,621 x g 4 ° c.에 1 시간에 250 mL 병에서 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 약 10 mL의 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)와 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>몇 초 동안 vortexing에 의해 원유 샘플 및 혼합 1:1 클로 프롬/n-butanol 동등한 양의 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 30 분 동안 20,621 × g에서 38 mL 튜브에 원심</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 최고 수성 층을 복구 합니다. 수성 및 유기 층 사이 형성 했다 레이어 같은 젤을 사용할 않기로 주의 해야 합니다.</li>
	<li>6 5-40 %pre-made 자당 기온 변화도 녹여 고 약 2 mL에 각 추출의 로드 합니다.</li>
	<li>무료 감속으로 4 ° C에서 16 h 99,582 x g에서 ultracentrifuge.</li>
	<li>발광 다이오드 (LED) 조명 각 튜브 아래 빛나는 고 블루 밴드 표시 한다. 긴 바늘 주사기이 입자를 복구 합니다.</li>
	<li>Ultrapellet 370,541 x g 2.5 h 4 ° c.에 대 한에서 입자</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00) 순화 된 입자의 투명 한 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>4. 정량화 및 제품의 확인
<ol><li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 계량 제품13.</li>
	<li>실행 줄이고 비 감소 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제품14확인. 참고:; 외 투 단백질의 분자량을 확인 하는 데 사용은 SDS 페이지 감소 비 줄이는 SDS 페이지 더 높은 순서 구조를 확인 하는 것은.</li>
</ol>5. 어근 Qβ에 DB 화합물
<ol><li>
Qβ에 disulfides 줄일 수 있습니다.
	<ol>
<li>해산의 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) 초순 100 x 재고 솔루션의 1 mL에 phosphine (TCEP). 참고: 신선한 TCEP 감소 하기 전에 준비.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에 Qβ (5 mg/mL)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>100 x TCEP 재고 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 따라.</li>
		<li>1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다시 dibromomaleimide 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG DB)을 사용 하 여 감소 이황화 다리.
	<ol>
<li>Dibromomaleimide-폴 리 에틸렌 글리콜 (DB-PEG) DMF의 100 µ L의 0.0017 g을 분해.</li>
		<li>10 m m 나트륨 인산 염 해결책 (pH 5.00)의 680 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 DB-말뚝의 솔루션으로 Qβ를 감소 하 고 365 nm UV 램프에서 혼합 과정을 관찰. 밝은 노란색 형광 혼합 시 365 nm 휴대용 UV 램프로 즉시 구상 될 수 있다.</li>
		<li>하룻밤 실 온 (RT)는 불고기 집에 진행 하는 반응 하 게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심 필터 반응 혼합물을 정화 (COMW = 10 kDa) 세 번 사용 하 여 1 x PBS 3,283 x g에서 4 ° c.에서 20 분</li>
	<li>줄임으로써 비-SDS 페이지 및 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법은 활용을 모니터링 합니다. 참고: VLPs 네이티브 agarose 젤에 그대로 입자로 실행 하 고 그들은 그들의 충전, 크기와 모양에 따라 구분 됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

작은 단백질 정화에 비해, 살 균 소 Qβ 정화는 독특한 단계 자당 기온 변화도 원심 분리입니다. 클로 프롬/n-butanol 추출 단계 후 Qβ 5-40% 자당 기온 변화도 사용 하 여 더 순화 이다. 원심 분리, 중 입자는 그들의 크기에 따라 구분 됩니다. 더 큰 입자 작은 입자는 낮은 밀도 영역에 체류 하는 동안 더 높은 밀도 영역에 여행. Qβ는 그라데이션의 더 낮은 세 번째에 여행 하 고 더 작은 단백질 불순물은 원심 분리기 튜브의 상단에 갇혀 있는 동안 거기 남아 있다. Qβ의 콜 로이드 서 스 펜 션 보여줍니다 강한 Tyndall 자당에서 뿌리는 때 볼 수 있습니다 파란색 밴드 LED 빛에서 빛나고 아래. 이 밴드는 긴 주사기 바늘을 사용 하 여 추출 다음 쉽습니다. 자당에서 Qβ은 다음 수송과 ultracentrifugation에 의해 명확한 펠 릿을 양보. 펠 릿 원하는 버퍼에 resuspended 또는 더 빠른 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC)에 의해 순화 될 수 있습니다. SDS 페이지 결과 입자의 순도...

바이러스 성 capsids 나노 크기를 사용 하 여 생물 의학 연구1,2,3응용 프로그램의 범위를 확대 하는 것을 목표로 하는 흥미 진 진한 필드로 떠오르고 있다. Recombinantly 표현된 바이러스 같은 입자 (VLPs)는 구조적으로 바이러스에서 파생 된 하지만 그들은 그들에 게 비 전염 성 배치할 나노 입자를 만드는 원래 바이러스 유전 물질 부족 합니다. 표면 기능 프로그램 유전자는 고 각 capsid 앞뒤 사람에 게 동일 하 게 표현 된다, 위치 및 원자 정밀도로 아미노산의 반응 측면 체인의 수를 알아야 가능 하다. 대부분의 경우에서 외부와 실내 표면 bioconjugation 반응-는 biomolecule와 합성 사이 공유 결합을 형성 하는 반응을 통해 functionalized feasibly 수 있습니다 용 매 노출된 아미노산 잔류물의 많은 종류를가지고 분자4,5.
Bioconjugation 반응 생체의 비교적 간단한 패션에서 더 다양 한 기능을가지고 도움이 됩니다. 분자의, 치료 약6, 형광 태그7 등 폴리머8,9 미리 합성 하 고 특징 VLPs의 표면에 연결 하기 전에 수 있습니다. 생물 의학에서 특히 일반적인 VLP 바이오 소재 연구, recombinantly 표현으로 28 nm icosahedral 바이러스 성 capsid10살 균 소 Qβ에 따라 VLP 되었습니다. 비록 우리가 최근에 Haddleton 베이커 반응을 통해 Qβ의 숨 구멍 줄 감소 disulfides dibromomaleimide 화합물의 성공적인 활용11 전달 Qβ에 가장 일반적인 반응 사이트 넓은 여백에 의해 lysines 있습니다. 반응 좋은 진행 항복 하 고, 동등 하 게 중요 한 것은, 입자의 열 안정성을 잃고 없이. 동시에이 반응을 활용 유도 형광, 셀으로이 입자의 통풍 관을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다 생성 합니다. 이 작품에서는, 우리 Haddleton 베이커 반응, 밝은 노란색 fluorophore를 통해 Qβ의 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 활용을 보여 줍니다. 이러한 입자 세포에 의해 그들은 촬영으로 추적할 수 있습니다. 본 프로토콜 연구원 원리 용 노출된 disulfides 포함 된 많은 다른 VLPs 중 하나에 적용 되는 새로운 형광 PEGylated 배치할 나노 입자를 기반으로 Qβ, 생성 도움이 됩니다.

<table><tbody><tr><td>LB 브로스 (밀러)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>트립톤, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>무수 황산마그네슘</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(결정질/인증 ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 정수 시스템</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 단일염기</td><td>성 Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성 무수</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-부탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti 로터, 스윙 버킷, 알루미늄</td><td>Beckman Coulter</td><td>342204: SW 28 Ti 로터/ 342217: 버킷 세트</td><td></td></tr><tr><td>유형 70 Ti 로터, 고정 각도, 티타늄, 8 x 39 mL,</td> <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) 단백질 분석</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸에틸</td>렌디아민 <td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-디브로모말레이미드 97%</td> <td>시그마 알드리치</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>폴리틸렌 글리콜</td><td>알파 에자르</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>아크릴아미드/비스-아크릴아미드</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이</td>트 <td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnet 리볼버 조절 가능한 회전자&nbsp;</td><td>토마스 사이언티픽&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Sorvall 고성능 병, PC, 알루미늄 캡 포함&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 원심분리기 병(캡 포함), 폴리프로필렌 공중합체</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 둥근 바닥 튜브;38mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2L 좁은 입 삼각 플라스크(헤비 듀티 테두리 포함</td>) <td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 원심 필터 장치</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P 미세유체 변환기 재료 프로세서</td><td>미세유체역학</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 고속 폴리카보네이트 원형 바닥 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>병, 캡 어셈블리 포함, 폴리카보네이</td>트 <td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>실린더, 눈금 - 폴리프로필렌 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E 시리즈 증기 멸균기</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, 세포 배양 플레이트, 처리, PS, 96 웰, 뚜껑 포함</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Orbital Shaker</td><td>VWR Scientifc Products</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Handcast systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>분광형광계 NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>긴 바늘&nbsp;</td><td>해밀턴&nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 5-6cc 주사기 Luer Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>인텔 무게 PM-100 실험실 클래식 고정밀 실험실 저울</td><td>지능형 무게 기술</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX 겔, 10 well, 50 &micro; l</td><td>바이오 라드</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 pegylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

바이러스 같은 입자 (VLPs) 생물 의학에 있는 최근 증가 및 재료 연구 생 합성, 개별 크기, 유전자 프로그래밍 및 biodegradability의 그들의 용이 함에 표시 될 수 있습니다. 그들은 그들의 표면에 합성 ligands를 추가 하기 위한 bioconjugation 반응에 매우 의무가 있어, 이러한 수성 태어난된 capsids에 bioconjugation 방법론에서 범위 상대적으로 제한 됩니다. 촉진 하기 위해 기능성 생체 재료 연구의 방향, 비 전통적인 bioconjugation 반응은 고려 되어야 한다. 이 프로토콜에서 설명 하는 반응 dibromomaleimides를 사용 하 여 살 균 소 Qβ를 기반으로 한 VLP의 노출된 이황화 결합 용 매에서 새로운 기능을 소개. 또한, 최종 제품은 형광, 추적이 가능한 생체 외에서 프로브를 상업적으로 사용할 수 있는 필터 세트를 사용 하 여 생성의 이점이 있다 이다.

Dibromomaleimide 파생 상품 dibromomaleimide 무수 물 및 1 차 아민15사이 응축 반응을 통해 합성 될 수 있다. 또는 N-methoxycarbonyl 활성화 3, 4-dibromomaleimide를 사용 하 여 가벼운 합성 방법16 methoxypolyethylene 글리콜 (PEG) 수익률 DB-페그 (그림 1)에 반응 하 여 여기 악용 했다. NMR 화합물 구조 (그림 2)를 식별 하기 위해 사용 되었다. Qβ VLP는 28 nm icosahedral 배치할 나노, 180 동일한 외 투 단백질의 구성 되는 이다. 외 투 단백질에서 인접 한 외 투 단백질17β 시트와 그들의 α 나선형 도메인 통해 noncov...

여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

본 생체 접합법의 전반적인 목표는 이황화 결합을 포함하는 바이러스 유사 입자에 형광 기능화를 수행하는 것입니다. 이 방법은 기능화가 가능한 아미노산 잔기의 수가 제한적인 바이러스 유사 입자의 생체 접합 반응에서 핵심적인 질문들에 대한 해답을 제시하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단 한 번의 반응을 통해 새로운 기능기 도입과 접합 유도 형광체 형성을 동시에 수행할 수 있다는 점입니다. Q-Beta 외에도, 본 반응은 이황화 결합을 보유한 모든 바이러스 유사 입자에 적용 가능할 것으로 판단됩니다.Q-Beta 박테리오파지를 발현시키는 절차를 시작하기 전, 1:1 비율의 표백제:에탄올 용액으로 벤치 영역을 닦아냅니다. 무균 환경에서 E.coli BL21 단일 콜로니를 SOB 배지에 첨가하여 3 mL 스타터 배양액 두 개를 만듭니다. 배양액을 37 °C, 상대습도 0%인 배양실에서 250 rpm으로 진탕하며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 진탕기에서 3 mL 스타터 배양액 두 개를 꺼내어 무균 환경에서 각각의 스타터 배양액을 1 L의 신선한 SOB 배지가 담긴 2 L 배플 삼각 플라스크에 붓습니다. 접종된 배지가 담긴 플라스크 두 개를 37 °C, 상대습도 0%인 배양실의 진탕기에 놓고 250 rpm으로 배양합니다. 박테리아가 600 nm에서의 광학 밀도 또는 OD 600 값이 0.9에서 1.0에 도달할 때까지 배양합니다. 이는 보통 약 5시간이 소요됩니다. 배양액이 원하는 OD 600 값에 도달하면, P1000 피펫을 사용하여 각 플라스크에 1 M IPTG 1 mL를 첨가하여 단백질 발현을 유도합니다. 플라스크를 온실 내 진탕기에 두고 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날 아침, 쉐이커에서 플라스크를 꺼내 각 플라스크의 내용물을 1L 병으로 옮긴 후, 4°C에서 20,621 ×g로 1시간 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 원심분리가 완료되면, 박테리아를 사멸시키기 위해 약 5mL의 표백제가 들어 있는 플라스크에 상층액을 부어 버립니다.세포 펠릿을 수집하려면, 스패튤러를 사용하여 원심분리 병 바닥에서 세포 펠릿을 긁어낸 후 50-milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다.Q-Beta 정제 절차를 시작하려면, 각 세포 펠렛을 20~30 mL의 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7)으로 재현탁합니다. 이때 재현탁액에 덩어리가 없는지 확인하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 마이크로플루이다이저(micr

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

형광단 개발 및 이미징 기술, 바이러스가 바이러스와 세포 사이의 초기 상호 작용을 시각화하기 위해 고안되었다 뎅그열의 알렉사 플루어 라벨링의 간단한 방법에있는 발전을 활용.

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공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

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표면에 비리온의 부착은 슈퍼 해상도 형광 화상 진찰 또는 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의한 단일 virion 화상 진찰을 위한 요구 사항입니다. 여기서 우리는 AFM 및 초분해능 형광 이미징에 사용하기에 적합한 유리 표면에 대한 비온의 제어 접착을 위한 샘플 준비 방법을 시연한다.

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여기서는 밀 배아 기반 체외 번역 시스템에서 합성된 YFP 태그 Gag와 전기 형성 기술로 준비된 GUV를 사용하여 HIV-1 Gag와 지질막 간의 상호 작용을 시각적으로 분석하는 시험관 외 막 결합 분석을 설명합니다.

거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화

우리 theranostic 나노 (HEVNP)으로 간염 E 바이러스 capsid 단백질을 설계 했습니다. HEVNP 자동으로 안정 된 icosahedral 점 막 배달에 조립. 여기, 시스테인, 특히 종양 세포를 묶는 합성 ligands 켤레를 표면 노출 잔류물을 변경 하 여 대상으로 하는 종양에 대 한 HEVNPs의 수정을 설명 합니다.

간염 E 바이러스 나노 화학 활용 방법을 사용 하 여의 표면 기능화

여기에 설명 된 프로토콜 연구자를 특별히 선택 된 사이트에 아 데 노비 루스 capsids 간단한 화학 수정에 있습니다. 차폐 된 아 데 노 바이러스 벡터 입자 대상이 유전자 전달 벡터 생성 될 수 있습니다, 그리고 벡터 호스트 상호 작용은 공부 될 수 있다.

차폐 및 타겟팅에 대 한 유전과 화학 Capsid 수정 아 데 노비 루스 기반 유전자 전달 벡터의 결합

여기에 제시된 것은 형광 이미징 접근법, D NA, RNA및 protein (MICDDRP)의 궁극적 인 형광 C ell 기반dtection을위한 프로토콜이며, 이는 바이러스 단백질 및 다양한 유형 및 가닥의 핵산의 동시 형광 단일 세포 시각화가 가능한 방법입니다. 이 접근법은 다양한 범위의 시스템에 적용될 수 있습니다.

바이러스 핵산 및 단백질을 시각화하고 HIV, HTLV, HBV, HCV, 지카 바이러스 및 인플루엔자 감염을 모니터링하기 위한 단일 세포 다중화 형광 이미징

배우세요 디브로모말레이미드-아 황산 화학을 이용해 Qβ 바이러스 같은 입자에 형광 PEGylation을 유도하는 생체결합 방법을. 이 기술은 세포 연구용 형광 프로브 개발에 활용됩니다.

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

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