2018년 6월 20일
이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.
이 방법은 지방산 산화와 같은 신장 대사에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 신장 섬유증 및 기타 다양한 신병증의 발병과 밀접한 관련이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량 플랫폼을 사용하여 신장 세뇨관 상피 세포에서 미토콘드리아 생체 에너지를 조절하는 화합물을 스크리닝하는 것입니다. 이 기술의 의미는 신장 상피 세포에서 미토콘드리아 대사를 조절하는 화합물의 높은 전체 스크리닝을 허용하기 때문에 신장 대사 질환 치료로 확장됩니다.
콜라겐으로 코팅된 60mm 페트리 접시를 준비하려면 미리 여과된 20밀리몰 아세트산 2밀리리터와 콜라겐 I 용액 35마이크로리터를 각 접시에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 배양하고 자연 건조시킨 다음 UV에 노출시킵니다. 다음으로 PBS를 사용하여 아세트산 잔류물을 헹굽니다. 세 번 헹굽니다.
그런 다음 접시를 섭씨 37도의 이산화탄소가 없는 세포 배양 인큐베이터에 보관합니다. 쥐의 수술을 준비한 후 제모 크림을 사용하여 가슴과 복부의 털을 제거합니다. 그런 다음 요오드로 피부를 소독하고 요오드 잔여물을 닦아냅니다.
다음으로 절개를 하여 복강을 열고 심장과 신장을 노출시킵니다. 이제 분당 32밀리리터로 관류 펌프를 설정하고 관류를 시작하기 전에 튜브의 기포를 제거합니다. 라인 끝에 27게이지 바늘을 사용하십시오.
계속 진행하려면 심장 정점을 통해 좌심실에 바늘을 삽입하십시오. 완충액이 심장을 채우자마자 우심방에 구멍을 뚫어 관류 완충액을 위한 출구를 만듭니다. 그런 다음 분해 버퍼로 전환하고 분해를 위해 펌프 속도를 분당 30밀리리터로 약간 줄입니다.
20ml의 소화 완충액을 관류한 후 세뇨관 세포 분리를 위해 양쪽 신장을 제거합니다. 적출된 신장을 처리하려면 먼저 신낭과 수질을 제거해야 합니다. 그런 다음 양쪽 신장을 작은 조각으로 다진 다음 섭씨 37도의 오븐에서 5분 동안 부드럽게 회전하면서 10ml의 소화 완충액으로 배양합니다.
분해 후 70미크론 필터를 통해 버퍼를 통과시켜 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 분해된 조직을 채취한 후 배양 배지 10ml를 첨가하여 소화를 멈춥니다. 다음으로, 여과된 조직 현탁액을 50g에서 5분 동안 원심분리하여 세뇨관 세포를 펠릿화합니다.
그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 5ml의 배양 배지를 추가한 다음 원심분리를 반복하여 남아 있는 세뇨관 세포를 수집합니다. 이제 첫 번째 펠릿을 20ml의 배양 배지에 재현탁시키고 50g에서 5분 동안 원심분리하여 수집된 세포를 추가로 정제합니다. 상층액을 폐기하십시오.
그런 다음 두 펠릿을 10ml의 배양 배지에 재현탁시킵니다. 다음으로, 트리판 블루 염색을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다. 그런 다음 최대 1,000만 개의 세포를 60mm 콜라겐으로 코팅된 접시에 파종하고 세뇨관 세포가 밤새 부착되도록 합니다.
먼저 P1 세뇨관 세포를 40, 000 세포에서 콜라겐으로 코팅된 새로 준비된 96웰 마이크로플레이트의 웰에 파딩합니다. 웰당 100마이크로리터의 배양 배지를 사용하십시오. 세포외 플럭스 분석에서 세포 밀도와 화합물 농도를 최적화하는 것은 성공적인 실험의 핵심입니다.
최적의 세포 밀도와 화합물 농도를 식별하기 위해 파일럿 적정 실험을 권장합니다. 다음으로 센서 카트리지에 수분을 공급합니다. 먼저 센서 카트리지를 들어 올리고 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 교정 용액을 채웁니다.
그런 다음 카트리지를 재배치하여 센서를 담그고 섭씨 37도에서 밤새 어셈블리를 배양합니다. 다음 날, 기존 배지를 흡인하고 175마이크로리터의 포도당 또는 지방산 분석 배지로 교체합니다. 그런 다음 이산화탄소 없이 한 시간 동안 배양을 계속합니다.
세포 배양 중에 카트리지의 포트 A에 25마이크로리터의 올리고마이신을 넣고, 포트 B에 FCCP를 넣고, 포트 C에 로테논/항마이신 A를 넣고, 포트 D와 다른 모든 포트에 물을 넣습니다. 이제 설정이 보정할 준비가 될 때까지 카트리지를 이산화탄소가 없는 인큐베이터에 보관합니다. 세포외 플럭스 분석기와 컨트롤러를 켜서 진행합니다.
그런 다음 분석기 소프트웨어를 열고 표준 분석을 선택한 다음 분석 마법사 옵션을 누릅니다. 그런 다음 Compounds(화합물) 탭에서 화합물을 적절한 포트에 할당합니다. Background Correction(배경 보정) 탭에서 세포가 없는 웰을 선택합니다.
그런 다음 Groups and Labels 탭을 사용하여 실험 그룹에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 프로토콜 탭에서 사용 가능한 명령을 사용하여 적절한 혼합 및 측정 주기를 설정합니다. 이러한 설정은 텍스트 프로토콜에 표시되며, 입력되면 나중에 사용할 수 있도록 템플릿을 저장합니다.
이제 마법사 끝내기를 눌러 계속 진행하십시오. 이제 시작을 눌러 보정을 시작합니다. 그런 다음 분석기는 플레이트 홀더를 꺼내고 카트리지 플레이트를 삽입하라는 메시지를 표시합니다.
이 보정 프로세스를 완료하는 데 20-25분이 걸립니다. 시스템이 보정되면 프롬프트 명령을 눌러 보정 플레이트를 셀 플레이트로 교체하고 실행을 계속합니다. 실행이 완료되면 OCR 데이터를 저장하고 분석기에서 플레이트를 제거합니다.
이제 각 분석 웰에 Hoechst를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 355나노미터 여기와 460나노미터 방출을 사용하여 세포를 계수하고 OCR 데이터를 세포 수로 정규화합니다. 이 프로토콜에서는 이질적인 신장 세포 집단, 불완전하게 소화된 세뇨관 및 기타 조직 파편을 콜라겐 코팅된 플레이트에서 배양했습니다.
분리 다음 날, 배양 배지를 원심분리하여 파편을 제거하고 세뇨관 세포를 다시 도금했습니다. 그 후, 세포는 더 쉽게 부착되었고, 배양 5일째에는 80-90%의 포화도에 도달했습니다. 그런 다음 신장 TEC는 하위 배양되어 1주일 이내에 합류점으로 성장했습니다.
다음 두 통로에서도 비슷한 성장이 일어났다. 세포의 단층은 돔 형성을 취하여 플레이트에서 들어 올려지고 단단한 접합부에 의해 부착 된 상태를 유지합니다. 분리된 1차 TEC의 미토콘드리아 호흡은 설명된 대로 다양한 도금 밀도에서 OCR의 설명된 세포외 플럭스 분석을 사용하여 측정되었습니다.
더 중대한 조밀도에 도금된 세포에는 OCR에 있는 비례적인 증가가 있었다. 우물 당 40, 000개의 세포는 다른 어떤 도금 조밀도 보다는 판의 표면을 잘 덮었, 따라서 세포와 화합물 사이 상호 작용을 시험하기 위하여 최선 농도에게 했다. 예를 들어, 지방산 기질을 함유하는 배지를 해당작용 억제제인 2DG와 함께 TEC에 적용하여 1차 및 2차 계대에서 TEC의 지방산 산화를 직접 평가했습니다.
이 절차를 시도하는 동안 항상 각 유정의 정확한 부피와 농도를 기록하는 것이 중요합니다. 성분의 최종 농도가 변경되면 전체 실험이 실패할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신장학 분야의 연구자들이 다양한 신병증의 발병기전에서 세뇨관 지방산 대사의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.
이 프로토콜은 마우스 1차 신장 관상세포를 분리하고 특성화하기 위한 비용 효율적인 접근 방식을 제공하며, 이후에는 미토콘드리아 생체에너지 대사를 포함한 신장 생물학적 기능을 평가하기 위해 세포를 재배양할 수 있습니다.
High-throughput extracellular flux analysis of primary mouse renal tubular epithelial cells enables robust interrogation of mitochondrial bioenergetics, a critical determinant in renal disease pathogenesis. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for metabolic pathways implicated in chronic kidney disease. The protocol's scalability and reproducibility position it as a foundational capability for renal metabolism-focused drug discovery portfolios.
This protocol integrates from early discovery through lead identification, supporting both target validation and compound screening in renal metabolism research.