Name: 마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립 및 특성 분석 방법을 통해 세포 외 유출 분석으로 미토콘드리아 생체에너지를 평가하고 신대사 질환 치료 연구에 활용하는 고처리량 스크리닝 기술을 익히세요.

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이 작품을 리 나 A. Shehadeh 다음 교부 금에 의해 지원 되었다:는 건강의 국립 연구소 (R56HL132209 및 1R01HL140468)와 마이애미 심장 연구소.

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회 마이애미 대학에서 NIH 지침 준수에 의해 승인 되었다.
1. 플레이트 코팅 및 시 약의 준비
<ol><li>콜라겐 코팅을 준비:<ol>
<li>콜라겐의 35 μ 추가 나 단일 60 mm 페 트리 접시에 미리 필터링 된 20 m m 초 산 솔루션의 2 mL. 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어, 건조 하 고 자외선에 노출.</li>
		<li>워시 코팅 어떤 산 성 잔류물을 제거 하 고 37 ° C CO2저장에 PBS 가진 3 배-무료 셀 문화 인큐베이터 셀 시드를 위한 준비가 될 때까지. 콜라겐 코팅의 최종 농도 5 μ g/c m2입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>관류 버퍼 준비: 30 ml PBS의 페니실린-스 (P/S)의 300 μ를 추가 하 고는 격리 시작 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 혼합 따뜻한.</li>
	<li>소화 버퍼 준비: 3.9 mg PBS의 30 mL에 콜라 타입 2의 분해, 0.2 μ m 병 상위 필터를 통해 솔루션을 필터링 및 격리 시작 될 때까지 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한 그것.</li>
	<li>세포 배양 준비:<ol>
<li>실내 온도에 보충 교재를가지고. 여과 없이 추가 보충 (0.05 mL 태아 송아지 혈 청, 표 피 성장 인자, 인슐린, 피 네 프 린, 날린, 올려진다의 5 μ g/mL 및 triiodo-L-thyronine의 4 pg/mL의 36 ng/mL의 0.5 μ g/mL의 5 μ g/mL의 10 ng/mL)의 신장 500 mL를 상피 세포 성장 기저 미디어 2입니다.</li>
		<li>37 ° C 물 목욕 사용 준비가 될 때까지 미디어를 따뜻한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>혼합물 준비: 50mm FCCP 준비, 10 m m로 테 논, 10mm oligomycin, 10 m m antimycin A, 50 m L-carnitine, m 및 50 mM etomoxir, DMSO, aliquot에서 모든 솔루션을 재고 하 고-20 ° c.에 화합물을 저장</li>
	<li>2.5 m m 나트륨 물 150 m m NaCl 솔루션의 220 mL에서 준비 하 고는 물 완전히 해산 때까지 75 ° C 물 욕조에 솔루션을 따뜻하게.</li>
	<li>소 혈 청 알 부 민 (BSA) 준비: 0.34 m m 지방 없는 BSA 150 mM NaCl의 250 mL에서 준비. 제어 BSA 다음 단계 1.8에 의해 준비 될 수 있는 팜 BSA 솔루션에 대 한 부정적인 컨트롤 역할을 합니다.</li>
	<li>켤레 BSA (팜-BSA)에 물:<ol>
<li>추가 물 솔루션 점차적으로 BSA 솔루션에는 여전히는 뜨겁다 동안. 그런 다음 pH 7.4 조정 하 고 완료를 활용 하려면 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 그들을 믹스.</li>
		<li>활용이 완료 되 면 솔루션에 150 mM NaCl의 또 다른 150 mL을 추가, 잘, 그것을 혼합 및-20 ° c.에 aliquots 저장 최종 솔루션 BSA는 물 및 0.17 m m 1 m m 나트륨을 포함 하 고 셀 세포 외 유출 지방산 기반 분석 결과에 대 한 지방산 기판으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 외 유출 분석 결과 기저 미디어 준비:<ol>
<li>압력가 dH2O의 1 l DMEM 분말 1 봉지와 200 mm L-글루타민 (마지막 4 m m) 20 mL를 추가 하 고 부드럽게 그들을 믹스.</li>
		<li>생체 실험의 날, 포도 당 또는 지방산 기반된 호흡 분석 결과에서 사용 될 세포 외 유출 분석 결과 미디어의 후속 준비를 위한 준비 기저 미디어를 100 µ M 나트륨 pyruvate를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포도 당 기반 미디어 준비:<ol>
<li>분해를 통해 세포 호흡 능력을 측정 하기 위해 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 17.5 m m 포도 당 분말, 100 µ M 제어 BSA (에 설명 된 대로 단계 1.7), 및 (지방산 산화를 억제)를 20 µ M etomoxir을 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지방산에 기초를 둔 미디어 준비:<ol>
<li>지방산 산화를 통해 세포 호흡 능력을 측정, 추가 10 mM 2D 포도 당 분말 (포도 당 분해를 억제 하기 위해 아날로그), 100 µ M L-carnitine 기저 미디어 단계 1.9에서에서 위에서 설명한 팜-BSA (에서 설명한 단계와 1.8), 및 100 µ M.</li>
		<li>37 ° C에서 미디어를 warm, pH 7.4를 조정 하 고 그것은 세포 외 유출 분석 결과에서 사용 될 때까지 37 ° C 물 욕조에 그것을 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 관류, 소화와 쥐에서 신장 수확
<ol><li>Anesthetize isoflurane 흐름 마우스 및 부정사 위치에 수정. 고립만 동물의 righting 반사 손실 후에 마 취 깊이 핀치 평가 전과 절차22중 atraumatic 집게를 사용 하 여 모니터링 시작 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>모피, 그것의 복 부 영역에 마우스의 가슴에서 depilatory 크림을 사용 하 여 제거, 요오드, 소독 하 고 요오드 잔여물을 닦아.</li>
	<li>절 개 가슴에, 전체 복 부 영역을 열고 하는 피부를 잘라 만들고 심장 및 신장 노출.</li>
	<li>32 mL/min에서 관류 펌프 고에 튜브는 관류를 시작 하기 전에 모든 거품을 제거 합니다.</li>
	<li>버퍼는 마음을 채우고 자 마자 심장 꼭대기를 통해 좌 심 실에 27 G 바늘을 삽입 하 고 찌를 관류 버퍼 심장 펌프도 순환 하 고 결국 오른쪽 아 트리 움 출구에서 제거 되 면 출구를 만들려고 오른쪽 아 트리 움.</li>
	<li>재 관류 후 30 mL/min 소화 펌프 속도 전환.</li>
	<li>소화의 20 mL 후 버퍼 꼭대기 통해 끼얹는다는, 둘 다 신장 관 세포 격리에 대 한 제거.</li>
</ol>3. 조직 처리 및 기본 관 세포 격리
<ol><li>신장 캡슐과 수 질을 제거 하 고 작은 조각으로 모두 신장 말하다 부드러운 회전 5 분 동안 37 ° C 오븐에서 소화 버퍼의 10 ml에서 그들을 품 어.</li>
	<li>70 μ m 필터를 통해 버퍼를 전달 하 여 어떤 소화 되지 않은 신장 조직을 제거 합니다. 소화를 막으려고 문화 미디어의 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>관 세포를 수집, 필터링 된 셀 서 스 펜 션 5 분 첫 번째 펠 릿 수집 50 x g에서 원심. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 배양 기, 원심 분리기 관의 모든 셀을 보장 하기 위해 5 분 동안 50 x g에서 두 번째 펠 릿으로 수집의 5 mL을 추가. 원심 분리는 주로 작은 무거운 tubules를 낮은 속도로. 나중에, 세포는 고립에서 복구, 후 순수 관 문화는 높은 속도에서 하위 문화 중 centrifuged.</li>
	<li>문화 미디어의 20 ml에서 첫 펠 릿을 resuspend 하 고 수집 3 펠 릿을 5 분 동안 50 x g에서 원심.</li>
	<li>문화 미디어의 1 mL에 두 번째 및 세 번째 펠 릿을 resuspend. Trypan 파랑의 10 µ L로 세포 현 탁 액의 혼합 10 µ L A 세 슬라이드와 기록 자동에서 세포 생존 세포 카운터 ( 재료의 표참조)의 챔버로 혼합물을 로드 합니다.</li>
	<li>씨앗 107 셀 (이종 인구) 한 60 mm 접시에까지 미리 콜라겐으로 코팅 하 고 하룻밤 연결 관 세포.</li>
</ol>4. 주 관 세포 하위 문화 및 특성화
<ol><li>분리 후 1 일 문화 미디어를 수집 하 고 어떤 부동 tubules를 펠 렛을 5 분 동안 50 x g에서 원심. 상쾌한을 제거 하 고 신선한 문화 미디어와 같은 문화 접시에 다시 접시의 4 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
	<li>하루에 4 분리 하 여 후, 오래 된 문화 미디어를 제거 하 고 신선한 미디어 추가.</li>
	<li>격리 후 7 일에 0.25 %trypsin-EDTA 반응을 중지 하 고 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집 문화 미디어의 5 분 추가 3 ml 2 mL에 37 ° C에서 배양 하 여 세포를 분리 합니다.</li>
	<li>하위 문화 및 p1 P0에서 셀 특성, 24-잘 접시에 잘 당 씨 5000 셀 코팅 콜라겐과 내가 위에서 설명한 대로.</li>
	<li>단계 4.4 후 24 h 4% p 1에서 셀을 수정 10 분, PFA 0.2% 그들을 permeabilize Triton X-100 3 분, 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단.</li>
	<li>희석, 1: 100에 10%를 각각 다음 단백질의 DS: 인접 관 마커 angiotensinogen (AGT)와 aquaporin 1 (AQP1); 원심 관 마커 E-cadherin; mesangial 마커 CD90/Thy1; 그리고 대 식 세포 마커 EGF 같은 모듈 포함 하 mucin 같이 호르몬 수용 체-1 (f 4/80) 및 차별화 68의 클러스터 (CD68), 그리고 같은 4 ° c.에 하룻밤 세포와 그들을 품 어</li>
	<li>다음날, 검출 어떤 얼룩을 사용 하 여 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 이미지를 걸릴.</li>
	<li>3 일, p 1의 하위 문화 후에 단계 4.5에서에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화 및 p 2에서 특성화에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>다음날 3 p 2의 하위 문화에 4.5 단계에서 설명한 관, mesangial, 및 macrophage 마커 얼룩 하위 문화와 특성화 P3에 대 한 셀 분리 합니다. 그림 2A와 같이 마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 검사 법에서 얼룩 이미지.</li>
	<li>조직 얼룩 준비:<ol>
<li>냉동된 야생-타입 및 실 온에서 1 h에 대 한 Col4a3-/- 신장 슬라이드 건조 하 고 그들을 수정 4%와 10 분 대 한 PFA Permeabilize 그들 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분 동안 실 온에서 1 h에 대 한 10% 당나귀 혈 청 (DS)와 그들을 차단 하 고. 1: 200에서 4.5 단계에서 설명한 마커 단백질에 대 한 항 체를 추가 하 고 4 ° C에서 밤새 그들을 품 어.</li>
		<li>다음 날, 1: 200-토끼, 반대로 마우스, 또는 반대로 쥐 형광 이차 항 체 45 분으로 어떤 얼룩을 감지 합니다. 그림 2B 와 2c마커의 식을 확인 하는 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과
<ol><li>20000, 30000, 또는 96-잘 microplate에 문화 미디어의 100 μ에 잘 당 40, 000 셀 씨 P1 관 세포 중 코팅 5 μ g/c m2 콜라겐과 난 세포 외 유출 분석 실험 전날.</li>
	<li>센서 카트리지 수 화에 대 한 센서 카트리지 들어올린 각 채우기 교정 솔루션의 200 μ와 접시의 잘. 신중 하 게 카트리지를 로드 다시 교정 솔루션에 센서를 잠수함. 적어도 사용 전에 h 7에 대 한 CO2 없이 37 ° C 오븐에 카트리지를 넣습니다. 최상의 결과 얻으려면 하룻밤 카트리지 수 화 것이 좋습니다.</li>
	<li>화합물을 준비: 8 µ M oligomycin, 9 µ M FCCP, 그리고 포도 당 (1.10 단계에서 설명)과 지방산 (에서 설명한 단계 1.11) 세포 외 유출 분석 결과 미디어에서 20 µ M로 테 논/antimycin A 혼합 준비.</li>
	<li>미디어 변경: 셀 문화 미디어 발음, 포도 당 또는 지방산 분석 결과 미디어의 175 µ L 추가 (은 화합물에 따라, 근무 중인 단계 참조 5.3), 고 37 ° C 공동2에서 1 시간에 대 한 그들을 품 어-무료 보육.</li>
	<li>다음 화합물의 25 µ L 카트리지 포트 로드: 8 μ M oligomycin 포트 A 1 µ M의 최종 농도 달성 하기 위한 (참고: 각 잘 미디어의 175 µ L 포함 됩니다, 화합물 희석된 8 얻을 것 이다 x), 9 μ M 1의 최종 농도 달성 하기 위해 포트 B FCCP µ M (참고: 화합물 희석된 9를 얻을 것 이다으로 각각 잘 포함 미디어의 175 µ L 플러스 포트 A에서 주입 솔루션의 25 µ L, x), 그리고 20 µ M로 테 논/antimycin A 포트 C (참고 각 화합물에 대 한 2 µ M의 최종 농도 달성 하기에 : 화합물 희석된 10를 얻을 것 이다 미디어의 175 µ L 플러스 50 µ L A와 B 포트에서 주입 하는 솔루션의 각 잘 포함 됩니다, x).</li>
	<li>포트 D에 있는 모든 우물과 배경 웰 스 (셀)의 다른 모든 포트에 물을 추가 합니다. 37 ° C 공동2카트리지를 품 어-10 분 동안 무료 보육.</li>
	<li>세포 외 유출 분석기와 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>분석기 소프트웨어를 열고 다음 프로토콜을 입력:<ol>
<li>표준 분석 결과선택 합니다. 분석 결과 마법사를 누릅니다. 화합물 탭을 사용 하 여 복합 레이아웃을 할당 하 고 실험적인 그룹을 그룹 및 레이블 탭을 사용 하 여. 배경으로 (셀) 없이 빈 우물을 할당 하도록 하십시오.</li>
		<li>프로토콜 탭에서 표 1에 표시 된 대로 사용할 수 있는 명령을 사용 하 여 다음 믹스 및 측정 주기 설정: 보정, 믹스 2 분, 2 분, 대기 3 분을 위한 측정 (이 사이클을 반복이 2-3 배); 포트 A, 2 분 대 혼합을 주사, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 B를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 주기 반복 2-3 배); 포트 C를 주입, 2 분 동안 혼합, 2 분, 3 분에 대 한 측정에 대 한 대기 (이 사이클을 반복 2-3 배). 결국 마법사를 누릅니다. 그것은 또한 나중에 사용할 현재 서식 파일을 저장할 수입니다.</li>
		<li>보정을 시작 하려면 시작 을 누릅니다. 분석기 자동으로 배출 플레이트 홀더 그리고 카트리지 플레이트를 삽입에 대 한 요청.</li>
	</ol>
</li>
	<li>교정 단계 이루어집니다 (일반적으로 20-25 분), 셀 접시에 카트리지 플레이트를 변경 하 고 실행을 계속 하려면 프롬프트 명령을 누릅니다.</li>
	<li>실행이 완료 되 면 데이터를 전송 하 고 96 잘 접시를 제거 합니다. 분석 결과 우물의 각 Hoechst (1:1, 000)를 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 그들을 품 어 355 nm 여기와 460 nm 방출에서 읽고 Hoechst 형광의 측정에 의해 세포 수를 OCR 데이터를 정상화.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 수 없다.

우리 마우스 신장 관 상피 세포 (TECs)의 효율적인 절연을 허용 하는 프로토콜을 최적화 하 고 그 셀 하위 존재 지방산-미토 콘 드리 아 호흡을 평가 하는 세포 외 유출 분석에 대 한 교양 있을 수 있습니다 보였다 또는 포도 당-기반 기판입니다. 이 프로토콜 인접 및 원심 관 세포에 초점을 맞추고 연구 설계 및 TEC 병리학 관련 신장 질병의 이해에 대 한 더 복잡 한 실험을 구축 하는 프레임 워크 역할. 이전에 게시 프로토콜9,,1019에 비해,이 필요 하지 않습니다 긴 원심 분리 시간 또는 충분 한 항 체 사용 그라데이션 분판을 정렬 방법과, 따라서, 더 많은 제공 합니다. 신장 관 대사 분야에서 일 하는 연구원에 대 한 효율적이 고 최적화 된 가이드. 소화, 다시 컬렉션 및 도금 밀도 세포 외 유출 분석 결과 대 한 복합 최적화를 포함 하 여이 프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계가 있다.
콜라와 최적 농도의 올바른 유형을 선택 신장 조직에서 성공적인 소화 관 세포의 분리에 열쇠 이다. Collagenases의 다른 종류에 비해, 2 형 콜라 효소 활동, 소형 신장 구조를 해리의 능력의 상대적으로 높은 수준을 포함 합니다. 장기 관류와 소화 시간 오염 가능성을 최소화 하려면 0.013 %2 형 콜라는 30 mL/min에 끼얹는다. 신장 캡슐 두 신장 동물에서 수확 하 고 멸 균된 셀 문화 후드로 전송 했다 후에 제거 되었다. 신장 작은 조각으로 다진 했다 고 소화 버퍼를 완전 한 소화 관 세포의 최대한 출시에 대 한 또 다른 5 분의 10 mL와 함께 그들의 부 화를 계속 했다.
하지만, 소화, 후 조직 정지는 매우 큰 조직 조각을 제거를 70 µ m 필터를 통해 전달 됩니다, 아직 소화 되지 않은 tubules 필터를 통과 하 고 세포 현 탁 액 내 문화 접시에 도금을 얻이 있을 것입니다. 그것은 이러한 tubules를 관 세포를 문화 접시를 단단히 연결에 대 한 정상 보다 더 긴 시간이 걸립니다. 따라서, 세포 현 탁 액을 수집 하 여 작은 첨부 되지 않은 tubules 및 셀 셀 도금 후 두 번째 날을 원심 오히려 중요 하다. 이 저속 원심 분리 단계는 더 관 세포 보다는 다른 세포 유형 제거 하 고 첨부 되지 않은 tubules 및 관 세포 정착.
적절 한 셀 밀도의 식별 성공적인 세포 외 유출 분석 결과 대 한 첫 번째 주요 단계입니다. 결과 XF96 microplate에 잘 당 40, 000 셀 기본 관 셀 지방산과 포도 당 기반 호흡 분석 결과 (그림 3C)에 대 한 이상적입니다 나타났다. 이 프로토콜에서 격리 된 관 세포 구절 1과 2에서 세포 외 유출 분석 결과 대 한 사용 되었다. 하위 3, 비록 그들이 유지 관 표식 (그림 2)와 (그림 3A), 생체 분석 실험에서 괜찮은 성능을 표현의 통로 2에 비해 감소 기저 호흡 수준을 보여주었다 통로를 경작 하는 세포 ( 그림 3C를 그림 3A 의 오른쪽 패널에서 OCR을 비교 하 여 표시). 이 감소는 (예를 들어 젊은 야생-타입 마우스에서 고립 된 사람) 실질적으로 건강 한 관 세포에 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 그러나, 이미 저하 미토 콘 드리 아 호흡 CKD 마우스 모델에서 격리 하는 셀에 대 한 연구, 대 한 세포의 높은 구절 기저 호흡 세포 외 유출 분석 결과의 결과 영향을 미칠 것 이라고 더 감소를 발생할 수 있습니다. 연구에서 통로 1 및 보여준 높은 통로 2 기저 호흡 수준에서 세포, 실시. 따라서,이 프로토콜에 따라 모두 건강 하 고 병에 걸린 동물에서 분리 된 세포와 미토 콘 드리 아 호흡 연구에 대 한 이러한 두 초기 구절을 사용 하 여 것이 좋습니다. 통로 2에서 셀 통로 1 하위 문화 플럭스 분석 결과 대 한 충분 한 세포를 생성 하지 않습니다 경우 고려 사항으로가지고 아직도 한다. 생체 연구 뿐만 아니라 우리의 이전 연구 통로 3에 기본 TECs 단백질 및 RNA 연구 (데이터 표시 되지 않음) 화합물과 치료에 대 한 매우 유용한 수 있습니다 보여줍니다. 그 말했다 하 고, 좋습니다 조사 관 세포를 분리 하는이 프로토콜을 사용 하 여 다른 연구 응용 프로그램에 대 한 최적의 통로 선택 신중 하 게 해야 한다.
세포 외 유출 분석의 작동 원리 삽입 된 화합물과 호흡 사슬 복합물 및는 uncoupler의 효과 사이의 상호 작용을 기반으로 합니다. Oligomycin 복잡 한 V (ATP synthase)의 억제제 이며 ATP 연결 산소 소비와 미토 콘 드리 아 내 막32에 걸쳐 일반 양성자 누출을 극복 하는 데 필요한 산소 소비를 구별 하는 데 사용 합니다. FCCP 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 방해 하 여 ATP 생산에서 산소 소비를 uncouples. 따라서, 그것은 그것은 멤브레인을 통해 양성자 전송 함으로써 ATP synthase에 의해 양성자 이온 경과의 제한 된 용량 circumvents로 최대한 호흡 능력의 측정을 제공 한다. Antimycin-A, 복잡 한 III 억제제, 그리고로 테 논, 복잡 한 내가 차단, 허용은 미토 콘 드리 아 대 사이 감 별 법에 비-미토 콘 드 리아 산소 소비 전체 미토 콘 드리 아 호흡을 조합에서 이용 된다 셀입니다. 이 화합물은 최적의 OCR 곡선을 생성 하는 최적의 농도 결정 하는 세포 외 유출 분석 결과 전에 특정 셀 형식에 대 한 항상 적정 한다. 여기, oligomycin, FCCP의 1 개의 µ M 그리고로 테 논/antimycin A 기본 TECs에 세포 외 유출 분석 결과 대 한의 2 µ M의 1 µ M이 좋습니다.
결론적으로,이 프로토콜에는 신장 주 근 및 원심 관 상피 세포 미토 콘 드리 아 생체 비보 전평가에 사용할 수 있는 격리 하는 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜은 신장 관 상피 세포의 생물학 기능을 탐구 하는 분자 생물학 연구의 넓은 범위에서 유용할 수 있습니다, 우리 순수 인접 또는 원심 tubules를 필요로 하는 연구에 적용의 한계 인정 합니다. 예를 들어 로우 증후군, 선택적인 근 관 부전33또는 원심 신장 관 산 성 증, 원심 관 부전34에 대 한 연구에 대 한 연구 필요 더 정교한 프로토콜 셀 격리 및 정화입니다. 그러나, tubules 대 glomeruli, 비교 연구의 대다수 및 연구 관 세포에 잠재적인 미토 콘 드리 아 호흡 레 귤 레이 터를 일반적으로 화면에 가능한 높은 처리량 접근을 프로토콜에 제공 합니다. 따라서,이 프로토콜 광범위 한 응용 프로그램에서 미토 콘 드리 아 역 기능 약물 발견 또는 대상 유효성 검사 목적으로 신장 장애와 관련 된 공부를 할 수 있습니다.

신장 관 상피 세포 (TEC) 기능 신장의 전반적인 건강 상태와 강하게 연결 됩니다. 신장에 병 적인 신호 신장 섬유 증 및 만성 신장 병 (CKD)1,2에서 중요 한 역할을, TECs dedifferentiation을 발생 합니다. 높게 정력적 인 기관으로 신장은 주로 미토 콘 드 리아 산화 인 산화3통해 산소 소비량, 심장에만 두 번째. 전자 현미경 연구는 미토 콘 드 리아 형태학 변화 신장 tubules4병 적인 이벤트의 긍정적인 상관 관계를 밝혀 있다. TECs 미토 콘 드 리아 장애 신장 섬유 증에 엽 상피 전환5 와 불완전 지방산 산화6통해 발생합니다. 섬유 증은 CKD 귀착되는 진보적인 신장 병 리 이다. 따라서, 신장 TECs의 에너지 상태를 이해 CKD의 이상 발견 하는 필요 이다.
성인 신장7> 20 종류 있다. TECs의 기능을 공부, 신장 상피 세포의 기본 문화 화학 치료 및 유전자 조작 등 분자 생물학 응용 프로그램을 위한 플랫폼으로 필요 하다. 중요 한 것은, 유전자 조작은 vivo에서 쥐 transgenesis 또는 고립 된 주 세포 유전자 조작 이미 것 있도록 AAV 유전자 전달 기법8 을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 마우스9,10, 쥐11,,1213,14개, 토끼15,16및 인간17에서 기본 신장 관 세포의 고립 ,18 순수 근 관 세포를 정화 단계와 보고 되었습니다. 이 이전에 게시 프로토콜 인접 관 세포의 고립에 초점을, 그라데이션 원심 분리 및 실험 정렬 정화 목적으로19수행 했다. 이러한 프로토콜 인접 tubules 공부에 대 한 귀중 한 동안, 그들은 충분 하지 않습니다 인접 및 원심 tubules 공부 하는 데 필요한 때. 예를 들어 Alport 증후군에 대 한 우리의 연구는 인접 및 원심 신장 tubules20질병 진행 중요 한 역할을 따라서 신장 tubules의 두 종류 문화 조사 한다 밝혔다. 신장 불 화물 독성에 대 한 최근 연구는 또한 병리학 변화 모두는 근 위 및 원심 tubules21에서 개최 했다 다는 것을 보여주었다. 따라서,이 격리 프로토콜 설계 및 시 약 및 간단한 절차의 최소한의 비용으로 마우스 신장에서 인접 하 고 원심 관 세포에 대 한 최적화. 또는 수 사관 수 여전히 프로토콜 단계 3.1까지 따라 하 고 순수한 근 관 세포의 고립에 대 한이 시점에서 정화 단계9 를 추가.
고립 된 세포 높은 에너지 레벨을 제시 하 고 4 구절에 하위 문화 후 신장 상피 특성을 유지. 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여, 우리 셀 밀도 최적화로 더 통찰력에 이르게는 96 잘 접시에서 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 합니다. 이러한 관찰이이 프로토콜 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구에 적용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 추가 의미 신장 근 위 및 원심 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 ex vivo 특성에 대 한 높은 처리량 도구로 그것의 가능한 사용 이다. 따라서, 그것은 약물 발견 또는 신장 질환의 약물 특성화 목적을 위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>콜라겐 I 쥐 단백질, 꼬리</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>J.T.Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 II 형</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>트립신 -EDTA (0.25 %)</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>신장 상피 세포 성장 배지 2 키트</td><td>PromoCell</td><td>C-26130</td><td></td></tr><tr><td>2-데옥시 글루코스</td><td>시그마</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>글루코스</td><td>시그마</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-카르니틴</td><td>시그마</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>에토목시르</td><td>시그마</td><td>E-1905</td><td></td></tr><tr><td>올리고마이신</td><td>시그마</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시) 페닐히드라존(FCCP)</td><td>시그마</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>안티마이신-A</td><td>시그마</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>팔미틴산나트륨</td><td>시그마</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨</td><td>시그마</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민 200mM 용액</td><td>시그마</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 분말</td><td>시그마</td><td>D5030-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>LifeTechnologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루 염색 (0.4 %)</td> <td>LifeTechnologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>카운팅 슬라이드</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 겸</td>자 <td>Roboz</td><td>RS-5101</td><td></td></tr><tr><td>TC10 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>506BR2119</td><td></td></tr><tr><td>MINIPULS 3 연동 펌프</td><td>Gilson Inc.</td><td>GM3P</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 분석기</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>S7800A</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPack(센서 카트리지, 마이크로플레이트 및 캘리브런트 포함)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>10260-100</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

신장 관 상피 세포 (TECs)에서 미토 콘 드 리아 기능 장애는 신장 섬유 증, 만성 신장 병 (CKD)의 주요 원인으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 기본 TECs 미토 콘 드 리아 기능 평가 CKD의 이상에 대 한 통찰력을 제공 하는 셀의 bioenergetic 상태에 귀중 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 분리와 다른 종에 인접 tubules의 정화 하는 데 사용할 수 있는 복잡 한 프로토콜 수 있지만, 필드 정화에 대 한 필요 없이 관 세포 격리에 대 한 최적화 된 비용 효율적인 방법을 결여 된다. 여기, 우리는 두 주에 초점을 맞추고 연구 인접 하 고 원심 신장 TECs 마우스에 대 한 수 있는 격리 프로토콜을 제공 합니다. 비용 효과적인 시 약 및이 프로토콜에 필요한 최소한의 동물 절차, 고립 된 세포 격리 후 높은 에너지 레벨을 유지 하 고 하위 4 구절, 지속적인 연구에 대 한 허용 최대 경작 될 수 있다. 또한, 우리는 우리 세포 밀도 및 화합물 농도의 최적화에 대 한 권장 사항을 제공 96 잘 접시에 격리 TECs에서 직접 미토 콘 드리 아 호흡을 평가 높은 처리량 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여. 이러한 관측 신장 TECs의 일관 된, 잘 표준화 된 생산 신장 관 ex vivo 연구이 프로토콜을 사용할 수 있는 것이 좋습니다. 이 프로토콜은 광범위 한 미래의 응용 프로그램에서 약물 발견 또는 마약 특성화 목적에 대 한 신장 장애와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애 연구 할 수 있습니다.

신장 관류 및 소화 얻을 매우 가능한 관 상피 세포: 마우스 신장 관 상피 세포 격리 프로토콜 위에서 설명한 섹션 1-3에에서 설명 된 단계를 따라 했다.
소화, 후 신장 세포, 불완전 하 게 소화 tubules 및 70 µ m 보다 작은 다른 조직 파편의 이종 인구 격리 당일 문화 접시에 도금 했다. 변경 0 1 일 후 격리 보통 셀 첨부 파일에만 아니라 세포 성장에 볼 것으로 예상 됩니다. 부동 이기종 인구 통해 찾고 몇 관 셀만 하루 1 (그림 1A)에 붙어 있었다. 하루 1 셀, 원심 분리, 그리고 다시 도금의 다시 컬렉션 가벼운 파편을 제거 하 고 관 셀 릴리스에 대 한 작은 관 조각 정착을 도움. 3 일에 1 일에서 더 나은 셀 첨부 파일 뿐만 아니라 (그림 1A) 1 일에 비해 3 배 세포 밀도와 관찰 되었다 눈에 띄게 향상 된 세포 성장 율에 변화가 예상 했다. 초기 성장 단계에서 셀 여러 식민지를 형성 하 고 식민지 주위 채워집니다. 이 시점에서 앞으로, 격리 된 세포 완 치 했다 고 건강 한 확산을 표시. 일별 5 셀 셀 셀 및 식민지 식민지 사이의 일부 공백을 60 mm 페 트리 접시에 80-90 %confluency (그림 1A) 했다.
하위 문화와 격리 된 관 세포의 특성: 격리 된 신장 관 상피 세포 하위 특성 다음 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 4에에서 명시 된에 대 한 교양 했다.
5 일에서 셀 완전히 고립에서 발견 하 고 적극적으로 확산 하기 시작 했다. 1 주일 후 격리, 셀 60 mm 페 트리 접시에 confluency 되었다. 1 주일 후 통로 0에 문화에서 셀 통로 1 하 고, 그 후, 2 더 많은 구절을 하위 경작 될 준비 했다. 비슷한 성장 패턴 1 통로 및 통로 2에서 관찰 되었다. 일반적으로, 그것은 1과 2 추가 하위 문화 (그림 1B)에 대 한 confluency 성장에 통로에 셀에 대 한 1 주일 미만 걸립니다. Confluent 셀 통로 0에서 통로 2는 광범위 한 돔 형성23,24 (그림 1B), 고립 된 세포를 건강 한 유지 하는 것을 건의 했다 상태로 어디 그들은 비슷한 액체를 배설의 지속적인 문화 하는 비보에 상태. 이 접시에서 리프트 하지만 꽉 연결을 통해 연결 상태를 유지 하는 세포의 단층을 발생 합니다.
문화에 있는 세포의 특성, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지는 제어 셀 라인-인간 근 신장 상피 홍콩-2 셀에 뿐만 아니라 통로 4를 통해 통행 1에서에서 경작된 한 세포에 수행 합니다. 근 관 마커, aquaporin 1 (AQP1)25 및 angiotensinogen (AGT)9, 원심 관 마커 E cadherin25, 상피 마커 부드러운 근육 걸 (SMA)26,27,28, 대 식 세포 마커 F4/8029 와 CD6830, 그리고 mesangial 마커 thymocyte 차별화 항 1 (Thy1/CD90)9 특성 연구를 위해 사용 되었다. 두 근 관 단백질 AQP1 및 AGT 일관 되 게 높은 긍정적인 제어 홍콩 2 근 상피 세포 (그림 2A)에서 통로 4도 1 통로에서 격리 된 관 세포에 표현 되었다. 원심 관 단백질 E cadherin 통로 4 통해 격리 된 관 세포에 표현 하 고 또한 홍콩-2 셀 (그림 2A)에서 관찰 되었다. SMA는 제어 홍콩-2 셀, 게시 된 보고서26,27일치에 격리 된 관 세포에 풍부 하 게 표현 했다. 다른 한편으로, mesangial 단백질 Thy1 및 대 식 세포 단백질 F4/80 결 석 했다 고립 된 관 세포에 제어 홍콩-2 셀 (그림 2A). CD68 홍콩-2 셀에는 최소한의 식 그리고 통로 1 및 통로 2, 그리고 그 표현에서 고립 된 관 세포에서 3 통과 통로 4 (그림 2A)에서 탐지 되었다. 결과이 프로토콜에 따라 고립 된 세포는 인접 하 고 원심 관 세포의 혼합 것이 좋습니다. 이러한 마커 단백질에서 생체 내에의 식을 비교 하려면 우리 냉동된 신장 조직에 얼룩 수행. 관 마커, 높은 표현 야생-타입 건강 한 마우스 (그림 2B)에서 수확 하는 신장에 발견 되었다 AQP1, AGT, 및 E-cadherin mesangial 단백질 Thy1를 포함 하 여. F4/80 및 CD68의 낮은 표현 야생-타입 신장에서 관찰 하지만 신장 신장 실패는 대 식 세포 침투20,31 ( 를 개발 Col4a3-/- 마우스에서 수확에 광범위 하 게 표현 그림 2C).
고립 된 주 관 세포에서 미토 콘 드리 아 생체 분석 결과: 미토 콘 드리 아 호흡 시험 단계는 위에서 설명한 프로토콜의 섹션 5에에서 설명 되어 있습니다.
고립 된 주 관 세포의 미토 콘 드리 아 호흡 산소 소비 속도 (OCR) 다른 도금 밀도에 한 세포 외 유출 분석에 의해 측정 됩니다. 도금 밀도 적정에 20000, 30000, 40000 기본 TECs 잘 당 했다 시드 96 잘 XF96 microplate에 하루 전에 (약 20 전에 h) 세포 외 유출 분석 결과 (그림 3A). 세포 외 유출 분석에 따라 OCR 측정 했다 다음 셀 카운트에 Hoechst 얼룩의 정량화에 의해 정규화 됩니다. 도금 TECs에 20000, 30000, 또는 40, 000 셀/잘 결과 25, 45, 또는 50 pmol/min의 평균 기저 OCR에 각각 (그림 3A). 또한, 도금된 세포의 현미경 이미지 공개 40, 000 셀/잘 적용 (그림 3B) 다른 도금 밀도 보다 더 미 판 우물의 바닥의 전체 표면. 최대한 OCR 30000 세포의 밀도에 비해 40, 000 셀을 사용 하 여 증가 하지 않았다, 비록 셀/잘 셀과 화합물 사이의 최적의 상호 작용을 위해 약 40, 000의 세포 밀도 권장 합니다.
또한, 우리의 실험에서 억제/uncoupler 화합물의 최적 농도 1 µ M oligomycin, 1 µ M FCCP와 2 µ M로 테 논/antimycin-A (세포 외 유출 분석 결과 및 포트 주사의 프로토콜 표 1에에서 나열 된 것으로 표시 했다 ; 최적화 실험 표시 되지 않습니다). 그러나,이 좋습니다 이상적으로 낮은 하 고 게시 된 값 보다 더 높은이 화합물의 다양 한 농도와 예비 테스트를 실행 하는 모든 사용자에 대 한 최상의 결과 보증 하기 위하여.
세포 외 유출 분석 결과 신장 TECs의 생체를 평가 하기 위한 중요 한 매개 변수를 생성 합니다. 예를 들어, 지방산 산화 특히 TECs에 결함이 있는 것 같이 지방산 기판 (물)의 분해 (2 DG) 억제제와 함께 포함 된 미디어의 사용으로 사용할 수 있습니다 직접 TECs에서 지방산 산화를 평가 하는 유용한 도구 구절 들 1, 2 (그림 3C)에서 신장 섬유 증의 경우 셀의 전반적인 호흡 용량 포도 당 기반 미디어 수 있습니다 어떤 차이 공개 하지도 건강 한 신장 보다 낮은 될 것으로 예상 된다.
함께 찍은, 세포 외 유출 분석 결과, 특히 지방산 산화 용량을 평가 하기 위해 이용 될 수 있다 신장 TECs 생체 프로 파일 재생에 영향을 미치는 어떤 병 적인 변화에의 에너지 상태를 평가 하는 유익한 수단으로는 주요 역할 신장 섬유 증과 신부전을 진행.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>시간 (분)</td>
		</tr>
<tr>
<td>보정</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Equilibrate:</td>
			<td>00시 12분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정 1</td>
			<td>3 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>주사 (1 μ M Oligomycin) 포트</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 B (1 μ M FCCP) 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>포트 C (2 μ M Rotenon/Antimycin)을 주사</td>
			<td>2 루프</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>믹스</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>대기</td>
			<td>00시 02분: 00</td>
		</tr>
<tr>
<td>측정</td>
			<td>00시 03분: 00</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 기본 관 세포에 최적의 OCR 측정에 대 한 프로토콜을 실행 하는 세포 외 유출 분석 표준화.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig1.jpg"> 그림 1입니다. 세포 격리 된 기본 관 세포의 배양. (A) 격리 기본 관 셀 일찍 하루 1에서 연결 및 견고 하 게 3 일에서 5 일 성장. 10 X 20 X 목적과 이미지에서 가져옵니다. (B)이이 패널 통로 3에 통로 0에서 격리 된 기본 관 세포의 하위 문화를 보여줍니다. 10 배, 20 X 목표 셀 돔 및 형태학 상 변화는 구절을 통해의 비전에 대 한 40 X 목표 아래 비전에 대 한 이미지에서 가져옵니다. scalebar = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig2.jpg"> 그림 2입니다. 고립 된 주 관 세포의 특성. (A) Immunostaining (AQP1, AGT) 근 관 단백질, 원심 관 단백질 (E-cadherin), 상피 단백질 (SMA), mesangial 단백질 (Thy1), 및 대 식 세포 단백질 (F4/80, CD68)에 대 한 항 체와 격리 된 주 쇼 관 세포 및 이후의 하위 문화는 순수 인접 하 고 원심 관 세포 이다. (B)이이 패널 긍정적인 제어 및 아니 기본 부정적인 제어로 근 관, 원심 관, 및 건강 한 야생-타입 마우스에서 신장 조직에서 mesangial 단백질의 얼룩을 보여줍니다. (C)이이 패널 긍정적인 컨트롤로 Col4a3-/- 마우스에서 수집 하는 신장 조직에서 대 식 세포 단백질 F4/80 및 CD68의 얼룩을 보여줍니다. Scalebar = 20 µ m. DAPI에서 파란색으로 표시 됩니다. 마커 단백질은 녹색으로 표시 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57718/57718fig3.jpg"> 그림 3입니다. 다른 도금 밀도에 고립 된 주 관 세포 분석 결과 세포 외 유출. (A) 증가 세포 밀도 도금 향상 기본 관 세포에서 기저 호흡 레벨 통로 3에서 테스트. (B)이이 패널이 보여줍니다 현미경 기본 관 세포의 경작 20000, 30000, 40000 셀/잘 밀도에서 시드 XF96 microplate에. Scalebar = 100 µ m. (C)이이 패널 구절 2와 1에서 기본 관 세포에서 지방산 또는 포도 당-기반 세포 외 유출 분석 결과 보여줍니다. 데이터는 평균 ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57718/57718fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 분리 하 고 마우스 기본 신장 관 세포 이후에 하위 신장 생물학 기능 비보 전, 미토 콘 드리 아 생체를 포함 하 여 평가 양식 수 있는 특성화 하는 비용 효율적인 접근 방식을 제공 합니다.

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

이 방법은 지방산 산화와 같은 신장 대사에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 신장 섬유증 및 기타 다양한 신병증의 발병과 밀접한 관련이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량 플랫폼을 사용하여 신장 세뇨관 상피 세포에서 미토콘드리아 생체 에너지를 조절하는 화합물을 스크리닝하는 것입니다. 이 기술의 의미는 신장 상피 세포에서 미토콘드리아 대사를 조절하는 화합물의 높은 전체 스크리닝을 허용하기 때문에 신장 대사 질환 치료로 확장됩니다.콜라겐으로 코팅된 60mm 페트리 접시를 준비하려면 미리 여과된 20밀리몰 아세트산 2밀리리터와 콜라겐 I 용액 35마이크로리터를 각 접시에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 한 시간 동안 배양하고 자연 건조시킨 다음 UV에 노출시킵니다. 다음으로 PBS를 사용하여 아세트산 잔류물을 헹굽니다. 세 번 헹굽니다.그런 다음 접시를 섭씨 37도의 이산화탄소가 없는 세포 배양 인큐베이터에 보관합니다. 쥐의 수술을 준비한 후 제모 크림을 사용하여 가슴과 복부의 털을 제거합니다. 그런 다음 요오드로 피부를 소독하고 요오드 잔여물을 닦아냅니다.다음으로 절개를 하여 복강을 열고 심장과 신장을 노출시킵니다. 이제 분당 32밀리리터로 관류 펌프를 설정하고 관류를 시작하기 전에 튜브의 기포를 제거합니다. 라인 끝에 27게이지 바늘을 사용하십시오.계속 진행하려면 심장 정점을 통해 좌심실에 바늘을 삽입하십시오. 완충액이 심장을 채우자마자 우심방에 구멍을 뚫어 관류 완충액을 위한 출구를 만듭니다. 그런 다음 분해 버퍼로 전환하고 분해를 위해 펌프 속도를 분당 30밀리리터로 약간 줄입니다.20ml의 소화 완충액을 관류한 후 세뇨관 세포 분리를 위해 양쪽 신장을 제거합니다. 적출된 신장을 처리하려면 먼저 신낭과 수질을 제거해야 합니다. 그런 다음 양쪽 신장을 작은 조각으로 다진 다음 섭씨 37도의 오븐에서 5분 동안 부드럽게 회전하면서 10ml의 소화 완충액으로 배양합니다.분해 후 70미크론 필터를 통해 버퍼를 통과시켜 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 분해된 조직을 채취한 후 배양 배지 10ml를 첨가하여 소화를 멈춥니다. 다음으로, 여과된 조직 현탁액을 50g에서 5분 동안 원심분리하여 세뇨관 세포를 펠릿화합니다.그런 다음 상층액을 새 튜브로 옮기고 5ml의 배양 배지를 추가한 다음 원심분리를 반복하여 남아 있는 세뇨관 세포를 수집합니다. 이제 첫 번째 펠릿을 20ml의 배양 배지에 재현탁시키고 50g에서 5분 동안 원심분리하여 수집된 세포를 추가로 정제합니다. 상층액을 폐기하십시오.그런 다음 두 펠릿을 10ml의 배양 배지에 재현탁시킵니다. 다음으로, 트리판 블루 염색을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다. 그런 다음 최대 1,000만 개의 세포를 60mm 콜라겐으로 코팅된 접시에 파종하고 세뇨관 세포가 밤새 부착되도록 합니다.먼저 P1 세뇨관 세포를 40, 000 세포에서 콜라겐으로 코팅된 새로 준비된 96웰 마이크로플레이트의 웰에 파딩합니다. 웰당 100마이크로리터의 배양 배지를 사용하십시오. 세포외 플럭스 분석에서 세포 밀도와 화합물 농도를 최적화하는 것은 성공적인 실험의 핵심입니다.최적의 세포 밀도와 화합물 농도를 식별하기 위해 파일럿 적정 실험을 권장합니다. 다음으로 센서 카트리지에 수분을 공급합니다. 먼저 센서 카트리지를 들어 올리고 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 교정 용액을 채웁니다.그런 다음 카트리지를 재배치하여 센서를 담그고 섭씨 37도에서 밤새 어셈블리를 배양합니다. 다음 날, 기존 배지를 흡인하고 175마이크로리터의 포도당 또는 지방산 분석 배지로 교체합니다. 그런 다음 이산화탄소 없이 한 시간 동안 배양을 계속합니다.세포 배양 중에 카트리지의 포트 A에 25마이크로리터의 올리고마이신을 넣고, 포트 B에 FCCP를 넣고, 포트 C에 로테논/항마이신 A를 넣고, 포트 D와 다른 모든 포트에 물을 넣습니다. 이제 설정이 보정할 준비가 될 때까지 카트리지를 이산화탄소가 없는 인큐베이터에 보관합니다. 세포외 플럭스 분석기와 컨트롤러를 켜서 진행합니다.그런 다음 분석기 소프트웨어를 열고 표준 분석을 선택한 다음 분석 마법사 옵션을 누릅니다. 그런 다음 Compounds(화합물) 탭에서 화합물을 적절한 포트에 할당합니다. Background Correction(배경 보정) 탭에서 세포가 없는 웰을 선택합니다.그런 다음 Groups and Labels 탭을 사용하여 실험 그룹에 레이블을 지정합니다. 그런 다음 프로토콜 탭에서 사용 가능한 명령을 사용하여 적절한 혼합 및 측정 주기를 설정합니다. 이러한 설정은 텍스트 프로토콜에 표시되며, 입력되면 나중에 사용할 수 있도록 템플릿을 저장합니다.이제 마법사 끝내기를 눌러 계속 진행하십시오. 이제 시작을 눌러 보정을 시작합니다. 그런 다음 분석기는 플레이트 홀더를 꺼내고 카트리지 플레이트를 삽입하라는 메시지를 표시합니다.이 보정 프로세스를 완료하는 데 20-25분이 걸립니다. 시스템이 보정되면 프롬프트 명령을 눌러 보정 플레이트를 셀 플레이트로 교체하고 실행을 계속합니다. 실행이 완료되면 OCR 데이터를 저장하고 분석기에서 플레이트를 제거합니다.이제 각 분석 웰에 Hoechst를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 355나노미터 여기와 460나노미터 방출을 사용하여 세포를 계수하고 OCR 데이터를 세포 수로 정규화합니다. 이 프로토콜에서는 이질적인 신장 세포 집단, 불완전하게 소화된 세뇨관 및 기타 조직 파편을 콜라겐 코팅된 플레이트에서 배양했습니다.분리 다음 날, 배양 배지를 원심분리하여 파편을 제거하고 세뇨관 세포를 다시 도금했습니다. 그 후, 세포는 더 쉽게 부착되었고, 배양 5일째에는 80-90%의 포화도에 도달했습니다. 그런 다음 신장 TEC는 하위 배양되어 1주일 이내에 합류점으로 성장했습니다.다음 두 통로에서도 비슷한 성장이 일어났다. 세포의 단층은 돔 형성을 취하여 플레이트에서 들어 올려지고 단단한 접합부에 의해 부착 된 상태를 유지합니다. 분리된 1차 TEC의 미토콘드리아 호흡은 설명된 대로 다양한 도금 밀도에서 OCR의 설명된 세포외 플럭스 분석을 사용하여 측정되었습니다.더 중대한 조밀도에 도금된 세포에는 OCR에 있는 비례적인 증가가 있었다. 우물 당 40, 000개의 세포는 다른 어떤 도금 조밀도 보다는 판의 표면을 잘 덮었, 따라서 세포와 화합물 사이 상호 작용을 시험하기 위하여 최선 농도에게 했다. 예를 들어, 지방산 기질을 함유하는 배지를 해당작용 억제제인 2DG와 함께 TEC에 적용하여 1차 및 2차 계대에서 TEC의 지방산 산화를 직접 평가했습니다.이 절차를 시도하는 동안 항상 각 유정의 정확한 부피와 농도를 기록하는 것이 중요합니다. 성분의 최종 농도가 변경되면 전체 실험이 실패할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신장학 분야의 연구자들이 다양한 신병증의 발병기전에서 세뇨관 지방산 대사의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

isolation-characterization-high-throughput-extracellular-flux

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Development of human renal tubular epithelial cell primary cultures in monolayers and three-dimensional conditions(단층 및 3차원 조건에서의 인간 신장 세뇨관 상피 세포 1차 배양 개발)

우리는 원발성 신근위세뇨관 상피 세포를 분리 및 배양하기 위해 전체 인간 신장을 처리하기 위한 최적화된 프로토콜과 이러한 세포를 3차원, 미세유체, 미세생리학적 플랫폼에서 적용하여 신장 근위세뇨관을 재현하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

1차 인간 근위세뇨관 상피 세포의 분리 및 신장 근위세뇨관의 미세생리학적 모델 생성에 사용

이 연구는 쥐 중간막 세포(MC)와 생체 외 세포 배양을 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 세포는 세포 성장이나 단백질 발현을 손상시키지 않고 여러 번 배양, 동결, 재생 및 배양할 수 있습니다.

Optimizing Isolation and Purification of Murine Glomerular Mesangial Cells

여기서는 고대사성 근위 소관 상피 세포에서 저산소증/산소 재산화 손상을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 대사 스트레스 유발 손상을 유도하도록 설계되었으며, 근위 세뇨관 손상 지표의 발현과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 측정할 수 있습니다.

근위 관 상피 세포에서 저산소증/재산소화 손상 모델링

배우세요 마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립 및 특성 분석 방법을 통해 세포 외 유출 분석으로 미토콘드리아 생체에너지를 평가하고 신대사 질환 치료 연구에 활용하는 고처리량 스크리닝 기술을 익히세요.

마우스 기본 신장 관 상피 세포의 고립, 특성, 및 높은 처리량 세포 외 유출 분석

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