Name: 2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 단백질-단백질 및 단백질-대사산물 상호작용을 병렬 분석하는 친화력 정화법을 Arabidopsis thaliana 세포 배양에서. 이 방법은 질량 분석을 활용하여 생체 내 상호작용 분자를 효율적으로 식별합니다.

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우리는 친절 하 게 그의 참여 프로젝트, 생산적인 토론과 좋은 감독에 대 한 교수 박사 로타어 Willmitzer를 인정 하 고 싶습니다. 우리는 proteomic MS 측정 도움 박사 다니엘 Veyel에 감사입니다. 우리 부인 Änne Michaelis LC MS 측정 우리 귀중 한 기술적인 도움을 제공 주셔서 감사 합니다. 또한, 우리는 닥터 모니카 Kosmacz와 박사 Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska를 그들의 도움과 원래 원고에서 작업에 참여에 대 한 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+as+global+regulators%3A+A+new+view+of+protein+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li>
<li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li>
<li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li>
<li>Ramírez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson%27s+disease-associated+LRRK2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).</li>
<li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules%3A+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pharmacal+Research%22%5BJournal%5D)">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li>
<li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li>
<li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li>
<li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li>
<li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li>
<li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).</li>
<li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21699588">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Transcription+Factors%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li>
<li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li>
<li>Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
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<li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li>
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저자는 공개 없다.

제시 프로토콜 대상 단백질의 PP와 오후 단지의 병렬 식별 수 있습니다. 최종 결과를 복제에서 실험 8-12 주 만큼 적게 완료할 수 있습니다. 완전 한 AP 걸립니다 약 4-6 h 12 ~ 24 샘플 집합에 대 한 우리의 프로토콜 중간 처리량 분석을 위한 적합 한 렌더링.
프로토콜, 되 고 전반적으로 간단에 불구 하 고 중요 한 단계의 수가 있다. (i) 충분 한 양의 입력된 단백질 및 선호도 구슬 대사 산물 탐지의 동적 범위를 도달 하는 중요 한 이다. 효율적인 셀 세포 따라서 절차에서 중요 한 단계입니다. 불 쌍 한 단백질 수율 차선 세포의 용 해 버퍼/재료 비율 또는 자료의 부족 분쇄의 결과 될 수 있습니다. (ii) 해야 주의 사용된 시 약 MS-친화입니다. 강한 세제, 글리세롤, 또는 소금의 과도 한 양의 그들은 MS 검색을 방해 피해 야 한다. (iii) Agarose 구슬 해서는 안됩니다-건조 단계, 세척 하는 동안 그리고 진공 매니폴드를 사용 하는 경우 그것은 구슬 파괴 또는 복잡 한 안정성에 영향을 미칠에 그렇게 하지 않도록 느린 흐름 속도 적용 하는 것이 중요.
제시 프로토콜에 중요 한 몇 가지 가능한 수정이 있다: (i) 제정 CaMV35S 모터를 사용 하 여 미끼 단백질의 양을 최대화 하는 우리. Overexpression, 매우 유용한, 고 수 있습니다 세포 항상성28 에 심각한 영향을 미칠 생리 적으로 관련이 없는 상호 작용의 형성으로 이어질. 식 사용 하 여 네이티브 발기인 기능 손실 배경에서 가능한 진정한 생물학 인터 검색에 대 한 우수한 여겨진다 태그 단백질입니다. 일반적으로 식물 세포 배양에 표현 하는 단백질에 대 한 식물 배경 관련 인터를 식별 하는 데 필요한 증명할 수 있습니다. (ii) 작업할 때 막 단백질, 세포의 용 해 버퍼는 MS 호환 세제로 보완 될 필요가 있다. (iii) 두 번째 친 화력 정화 단계 소개 가양성 true 반응 비율을 개선 하 고 EV 컨트롤29필요 수 있습니다. 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그 모두 힘들고 시간이 소모 되는 마에 다 외. 201411, 추가 크기 배제 크로마토그래피 단계에 매력적인 대안을 선물 한다.
AP의 가장 심각한 결점은 잘못 된 반응의 높은 속도. 이유는 수많은. 제정 overexpression 이미 언급 했다. 순수 없는 상호 작용의 다른 소스 고립 된 세포를 사용 하지 않는 한 단백질과 다른 subcellular 구획에서 대사 산물의 혼합물을 포함 하는 전체 세포 lysates의 준비 이다. Subcellular 지 방화는 진정한 인터에 대 한 필터링을 사용 해야 합니다. 그럼에도 불구 하 고, 잘못 된 반응의 대부분 난다 바인딩 단백질과 agarose 수 지 사이에서 유래한 다. 그러나 두 번째 정화 단계의 소개, 위에서 설명한 문제에 최고의 솔루션을 제공 합니다, 그리고 시간과 처리량 비용 온다. 또한, 약한 상호 작용 프로토콜 확장으로 손실 될 수 있습니다. AP의 또 다른 경고는 포괄적인 정보 제공 하는 위하여 대상 단백질의,에 불구 하 고 baited 단백질의 직접 및 간접 목표 구별 불가능 이다. 타겟된 분자 접근 상호 작용을 확인 필요 합니다.
MS 기반 대사체학 함께 AP S. cerevisiae12. 단백질 복합물 공부 하는 사용 했다 이 작품은, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 유지 세포 lysates에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 우리의 이전 관찰13 함께 제시 프로토콜에 대 한 개념적 기초를 제공 합니다. 우리의 프로토콜 3 독특한 포인트 특징 이다: (i) 반면에 누 룩을 작동12, AP 검색 뿐만 아니라 소수 하지만 또한 친수성 단백질 ligands에 적합 하다는 설명. (2) 3-에서-하나의 추출 프로토콜을 도입 하 여 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 인터를 공부 하는 단일 AP은 사용할 수 있습니다. (iii) 우리는 식물 세포 프로토콜을 적응.
향후 두 개의 독립적인 효소 분열 사이트 소설 탠덤 태그를 만드는 방법에 집중할 것 이다. 우리 또한 낮은 풍부한 식물 호르몬과 같은 작은 분자에 프로토콜의 적합성을 탐험 하 고 싶습니다.

방법을 설명 여기 근처-vivo에서 세포 lysate 조건에서 선택의 단백질의 대사 산물과 단백질 파트너의 식별에 목표. 그것은 많은 더 많은 대사 산물 오늘 특징 보다는 중요 한 규제 기능1는 추측 하고있다. 대사 산물은 생물학 스위치, 활동, 기능, 및 그들의 수용 체 단백질의2,,34의 지역화 변경으로 작동할 수 있다. 지난 10 년간에서 근처-vivo 조건, 또는 vivo에서 PMI의 식별 사용 여러 가지 획기적인 방법이 개발된5되었습니다. 사용할 수 있는 접근은 두 그룹으로 분리 수 있습니다. 첫 번째 그룹에는 소설 단백질 파트너를 트랩 하려면 알려진 대사 산물 미끼와 함께 시작 하는 기술 구성 되어 있습니다. 방법은 선호도 크로마토그래피6, 마약 선호도 응답 대상-안정성 분석 결과7, 항 암 치료-proteomics8및9프로 파일링 열 프로테옴 포함 됩니다. 알려진된 단백질 작은 분자 ligands10,11을 식별 하기 위해 시작 하는 단일 메서드 두 번째 그룹에 의하여 이루어져 있다.
MS 기반 lipidomics 함께 AP Saccharomyces cerevisiae12. 단백질 지질 단지 분석 하는 데 사용 했다 시작 지점으로 저자 표현 21 효소 ergosterol 생 합성에 관여 하는 효 모 종자를 사용 하 고 103 kinases 융합 협동 친 화력 정화 (꼭지) 태그. 효소의 70% 및 20%는 kinases의 복잡 한 단백질 지질 상호 작용 네트워크로 빛을 발산 하는 다른 소수 성 ligands를 바인딩할 발견 됐다.
이전에, 마찬가지로 지질, 극 지와 반 극 지 화합물 또한 유지 세포 lysates13에서 고립 된 단백질 복합물에 바인딩된 수 설명 합니다. 이러한 결과에 따라, 우리는 AP를 최적화 하기로 메서드 출판 이전 식물 세포 및 친수성 화합물1410,11 . 이 목적으로, 밴 Leene 외. 2010, PPI 연구15공장에서 성공적으로 사용 하 여 설명 탭 벡터 사용 했습니다. 유전자 변형 라인을 얻는 데 필요한 시간을 단축, 우리 애기 세포 배양에 결정 했다. 우리 고용 원스텝 메 틸 tert-부 틸 에테르, (티비) / 메탄올/물 추출 방법, 단일에서 단백질 (펠 릿), 지질 (유기 단계), 그리고 친수성 대사 (수성 단계)16 의 특성을 허용 친 화력 정화 실험입니다. EV 컨트롤 라인 가양성, 혼자 태그에 바인딩 단백질 예 제외에 도입 되었다. 우리는 3 (5) 태그 개념의 증거로 서 nucleoside diphosphate kinases 애기 게놈 (NDPK1-NDPK3)에 존재. NDPK1 티 S상호 작용 설명 수 다른 결과, 중-전이 효소와 티. 따라서 우리는 NDPK1 glutathionylation14받게 됩니다 증명할 수 있습니다.
정리해 보면, 제시 프로토콜 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 상호 작용 네트워크 특성화를 위한 중요 한 도구 이며 기존 방법에 비해 주요 사전 구성.

<table><tbody><tr><td>Murashige and Skoog 최소 유기물을 사용한 기저 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6899</td><td></td></tr><tr><td>1-Naphthylacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1641</td><td></td></tr><tr><td>Kinetin 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>시그마-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>시그마-알드리치</td><td>S6776</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>E-64 프로테아제 억제제</td><td>시그마-알드리치</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>AcTEV 프로테아제</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12575015</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese&nbsp; Gel 30 (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.2</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>SBP Tag 항체 (SB19-C4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-101595</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C 믹스, 질량 분석기 등급</td><td>Promega&nbsp;</td><td>V5071</td><td></td></tr><tr><td>우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>티오우레아</td><td>시그마-알드리치</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MTBE&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>138906</td><td></td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>136806</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>Biosolve</td><td>232106</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Biosolve</td><td>12006</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>202341</td><td></td></tr><tr><td>포름산&nbsp;</td><td>Biosolve</td><td>69141</td><td></td></tr><tr><td>Unimax 2010 플랫폼 쉐이커</td><td>Heidolph</td><td>5421002000</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메시 (와이어 직경 34 &마이크로; M, 두께 55 &마이크로; M, 개방 영역 14%)</td><td>Prosepa</td><td>맞춤형 주문</td><td></td></tr><tr><td>유리 깔때기, 47mm, 300ml</td><td>Restek</td><td>KT953751-0000</td><td></td></tr><tr><td>필터 병 상단 500mL 0,2 &마이크로; M Pes St</td><td>VWR International GmbH</td><td>514-0340</td><td></td></tr><tr><td>믹서 밀 MM 400</td><td>Retsch GmbH</td><td>207450001</td><td></td></tr><tr><td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0969-02</td><td></td></tr><tr><td>Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filters</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>필터 (소형) 35 & 마이크로; M 기공 크기, Mobicol M 1002, M1003, M1050 및 M1053</td><td>MoBiTec GmbH</td><td>M513515</td><td></td></tr><tr><td>가변 속도 튜브 로테이터 SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y550.1</td><td></td></tr><tr><td>로터리 디쉬 로테이터용 SB 3</td><td>Carl Roth</td><td>Y555.1</td><td></td></tr><tr><td>Resprep 24-Port SPE 매니폴드</td><td>Restek&nbsp;</td><td>26080</td><td></td></tr><tr><td>Finisterre C18/17% SPE 컬럼 100mg / 1ml</td><td>Teknokroma</td><td>TR-F034000</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler&nbsp; 바이알</td><td>Klaus Trott 크로마토그래피-Zubeh&ouml; r</td><td>40 11 01 740</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100 C18 LC 컬럼</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>164534</td><td></td></tr><tr><td>EASY-nLC 1000 액체 크로마토그래프</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>LC120</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석기</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 시스템&nbsp;</td><td>워터스&nbsp;</td><td>맞춤 주문</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC HSS C18 컬럼, 100A, 1.8 &마이크로; M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td><td>물&nbsp;</td><td></td><td></td>186003533</tr><tr><td>수성 세정액을 위한 고출력 초음파 세정 수조</td><td>Bandelin</td><td>RK 31</td><td></td></tr><tr><td>Genedata 표현주의</td><td>Genedata</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur 소프트웨어</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>NaN</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>NaN</td><td>NaN</td><td></td></tr></tbody></table>

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

세포질 과정은 단백질, 대사, 핵 산 등과 같은 생체 분자 간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 조사는 없는 참신, 실험적인 접근 생 단백질 대사 산물 상호 작용 (PMI)을 특성화 목표로 오히려 최근 개발을 구성 합니다. 여기, 우리는 PPI와 미끼 라고 선택의 단백질의 PMI의 동시 분석을 허용 하는 프로토콜을 제시. 우리의 프로토콜은 최적화 된 애기 셀 문화 및 친 화력 정화 (AP)를 결합 한 질량 분석 (MS)와 함께-기반 단백질 및 대사 산물 검출. 즉, 미끼 단백질 선호도 태그 융합을 표현 하는 유전자 변형 애기 라인 기본 세포 추출을 lysed 처음은. 방지 태그 항 체는 풀 미끼 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너 다운 하는 데 사용 됩니다. 친 화력 정화 단지 1 단계 메 틸 tert를 사용 하 여 추출 됩니다-부 틸 에테르 (티비) / 메탄올/물 방법. 대사는 극 지 또는 소수 성 위상, 분리 하는 동안 단백질 펠 릿에서 찾을 수 있습니다. 대사 산물과 단백질 다음 울트라 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석 (UPLC MS 또는 UPLC-MS/MS)에 의해 분석 된다. 빈 벡터 (EV) 제어 라인 가양성을 제외 하는 데 사용 됩니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 근처 생리 적 조건 (세포 lysate)에서 동시에 대상 단백질의 단백질 및 대사 산물 파트너의 식별 수 있습니다. 제시 방법 간단, 신속, 그리고 식물 세포 배양 이외의 생물 학적 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

원래 연구에 3 개의 A. thaliana NDPK 유전자 PSB L 셀 서 스 펜 션 문화 제정 35S 발기인14 (그림 1)의 통제에 overexpressed 했다. 탠덤 선호도 태그 미끼 단백질의 카 또는 아미노-터미널 끝을 융합 했다. 친 화력 정화 단지 티비/메탄올/물 추출16를 받게 했다. 선호도 뽑아 단백질과 작은 분자는 MS (테이블 S2 및 S3)를 사용 하 여 확인 되었다.
판정에 대 한 수정, 빈 샘플 작은 분자 오염 물질 화학 제품 및 실험실 소모품에서 제외 사용 되었다. 또한, 대사 산물 선호도 태그 중 하나에 바인딩 또는 혼자 수 지 단백질은 고려 EV 컨트롤 라인을 사용 하 여. 참 긍정 양측 쌍이 아닌 학생의 t-검정, Benjamini &amp; Hochberg 틀린 발견 비율을 검색 하 보정 대사 (테이블 S4) 및 단백질 (테이블 S5) 크게 NDPKs AP에 농축 식별에 적용 된 EV 컨트롤 라인에 비해 (N-와 C-말기 태그 NDPKs) 실험 (루즈벨트 &lt; 0.1). Note는 이전 작품에서 우리 사용 부재/존재 조건을 단백질과 작은 분자 인터 윤곽을 그리 다.
대표 결과 NDPK1를 위한 dipeptides, 우리의 그룹에 작은 분자 레 귤 레이 터의 새로운 클래스에 대사 산물 데이터 초점 동안 받는다. Proteomic 분석 NDPK1의 26 상 상속 단백질 파트너를 공개 했다. 공동 NDPK1으로 같은 subcellular 구획에서 화 된 단백질에 대 한 추가 필터링 (cytosol) 목록 13 상 상속 단백질 인터 한정. 확인 된 단백질 가운데 티 S-전이 효소, 두 개의 신장 개시 요인, tubulin, 및 aconitate hydratase. Metabolomic 분석 4 dipeptides 발 레이, Ile Glu, 레이-한 일-NDPK1와는 특별히 공동 eluted Phe 밝혀 (그림 2). 참고 모든 4 개의 dipeptides 그들의 N-말단, 공유 바인딩 특이성 제안에 소수 성 잔류물을 공유 합니다.
알려진된 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지 우리가 찾을 쿼리 13 단백질과 스티치 데이터베이스25 (그림 3)에 대 한 4 개의 dipeptides 식별. 여러 가지 관측을 만들 수 있다: (i) 이전 NDPK1에 대 한 보고는 없는 인터. (ii) APX1 ortholog 알데하이드 효소 가족 ALDH7B4, 번역 개시 인자 FBR12 다른 번역 개시 인자 유전자 AT2G40290에 의해 동안에 상호 작용을 보고 되었다. (iii) 확인 된 dipeptides 더 단백질 파트너를 보고 있다. 공동 eluted dipeptides 이전 모든 검색 된 식물 단백질에 관련 된 보도 했다. 그러나, 그들은 다른 유기 체에서 중요 한 역할 놀이: 레이-일, 예를 들면, 인간 세포 선26neurotrophin 활성화 효과가 있다. 참고 실험 시스템의 정확한 토폴로지 확인 허용 하지 않습니다. 예를 들어 한 dipeptide NDPK1와 직접 상호 작용할 수 있지만 잘 공동 순화 된 단백질의 어떤 관련이 있을 수 있습니다.
함께 찍은, 우리의 결과 보여준다 질량 분석, 함께 AP를 고용 설립된 절차, 단백질-단백질 및 단백질 작은 분자 인터의 식별을 용이 하 게 하 고 도움에 대 한 광범위 한 정보를 생성 합니다 위하여 대상 단백질의.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> 그림 1입니다. AP-MS 워크플로의 체계입니다. (A) 식물 세포 배양에서 네이티브 녹는 분수의 준비. (B) AP 절차의 다음 단계. 열에 샘플을 로드 한 후 관심 (POI) 탭 태그 융합 단백질 agarose 구슬에 움직일 IgG 항 체에 바인딩합니다. 열 세척 언바운드 단백질 및 대사 산물의 제거를 촉진 한다. AcTEV 분열을 수행한 후 포 단백질 대사 산물 단지는 eluted. (C) 단백질 및 대사 산물 분수 반 양적 MS 분석 뒤에 단지의 분리. 이 그림의 일부는 Luzarowski 외. 201714에서 재현 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> 그림 2입니다. 특히 공동 NDPK1와 방출 dipeptides. 4 dipeptides 발 레이 (A), Ile Glu (B), 레이 일 (C), 및 일 페 (D) AP 실험에서 측정의 평균 농도 구성 했다. 모든 4 개의 dipeptides NDPK1 샘플 EV 제어에 비해 상당한 농축 표시 (별표 나타냅니다 루즈벨트 &lt; 0.1). 오차 막대 대표 6 측정 표준 오차 (N-3 복제와 C 말기의 3 태그 단백질). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> 그림 3입니다. 공동으로 NDPK1, 방출 하는 모든 분자의 상호 작용 네트워크 이전만 고려 하는 스티치 데이터베이스에 대해 쿼리 실험 및 데이터베이스 증거 (신뢰 &gt; 0.2). 높은 신뢰 상호 작용의 더 높은 기회를 나타냅니다 하 고 예금 된 데이터에 따라 계산 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S1입니다. MaxQuant 출력 테이블 "parameters.txt". 테이블 식별 및 정량화, 뿐만 아니라 사용 하는 데이터베이스에 대 한 정보에 대 한 임계값이 포함 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S2 MaxQuant에서 정보 출력 테이블 "proteinGroups.txt". 테이블에는 모든 확인 된 단백질 그룹, 농도, 및 고유 펩 티 드 및 점수 번호 등 추가 정보 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블의 S3 극 지 대사 산물의 분석을 포함 하는 출력 파일입니다. 테이블에 모든 확인 된 대량 기능 특정 m/z, RT 및 강도 특징의 목록이 포함 되어 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S4입니다. Dipeptides는 NDPK1, NDPK2 또는 NDPK3 미끼로 사용 되었다 AP 샘플에서 발견. Dipeptides 빈 샘플에는 목록에서 제외 했다. 두 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK는 3 중에서 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 &lt; 0.1). 주어진 ΔRT 계산 됩니다 참조 화합물과 monoisotopic 질량 주어진 Metlin27에 관하여 Δppm. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
테이블 S5입니다. NDPK1와 공동 순화 하는 단백질. 3 중에서 2 개의 독립적인 라인 (태그에 어느 N-또는 C-말단) 각 NDPK 실행 했다. 학생의 t-테스트 및 p의 수정 추가-Benjamini를 사용 하 여 값 및 Hochberg 메서드 NDPKs의 크게 농축된 끌어와서 파트너를 결정 하는 데 사용 되었다 (루즈벨트 &lt; 0.1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

이 방법은 기초 연구의 핵심 질문을 해결하는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 필수 단백질의 새로운 소분자 리간드를 설명함으로써 의료, 제약 및 생명 공학 분야에 기여할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 밀접한 생체 조건에서 선택한 단백질의 단백질 및 대사 파트너를 병렬 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 미리 선택된 리간드에 국한되지 않고 상호 작용하는 분자를 찾아내는 데 도움이 됩니다.이 방법은 식물을 위해 개발되었지만 HeLa 세포, E.coli 및 S.Cerevisiae와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 MSMO 배지를 준비하고 1몰 수산화칼륨으로 pH를 5.7로 조정합니다. 그런 다음 섭씨 121도에서 15분 동안 용액을 오토클레이브합니다.실험 시작 직전에 배지에 보충제를 추가합니다. 이제 100ml 플라스크에서 50ml의 MSMO 배지에서 형질전환 PSBL Arabidopsis thaliana 세포 배양을 성장시킵니다. 그런 다음 플라스크를 궤도 플랫폼 셰이커에 놓고 빛 아래에서 섭씨 20도에서 130rpm으로 셀을 부드럽게 교반합니다.7일마다 1-10 용액에서 신선한 배지로 세포를 계대배양합니다. 다음으로, 원뿔형 플라스크에 장착된 나일론 메쉬가 있는 유리 깔때기를 사용하여 진공 펌프에 연결하여 로그 성장 단계 동안 세포를 수확합니다. 그런 다음 건조된 세포를 알루미늄 호일로 싸서 액체 질소로 얼립니다.사전 냉각된 믹서 밀을 사용하여 20Hz의 진동 주파수로 설정합니다. 수확 및 냉동 식물 세포 물질을 2분 동안 미세한 분말로 균질화합니다. 다음으로, 액체 질소, 사전 냉각 장비를 사용하여 샘플당 분쇄 분말 3g을 분취하여 해동을 방지합니다.그런 다음 액체 질소 사전 냉각된 모르타르를 사용하여 분쇄 분말을 3ml의 얼음 저온 용해 완충액으로 해동할 때까지 분쇄합니다. 해동된 샘플을 즉시 2개의 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브로 나눕니다. 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 20, 817g으로 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.샘플이 원심분리되는 동안 샘플당 100마이크로리터의 IgG 세파로스 비드를 분취합니다. 1ml의 용해 완충액을 추가하고 볼텍싱으로 비드를 다시 현탁시킵니다. 2, 000g에서 3초 동안 플래시를 회전시키고 용해 버퍼를 버립니다.마지막으로 400마이크로리터의 용해 완충액에 비드를 다시 현탁시킵니다. 원심분리 후 3ml의 투명 식물 용해물을 15ml 원추형 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 사전 평형화된 비드를 식물 용해물에 첨가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 회전하는 바퀴에서 혼합물을 배양합니다.혼합물을 진공 매니폴드 상단에 위치한 35마이크로미터 공극 크기의 필터가 있는 스핀 컬럼의 루어 잠금 캡에 연결된 주사기로 옮깁니다. 비드에 해를 끼치지 않도록 부드러운 압력으로 진공 펌프를 켜서 장치를 통해 용해물을 통과시킵니다. 결합되지 않은 용해물은 매니폴드의 기저부에 위치한 waste station으로 배출되고 비드에 결합된 단백질 복합체는 필터에 남아 있습니다.세포 용해물에서 주사기를 비우면 10ml의 세척 버퍼를 추가하여 비드를 세척합니다. 그런 다음 밀리리터의 용출 버퍼를 추가하여 두 번째 세척 단계를 수행합니다. 이제 주사기와 루어 잠금 캡을 제거합니다.컬럼의 하단 캡을 닫고 강화된 형태의 담배 에칭 바이러스인 프로테아제 50개를 함유한 용리 완충액 400마이크로리터를 비드에 추가합니다. 1, 000rpm으로 설정된 테이블 셰이커에 컬럼을 놓고 섭씨 16도에서 30분 동안 놓습니다. 그런 다음 컬럼에 50단위의 프로테아제를 추가로 추가하고 이전 단계와 같이 셰이커에서 혼합물을 배양합니다.다음으로, 하단 캡을 제거하고 2ml 마이크로 원심분리 튜브에 컬럼을 교체합니다. 20, 817g에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 용리액을 수집하고 단백질 및 대사 산물 추출을 진행합니다. 추출을 시작하려면 1ml의 3 대 1 MTBE 메탄올 물 용매를 용리액에 첨가합니다.튜브를 뒤집어 샘플과 혼합합니다. 다음으로, 혼합물에 0.4 밀리리터의 1-3 메탄올 수용액을 첨가하고 튜브를 뒤집어 샘플을 혼합한다. 그런 다음 실온에서 20, 817g의 시료를 2분 동안 원심분리하여 상 분리를 허용합니다.1mL 수동 액체 취급 피펫을 사용하여 지질이 포함된 상부상을 제거합니다. 그런 다음 0.2ml의 메탄올을 넣고 튜브를 뒤집어 샘플을 혼합합니다. 20에서 817g의 원심분리기를 실온에서 2분 동안 가열하고 대사 산물 측정을 위해 새 튜브에서 극성 상을 수집합니다.단백질 펠릿이 제거되는 것을 방지하기 위해 튜브 바닥에 약 50마이크로리터의 극성상을 남겨 두십시오. 다음으로, 극성 상이 포함된 튜브를 원심 증발기에서 밤새 건조시킵니다. 단백질 펠릿 튜브를 30-60분 동안 건조시켜 과도하게 건조되지 않도록 합니다.형질전환 애기장대 탈리아나 세포 배양에서 질량 분석법과 함께 단백질-단백질 및 단백질-대사 산물 상호 작용을 사용하여 원스텝 친화성 정제를 확인했습니다. NDPK1을 발현하는 세포 배양은 빈 벡터, NDPK2 및 NDPK3 샘플과 비교할 때 발린-류신, 이소류신 글루타메이트, 류신 이소류신 및 이소류신 페닐알라닌에서 상당한 농축을 보여줍니다. 알려진 단백질-단백질 및 단백질-대사 산물 상호 작용을 찾기 위해 NDPK1과 함께 용리되는 13개의 단백질과 4개의 디펩타이드를 스티치 데이터베이스에 대해 퀴어합니다.주요 연관성은 APX1 ortholog와 알데히드 탈수소효소 계열, 번역 시작 인자 FBR12 및 번역 시작 인자 2 subunit alpha homolog 사이에서 볼 수 있습니다. 확인된 디펩타이드는 보고된 단백질 파트너를 보여주지 않습니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 실험 내내 샘플, 장비 및 시약을 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 현미경 열영동 또는 활성 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 분자 간의 직접적인 상호 작용 또는 단백질 활성에 대한 리간드의 추론을 결정할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 신뢰할 수 있는 결과를 얻고 선택한 단백질의 리간드를 식별하기 위해 전체 절차 중에 샘플을 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.메탄올 및 MTBE 용액으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 하며 이 절차를 수행하는 동안 항상 흄 후드 아래에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

의 단백질 단지의 식별<em&gt; 대장균</em&gt; 직렬 질량 분석법과 함께 순차적 펩타이드의 동질 정화를 사용하여

이 비디오는 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 진핵 세포에서 단백질 복합체를 정제하는 기술인 탠덤 친화성 정제를 보여줍니다. 이 복합체에는 서로 다른 항원결정기 태그로 표지된 두 개의 단백질이 포함되어 있습니다. 두 개의 서로 다른 태그에 대한 친화력을 가진 두 개의 수지를 순차적으로 사용하여 복합체를 정제할 때, 용리액에 두 단백질이 모두 존재하면 둘 사이의 상호 작용을 확인할 수 있습니다.

단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 Tandem Affinity Purification Assay

기술 비교, 정량 프로테오믹스 방법은 서로 다른 조건에서 multiprotein의 단지의 조성에 대한 통찰력을 얻는 것을 목표로하고 유 전적으로 서로 다른 변종을 비교하여 보여줍니다. 정량 분석​​을 위해 자당 밀도 구배 상이한 분획 같은 부피는 질량 분석법에 의해 혼합되고 분석된다.

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

여기에서는, 극저온 온도에서 고체 밀링에 의해 포유류 세포를 파괴 얻어진 세포 분말로부터 세포 추출물을 제조하고, 항체의 결합 마이크론 스케일 상자성 비드에 친 화성 포획하여 관심 단백질 복합체를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

Cryomilled 포유 동물 세포에서 단백질 단지 선호도 캡처

여기에서는 진핵 세포에서 단백질 복합체의 발현, 분리 및 특성화를 위한 새롭고 강력하며 효율적인 TAP(Tandem Affinity Purification) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 개별 복합체의 생화학적 특성화뿐만 아니라 그 기능을 조절하는 새로운 상호작용자 및 번역 후 변형의 식별에 활용될 수 있습니다.

진핵 세포에서 단백질 복합체의 탠덤 선호도 정화

안정화 신규 이차원 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동에 결합 된 아민 반응성 단백질 가교제를 사용하여 변성 조직 파쇄물로부터 천연 단백질 복합체를 분리하는 방법 (PAGE) 시스템이 제공된다.

다량 체-PAGE : 생물학적 샘플에서 캡처하는 방법 및 해결 단백질 단지

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

이 원고는 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 새로운 방법은 경쟁 바인딩 파트너와 함께 형성 된 복합물 뿐만 아니라 유엔 complexed 개별 단백질을 제외 하는 동안 특정 격리 및 어떤 두 상호 작용 단백질의 다운스트림 proteomic 특성화를 촉진 한다.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

이 기사에서는 6X-histidine 태그로 라벨링된 인간 재조합 단백질인 flap endonuclease 1(FEN1)의 친화성 정제 절차를 제공합니다. 이 프로토콜은 태그된 단백질의 정제를 위해 두 개의 뚜렷한 고정화된 금속 이온 컬럼을 사용하는 것을 포함합니다.

Fast Protein 액체 크로마토그래피 시스템을 사용한 6X-His-Tagged 단백질의 친화성 정제 

학습하세요 단백질-단백질 및 단백질-대사산물 상호작용을 병렬 분석하는 친화력 정화법을 Arabidopsis thaliana 세포 배양에서. 이 방법은 질량 분석을 활용하여 생체 내 상호작용 분자를 효율적으로 식별합니다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

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