이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 새끼 쥐의 서로 다른 뇌 영역에서 인터뉴런 전구체를 채취하고, 이 세포를 연령이 일치하는 수혜자에게 이식하여 환경 변화가 인터뉴런의 운명과 성숙에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 내재적 유전 프로그램과 환경 신호가 신경 세포의 운명을 조각하기 위해 어떻게 상호 작용하는지에 대한 발달 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 인터뉴런 전구체(interneuron precursors)가 새로운 뇌 환경으로 이식된 후 형성된 노화의 변화를 분석할 수 있다는 것입니다.

세포 채취 및 이식 단계를 시각적으로 시연하는 것은 기술의 작은 오류로 인해 비효율적이고 실패한 이식 실험으로 이어질 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 시작하려면 출생 후 1일 강아지 뇌의 전전두엽에 면도날 하나를 삽입하고 첫 번째 면도날 바로 뒤쪽 슬롯에 추가 면도날을 삽입하여 0.5mm 슬라이스 2개를 생성합니다. 선조체 조각을 거품이 일끈 자당 인공 뇌척수액 또는 sACSF가 있는 페트리 접시에 옮기고 나머지 뇌 조직을 얼음에 sACSF가 있는 페트리 접시에 넣습니다.

절편을 해부 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 양쪽 반구의 선조체를 집어 50ml 튜브의 sACSF에 넣은 선조체 덩어리를 얼음 위에 올려 채취합니다. 형광 리포터 마우스에서 뇌를 채취한 경우 형광 현미경을 사용하여 선조체 td-tomato 신호와 구상팔리두스의 더 강한 형광 신호를 구별합니다. 해마를 제거하려면 집게를 사용하여 정중선을 따라 뇌를 반구하고 한쪽 반구를 해부 현미경 내측 표면이 위로 향하게 놓습니다.

겸자를 사용하여 복부 뇌 조직을 제거하고 피질의 등쪽과 심실을 따라 전후 접근에 걸쳐 있는 소시지 모양의 해마를 식별합니다. 집게의 끝을 전방 해마 앞에 삽입하고, 해마 피질 경계를 따라 꼬집으면서 집게를 후방으로 전진시켜 해마와 피질을 부드럽게 분리합니다. 분리된 조직을 얼음 위의 50ml sACSF 튜브에 넣고 반대쪽 반구에 대해 해마 채취를 반복합니다.

그런 다음 반쪽이 절제된 피질 내측을 아래로 향하게 놓고 집게를 사용하여 피질의 가장 등쪽, 배쪽, 앞쪽 및 뒤쪽 부분을 제거합니다. 내측 피질의 나머지 사각형을 얼음 위의 50ml sACSF 튜브로 옮깁니다. 뇌를 제거한 후 소뇌와 전피질 또는 후각구를 통해 뇌 복부 쪽을 아래로 고정합니다.

구부러진 집게를 사용하여 각 반구의 밑에 있는 해마 및 다른 조직으로부터 후방 피질을 부드럽게 분리합니다. 그리고 등쪽 피질을 앞으로 벗겨 기저 구조를 드러냅니다. 겸자를 사용하여 정중선의 한쪽 반구에 있는 해마를 꼬집고 뇌에서 옆으로 떼어내어 해마를 제거합니다.

얼음 위에 올려 50ml짜리 sACSF 튜브에 해마를 넣고 같은 방법으로 반대쪽 해마를 채취합니다. 그런 다음 선조체의 가장자리를 부드럽게 긁어 주변 조직에서 느슨하게 합니다. 선조체 아래를 부드럽게 꼬집어 선조체 조직을 수확합니다.

양쪽 반구에서 피질을 채취한 후, 앞서 시연한 바와 같이, 형광 해부 내시경으로 선조체를 옮깁니다. 집게를 사용하여 각 선조체에서 밝은 빨간색 td-tomato 양성 구상 pallidus 조직을 제거합니다. 모든 조직을 채취한 후 조직을 5mm 원형 바닥 튜브로 옮기고 각 채취 튜브의 sACSF를 2mL의 새로 준비된 프로나제-sACSF 용액으로 교체하여 가끔 가볍게 튕기면서 실온에서 20분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 pronase-sACSF를 1-2 밀리리터의 재구성 용액으로 조심스럽게 교체하고 불로 연마 된 파스퇴르 파이프로 조직을 기계적으로 해리합니다. 조직이 흐리고 조직 덩어리가 보이지 않는 경우, 50미크론 필터를 통해 세포 용액을 5밀리리터 원형 바닥 튜브에 걸러서 형광 활성화 세포 분류 전에 세포 덩어리를 제거합니다. 유세포 분석에서 세포를 받은 후 원심분리를 위해 세포 현탁액을 1.5ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

원심분리 후 각 튜브에서 마지막 20마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 흡인하고 계수를 위해 펠릿을 재구성합니다. 필요한 경우 sACSF가 있는 세포 용액을 마이크로리터당 농도의 10에서 5번째 세포의 1-3배로 희석합니다. 끝이 가는 마이크로피펫에 미네랄 오일을 넣습니다.

마이크로피펫을 나노리터 주입기에 부착하고 나노리터 주입 장치를 마그네틱베이스에 부착된 매니퓰레이터에 고정합니다. 첫 번째 새끼가 얼음 위에서 마취되는 동안 세포 용액을 여러 번 피펫팅하여 균질한 세포 분포를 보장합니다. 미네랄 오일을 배출하고 피펫에 단일 셀 현탁액을 완전히 채웁니다.

발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 강아지를 페트리 접시 덮개에 놓고 머리는 접착 퍼티에 올려 머리 꼭대기가 비교적 평평하도록 합니다. 다이아몬드 구멍이 있는 실험용 테이프로 머리를 덮고, 머리가 단단히 고정되고 구멍을 통해 람다가 보일 때까지 피부가 늘어날 때까지 테이프를 당깁니다. 고정된 강아지를 나노리터 주입기 아래로 옮기고 팁이 람다 바로 위에 오도록 마이크로피펫을 내립니다.

매니퓰레이터의 X, Y 좌표를 관찰하고 마이크로피펫이 머리의 내측, 측면 및 전후 축을 따라 적절한 좌표에 위치할 때까지 매니퓰레이터 손잡이를 조정합니다. 팁이 피부에 작은 오목한 부분을 만들 때까지 마이크로피펫을 내리고 z축 매니퓰레이터 손잡이를 단단하지만 부드럽게 돌려 마이크로피펫이 피부를 통해 두개골을 뇌로 밀어 넣습니다. 끝이 텐트 모양의 원뿔 모양의 피부 원뿔로 둘러쌀 때까지 마이크로 피펫을 약간 집어넣습니다.

그리고 z축을 따라 좌표를 봅니다. 그런 다음 마이크로피펫을 적절한 실험 깊이로 낮추고 세포를 주입합니다. 세포가 전달된 후 15초 동안 기다렸다가 마이크로피펫을 후퇴시키고 원하는 경우 두 번째 위치에서 주입을 반복합니다.

강아지를 가열 패드에 놓고 완전히 회복될 때까지 모니터링한 후 집 케이지로 다시 옮깁니다. 이식된 세포는 수십 개에서 수천 개에 이르는 다양한 세포 생존율로 표적 뇌 영역 전체로 이동합니다. 이식된 세포는 적절한 영역 내에 국한되어 있으며, 많은 세포가 인터뉴런 형태와 잘 특성화된 인터뉴런 신경화학적 마커를 나타냅니다.

기증자 세포는 이종성 이식을 통해 새로운 환경에 이식될 때에도 생존하고 성숙합니다. 이식된 세포의 전기생리학적 분석은 잘 정의된 중간뉴런 아형을 대표하는 성인과 같은 생리학적 특성과 뚜렷한 발사 패턴을 보여주며, 이는 이식된 중간뉴런이 숙주 환경에서 적절하게 성숙할 수 있음을 시사합니다. 이식된 세포는 또한 자발적인 흥분성 시냅스후 전류를 나타냅니다.

채널로돕신-2를 발현하는 이식된 중간뉴런에 인접한 피라미드 세포에서 기록하면 이러한 내인성 피라미드 세포에서 청색광에 의해 유발되는 시냅스후 GABAergic 전류가 드러납니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 얼음 위에 보관하고 파스퇴르 피펫으로 세포를 부드럽게 분쇄하여 세포 사멸을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이식된 세포에서 단일 세포 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 환경 변화가 세포의 전사체에 미치는 영향을 보다 완벽하게 정의할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 신생아 새끼의 다른 뇌 영역에서 인터뉴런 전구체를 분리하고 이 세포를 나이가 일치하는 출생 후 새끼의 다양한 뇌 영역에 이식할 수 있어야 합니다.