Name: 이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 생후 마우스 뇌에서 interneuron 선구체를 분리하고 동일 연령 수용체에 이식하는 방법을 통해 신경 발달 과정에서 세포 운명과 성숙이 환경 변화에 어떻게 영향을 받는지 연구하는 기술을.

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이 연구는 건강의 국가 학회 (K99MH104595)와 T.J.P. NICHD 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 우리는 그 실험실에서이 방법은 원래 설립 Gord Fishell 감사 합니다.

모든 실험 절차 국립 보건원의 지침에 따라 실시 했다 고 NICHD 동물 관리 및 사용 위원회 (ACUC)에 의해 승인 했다. 아래에 설명 된 프로토콜 활용 Nkx2.1-CreC / +; Ai9+ MGE 파생 interneuron 선구자, 수확 새끼 하지만 어떤 원하는 형광 기자 마우스 라인에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 남성과 여성 이른 출생 후 마우스 (P0-P2)는 기증자와 호스트 조직에 대 한 무차별 사용 되었다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>자당 인공 뇌 척수 (sACSF) 다음 제조 법 (mm에서 단위)에 따라 준비: 87 NaCl, 26 NaHCO3, 2.5 KCl, 1.25 NaH2포4, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 10 포도 당, 75 자당 95 %O 포화 2, 5% CO2 pH 7.4 =.</li>
	<li>350 mL 순수 ddH2O 비 커 최종 원하는 볼륨에 따라 채우기 (sACSF의 500 mL에 1-2 담가 충분 해야 한다), 자석 볶음 바 추가 하 고 저 어 접시에 비 커를 놓습니다.</li>
	<li>Weight 모든 소금 (NaCl, NaHCO3, KCl, NaH2포4, 포도 당, 자당), 한 시간에 하 고 다음 표에 따라 물에 추가 합니다. 금액은 최종 원하는 볼륨에 따라 조정할 수 있습니다.<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시 약</td>
				<td>분자량</td>
				<td>농도 (mM)</td>
				<td>그램/500 mL</td>
			</tr>
<tr>
<td>염화 나트륨</td>
				<td>58.44</td>
				<td>87</td>
				<td>2.54</td>
			</tr>
<tr>
<td>나트륨 중 탄산염</td>
				<td>84.01</td>
				<td>26</td>
				<td>1.09</td>
			</tr>
<tr>
<td>염화 칼륨</td>
				<td>74.55</td>
				<td>2.5</td>
				<td>0.09</td>
			</tr>
<tr>
<td>인산 이수소 나트륨</td>
				<td>119.98</td>
				<td>1.25</td>
				<td>0.08</td>
			</tr>
<tr>
<td>포도 당</td>
				<td>180.16</td>
				<td>10</td>
				<td>0.9</td>
			</tr>
<tr>
<td>자당</td>
				<td>342.3</td>
				<td>75</td>
				<td>12.84</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
	<li>95% O2, 5% CO2 (carboxygen) CaCl2 (0.25 mL 500 mL sACSF에 대 일 분 솔루션에서)의 적절 한 금액을 추가 하기 전에 적어도 20-30 분, MgCl2 (3.5 mL 500 mL sACSF에 대 일 분 솔루션에서)와 솔루션 거품 .</li>
	<li>표준 pH 미터를 사용 하 여 pH를 확인 하십시오. 정확 하 게 준비 솔루션 있어야 pH 7.4 =.</li>
	<li>순수한 ddH2O 졸업된 실린더에서 500 mL의 최종 볼륨을 솔루션을가지고.</li>
	<li>sACSF 수 1-2 일 앞두고 준비. 사용 하기 전에, 얼음에 배치 하 고 해 부의 시작 하기 전에 적어도 15 분 동안 carboxygen와 거품 sACSF 해 부를 통해 버블링의 병을 유지.</li>
</ol>2. 해 부 준비
<ol><li>다음 도구 소독/압력가 이어야 한다: 적어도 하나의 작은 좋은 날카로운가 위, 2 잘 집게 (스타일 #5), 미세 집게, 뇌 matrice 형과 여러 면도날 단면 곡선. 작은 주걱 두개골에서 뇌를 제거 하는 옵션입니다.</li>
	<li>접시 (9 cm, 4 cm 직경)와 해 부 현미경 근처 작업 역 50 mL 원뿔 플라스틱 관 격리 된 두뇌 지구를 수집 하 고 큰 구멍 플라스틱 전송 펫, 모든 얼음에 보관 합니다. 얼음에 carboxygenated sACSF의 전체 여러 50 mL 튜브를 준비 합니다. 하나 이상의 뇌 영역 해 부, 제대로 있는지 확인 하 고 명확 하 게 레이블 컬렉션 튜브와 오염을 피하기 위하여 전송 펫.</li>
	<li>저체온증, 통해 강아지의 얼음 마 취에 대 한 추가 얼음 양동이 있고 시체를 처리 하는 적절 한 유해 폐기물 가방.</li>
	<li>조직 분쇄에 대 한 화재 광택 유리 펫 파스퇴르를 준비 합니다. 분 젠 버너를 사용 하 여 소독 하는 피 펫의 끝 모양. 다른 구멍 구멍과 여러 펫을 준비: 큰 (~ 600 μ m), 중간 (~ 300 µ m) 그리고 작은 (~ 100 µ m). 다른 분쇄 속도 보장 하기 위해 물을 사용 하 여 도움말을 통해 흐름에 밖으로 테스트 합니다. 각 종류의 적어도 하나의 피펫으로 각 격리 된 뇌 영역에 대 한 필요 하지만 막힘 또는 팁을 깨고 각 크기에 대 한 여분의 몇을 데는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 이식 준비
<ol><li>뾰족한 유리 micropipettes를 준비 하는 전극 끌어당기는 사람을 사용 합니다. 휴식 또는 경사 날카로운 각도 포인트를 만들기 위해 팁 팁 ~ 20-40의 직경을 갖는 µ m. 시각적으로 검열 하십시오 팁 되도록 먼지 현미경 또는 잔여 유리 입자는 조리개를 방해.</li>
	<li>미세 바늘 주사기를 사용 하 여 완전히 채울 유리 제 micropipette 미네랄 오일. Nanoject 장치 (또는 다른 microinjection 장치)에 micropipette를 삽입 합니다. Nanoject III에 대 한 다음 프로그램을 설정: 볼륨 60 = nL, 속도 = 30, 주기 25, 지연 = = 1 s.</li>
	<li>마그네틱 베이스에 연결 된 조작자를 Nanoject 고 조정 조작자는 Nanoject, 곧장 가리키는 하지 x 또는 y 따라 기울이면 축.</li>
	<li>일부 접착제 퍼 티 연결 (~ 1-2 cm P0-P2 새끼에 대 한)에서 강아지의 머리를 휴식을 높은 표면을 만드는 페 트리 접시의 커버의 상단에.</li>
	<li>실험실의 컷 ~ 6-8 cm 긴 줄무늬 테이프 하 고 중간에 다이아몬드 모양의 구멍을 확인 합니다. 테이프는 또한 피부를 스트레칭 하 고 랜드마크 및 대상된 지역의 쉽게 시각화를 허용 하면서 절차 동안, 강아지의 머리를 안정 시키기 위해 사용 됩니다.</li>
	<li>주입 역 난방 패드를 준비 하 고 주사를 시작 하기 전에 '낮은' 설정 설정. 패드 커버 몇 종이 수건 이나 기저귀 패드와 함께.</li>
	<li>만약 여러 개의 이식 조건, 수행 수행 준비가 작은 위 태그 발가락/꼬리 클리핑 받는 다른 주사 새끼.</li>
</ol>4. P0-P2 마우스 뇌의 제거
<ol><li>바로 시작 하기 전에 절차, 냉장된, carboxygenated sACSF로 여러 접시를 채우십시오. 또한 컬렉션 tube(s) 채울 25 mL sACSF.</li>
	<li>얼음 아래 일부 parafilm 또는 장갑과 잘 적용 하는 곳에 P0-P2 강아지를 바꿈. 5 분 타이머를 설정 하 고 그것을 시작 합니다. 그 시간 후에 강아지를 제거 하 고는 hindpaw의 곤란에 응답 하지 않는 확인 하십시오.</li>
	<li>강아지 목을 벨을 sACSF로 가득 페 트리 접시에 머리를 수집 합니다. 두개골을 노출 하는 중간 선 따라 피부를 잘라.</li>
	<li>Hindbrain/척수에서 두개골에 오프닝 찾아서 두개골의 등 쪽 부분을 따라 집게의 한쪽 끝을 삽입 합니다. 부드럽게 정중 선에서 두개골을 파악 하 고 '껍질' 두뇌를 손상 하지 않도록 주의 되 고, 뇌를 옆으로 멀리 조각.</li>
	<li>두개골의 등 쪽과 측면의 제거를 따라 부드럽게 모든 영역을 손상 하지 않으려고 하는 두뇌의 복 부 표면 아래 떠 서 여 두개골에서 뇌를 제거 하는 집게 또는 주걱을 사용 합니다. 장소 다른 배양 접시에 두뇌 carboxygenated sACSF로 가득합니다. 
	  참고: 우리는 해 마가와 피 질 해 부에 대 한 두 개의 서로 다른 전략을 제시. 첫 번째 전략 (단계 5.1-5.10)는 두 번째 전략 (단계 6.1-6.7) 깔끔하게 globus pallidus 및 다른 뇌 구조는가 분리 하는 형광 기자 마우스 필요 반면 어떤 마우스 라인에 대 한 유용 합니다. 가 적절 하지 않으면 다음 두 가지 방법 중가 특정 부분 무시</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig1.jpg"> 그림 1 : 회로도 및 뇌 해 부, 기술 # 1에 대 한 이미지 해 부 기술 단계 5.1-5.10에에서 설명 된입니다. Striatal 조직, 필요한 경우를 뇌 행렬 복 부 측에 P1 뇌를 놓습니다. 면도날을가 통해 코로나 섹션 앞쪽 뇌를 통해 matrice 슬롯에 넣으십시오. 두 반구에서 striatal 조각을 제거, 해 마 앞쪽을 포함 된 모든 섹션에 대 한 반복. Striatal 조직이 적절 하지 단순히 hemisect는 뇌 반구 내측 측 최대는 접시에 놓고 노출 해 마 복 부 중간 뇌 구조 (시상, 기초 중추, 등)을 제거 합니다. 핀셋을 사용 하 여 해 마의 대 타 그리고 반구를 뒤집어 핀셋을 사용 하 여 청크 대뇌 피 질의 조직 해 부. 도식 반구 어디 인하 striatal 섹션을 제거 하는 것을 통해 수직 블랙 라인. 눈금 막대 500μm =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
5. 수확가, 해 마, 외피, 기술 #1
<ol><li>전체 두뇌 matrice 형, 복 부 측을 단면에 배치 합니다. (이전 후 각 관)을 통해 뇌의 가장 앞쪽 부분을 통해 1 면도날을 배치 합니다.</li>
	<li>다른 면도날 단지 0.5 m m 슬라이스를 생성 하는 첫 번째 후부를 삽입 하 고 추가 면도날이 하나 후부 장소.</li>
	<li>Carboxygenated sACSF와 페 트리 접시에이 분할 영역을 전송 하 고 sACSF와 함께 별도 접시에 두뇌의 나머지를 장소. 가 시각화 해 범위를 striatal 분할 영역을 전송 합니다. 이러한 조각 앞쪽가의 큰 부분을 포함 하 고 해 마 부족 해야 합니다. Nkx2.1-Cre+; 범위 해 부 형광을 사용 하 여 Ai9+ 슬라이스 약한 striatal tdTomato 차별화 globus pallidus의 강한 tdTomato 신호에서 신호.</li>
	<li>또는 형광 없이, sACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 모든 섹션 및 전송 striatal 덩어리 두 반구에서가 밖으로 꼬집어, 얼음에 저장.</li>
	<li>Hemisect 집게 또는 면도칼 블레이드를 사용 하 여 중간 선 따라 뇌 반구 그렇게 중간 표면 향하게 누워.</li>
	<li>이 조직에서 꼬 집는 집게와 복 부 뇌 조직 (시상, 기초 중추, 등)을 제거 합니다. 언제 완료, 해 마 (등 피 질에 따라 anteroposterior 축에 걸친 소시지 모양의 구조) 하 고 피 심 실 측 명확 하 게 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>해 마를 제거 하려면 이전 해 마 앞 집게의 끝을 삽입 하 고 조심 스럽게 분리 해 마 피 질에서 대뇌 피 질의 hippocampal 국경 곤란 하 게는 집게를 뒤로 이동. SACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 격리 해 마를 전송, 얼음에 저장.</li>
	<li>피 질 부, hemisected 피 층 중간 쪽을 아래로 놓습니다. 다음은 집게를 사용 하 여 가장 등 꼬집어, 복 부, 앞쪽 및 후부 부분 중간 somatosensory 피, ~ 2 m m x 2 m m.의 사각형 덩어리를 두고 피 플립 피 질 그래서 중간 쪽이 고 어떤 과잉 비 대뇌 피 질의 조직 (시상의 깨끗 한 기초 중추, 등.) 에 필요한 경우 중간 표면. SACSF 제대로 분류 50 mL 튜브에 피 덩어리를 전송, 얼음에 저장.</li>
	<li>수집 된과 피 질 하 다른 반구와 절차를 반복 영역.</li>
	<li>배양 접시는 sACSF 춥고 신선한 유지 되도록 새끼 사이 sACSF를 대체 하는 모든 새끼에 대 한이 절차를 반복 합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig2.jpg"> 그림 2 : 회로도 및 뇌 해 부, 기술 # 2에 대 한 이미지 해 부 기술 단계 6.1-6.7에에서 설명 된입니다. 위로 해 접시 등 쪽 측에 뇌를 고정 합니다. 피 질 필 링 후 앞으로, 해 마가 표시 되 고 이전 기술에 설명 된 대로 피 섹션을 제거할 수 있습니다 다음 제거 될 수 있다. 유전자 변형 마우스 선 따라가 globus pallidus 및 다른 조직을 제거 하 정리 수 있습니다. Nkx2.1Cre;에 Ai9 마우스 선, globus pallidus는 토마토 + 셀는 비해 상당히 높은 밀도. 눈금 막대 = 500 μ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
6. 수확가, 해 마, 외피, 기술 #2
<ol><li>뇌 복 부 측 아래로 sACSF를 포함 하는 sylgard 코팅 페 트리 접시에 놓고 앞쪽 피 질, 소 뇌 및 후 각 전구를 통해 그것을 아래로 핀.</li>
	<li>한 반구와 시작 하는 것 사용해 부드럽게 기본 해 마에서 후부 대뇌 피 질 및 다른 조직 분리 곡선된 겸 자. 부드럽게 페 트리 접시에 껍질을 벗 겨 피 질을 하다. 다른 반구에 대 한 반복 합니다. 된와가 노출 된 뇌에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 하는 중간에 한 해 마를 꼬 집 고 껍질을 제거 하는 옆 해 마. 얼음에 컬렉션 유리병에 놓고 다른 해 마와 함께 반복 합니다.</li>
	<li>가, 주변 조직에서 그것을 풀고가의 가장자리 주위 긁어 부드럽게. 다음 그것에서 밑을 곤란 하 게 하 여 여가 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 추가. 다른가를 반복 합니다.</li>
	<li>대뇌 피 질의 섹션 단계 5.8에서에서 설명한 대로 수확 될 수 있습니다.</li>
	<li>기자는 유전자 변형 마우스 라인을 사용 하는 경우 (예: Nkx2.1-Cre; Ai9, Lhx6-GFP, 등), sACSF와 페 트리 접시가 전송 및 형광 범위 해 부 아래 볼. 집게를 사용 하 여 (에서 Nkx2.1-Cre;가에서 어떤 비 striatal 조직을 제거합니다 Ai9 마우스, globus pallidus 훨씬 높은 MGE 파생 된 tdTomato + 셀 밀도 비해 서 모든 '밝은' 조직 제거). 모든가 대 한 반복 합니다.</li>
	<li>배양 접시는 sACSF 춥고 신선한 유지 되도록 새끼 사이 sACSF를 대체 하는 모든 새끼에 대 한이 절차를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 단일 셀 Dissociations 생성
<ol><li>해 부를 완료 한 후 준비 1 mg/mL 나 솔루션 10 mg 나 무게와 10 mL carboxygenated sACSF에 용 해.</li>
	<li>전송 5 ml 50 mL 수집 튜브에서 조직 라운드 하단 튜브 나 sACSF 솔루션의 2 개 mL를 포함 하. 조직 샘플을 혼합 하는 인큐베이션 기간 동안 3-4 번 손가락으로 튜브 떨고/터치 실 온에서 20 분 동안 품 어.</li>
	<li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li><li><li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57723/57723fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57723/57723fig3large.jpg" target="_blank"></a><ol start="4"><li><li><li><li><li><li><li><li></ol>

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<li>Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+Nkx2.1-lineage+cells+in+the+mouse+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon.</a> J Comp Neurol. 506 (1), 16-29 (2008).</li>
<li>Thompson, L., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+differentiation%2C+and+connectivity+of+ventral+mesencephalic+dopamine+neurons+following+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Survival, differentiation, and connectivity of ventral mesencephalic dopamine neurons following transplantation.</a> Prog Brain Res. 200, 61-95 (2012).</li>
<li>Liang, Y., Agren, L., Lyczek, A., Walczak, P., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cell+survival+in+mouse+brain+can+be+improved+by+co-transplantation+of+helper+cells+expressing+bFGF+under+doxycycline+control%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cell survival in mouse brain can be improved by co-transplantation of helper cells expressing bFGF under doxycycline control.</a> Exp Neurol. 247, 73-79 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 하나의 중요 한 측면은 세포의 생존을 극대화 이다. 조직과 세포는 항상 얼음 감기 carboxygenated sACSF에서 보장 하는 것은 세포 생존을 촉진 하는 데 필요한입니다. 이 효율적인 해 부와 셀 다양 한 솔루션 및 두뇌 환경 외부 지출 시간의 길이 최소화 하기 위해 분리 전략을 필요 합니다. 뇌 영역 해 부 되 고 이식의 수에 따라 실험의 길이 감소 해 부 또는 이식 단계에서 원조 하는 파트너에 유리할 수 있다. 건강 하 고 강아지의 생존을 보장 하기 위해, 그것은 또한 얼음 마 취 시간 (< 4 분)을 최소화 하 고 이식 절차 동안 빛으로가 열 하는 강아지를 유지 하는 중요 한.
이식된 두뇌에 중요 한 변화 수, 다른 두뇌 수천을 포함 하는 동안 일부 이식할된 셀을 포함할 수 없습니다. 해 부에 대 한 여러 P0-P2 새끼를 결합 하거나 이식 세포 밀도 증가 및 둘 다의 가능성을 향상 시킬 것입니다 이식할된 새끼의 수를 증가 한 수 있는 접목, 수확 하...

적절 한 대뇌 피 질의 기능 필요 흥분 성의 프로젝션 뉴런을 억제 GABAergic 수, 명료한 형태학, electrophysiological 속성, 연결 된 매우 이질적인 인구 사이 균형 및 neurochemical 마커입니다. 비정상적인 개발 및 기능 수 (및 특정 interneuron 하위 그룹)의 정신 분열 증, 자폐증, 간 질1,2,3등 정신 장애의 pathobiology에 연결 되었습니다. 또한, 이러한 뇌 장애에 연루 된 많은 유전자는 젊은 수4농축 강력 하 게. 따라서, interneuron 운명 결정 및 성숙 조절 메커니즘의 이해는 정상적인 개발 및 수많은 뇌 질환의 잠재적인 etiologies 이해 필요 합니다.
개 수는 주로 두 가지 과도 배아 구조, 중간 그리고 꼬리 절 정령에서 태어난 (MGE 및 CGE, 각각). 이러한 postmitotic 세포 (interneuron 선구자)는 telencephalon 걸쳐 분산 그들은 다양 한 회로 통합할 수와 접선 마이그레이션 단계를 받 다. MGE 파생 수 세 크게 겹치지, neurochemically 정의 된 하위 그룹의 구성: 빠른 parvalbumin (PV+) 수, 비-빠른 somatostatin (SST+) 수 급상승 급상승 하 고 늦게 신경 급상승 질소 산화물 synthase (nNOS+) 수 hippocampal 아이비와 neurogliaform 세포를 구성 하는. 수많은 연구소 PV+ 또는 SST + 수, morphogens, interneuron 일어나, 생년월일 및 neurogenic 사단의 모드의 공간 그라디언트를 포함 하 여 초기 운명 결정을 통제는 MGE 내의 여러 메커니즘을 확인 했습니다. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 수 처음 '추기경 클래스'로 차별화 하 고 다음 점차적으로 성숙 '최종 클래스' 그들은 그들의 환경11상호 작용으로 제안 되었습니다. 최근의 증거는 나타냅니다 일부 성숙한 interneuron 하위 유전자 내장 돼 이러한 세포가 절 정령에 postmitotic로 나타내는 초기 정의 본질적인 유전 프로그램 이전 보다 더 큰 역할을 할 수 있습니다. 평가12,13. 그러나, 본질적인 유전 프로그램 별개 interneuron 하위 유형으로 차별화 실현 환경 신호 상호 작용 하는 방법의 핵심 문제 크게 미개척 남아 있습니다.
수많은 연구는 다양 한 뇌 영역, 성숙 세포를 융합 하 고 일반적으로 지역 내 생 회로14,15, 억제 하는 GABA를 해제 합의 결과에 직접 배아 MGE 셀을 이식 16,17,,1819. 이러한 관측을 약속 인간 유도 만능 줄기 세포 (hIPSC)를 사용 하 여에 상당한 관심을 생성-다양 한 뇌 질환을 치료 하는 수를 파생. 그러나, 하나의 중요 한 구성 요소 변환 방법 들에 대해 생각 한다 이러한 연구의 거의 평가이 이식할된 세포 성숙 수의 예상된 유형으로 성숙 하는 경우.
해결 하기 위해 어떻게 환경 영향 interneuron 분화 및 성숙, 전략 이식할된 수는 호스트의 기능 채택 여부를 시험 하기 위하여 새로운 뇌 환경에 미 숙 interneuron 선구자를 이식 하 고안 되었다 환경 또는 기증자 환경20에서 기능을 유지. MGE 이식은 MGE interneuron 및 수많은 두뇌 지역21에 걸쳐 분산 GABAergic 프로젝션 셀의 혼합된 인구를 포함 하기 때문에이 문제를 해결 하기 위해 적합 하지 않습니다. 이러한 MGE 셀 마이그레이션한 것 모르고 하나 평가할 수 있습니다 없습니다 완전히 어떻게 이러한 이식 두뇌 환경에 의해 영향을 받습니다. 이른 출생 후 timepoints에서 interneuron 선구자, 수확 하 여이 문제는 미 숙 셀의 마이그레이션을 완료 하 고 그들의 목표에 도달 하 여 피할 지역 뇌 하지만 최소한의 상호 작용 환경. 다른 두뇌 지구 사이 표현 차동 수의 특정 기능에 집중 함으로써, 하나는 다음 호스트 환경 interneuron 속성을 변경 하는 방법을 결정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 일반적인 접근 모든 조사에 적용 해야 새로운 환경에 도전 젊은 신경 세포를 검사 하 고 싶어 때 행동.

<table><tbody><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기</td><td>성 시그마</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>뇌 매트릭스</td><td>Roboz</td><td>SA-2165</td><td>선조체 수확 시에만 필요</td></tr><tr><td>파인 포인트 Dumont 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-4978</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5940</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>ThermoFisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫</td><td>ThermoFisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III</td><td>Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>수동 조작기 w/ 스탠드</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>M3301R/M10</td><td></td></tr><tr><td>5ml 둥근 바닥 플라스틱 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>149591A</td><td></td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>12556001</td><td></td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>ThermoFisher</td><td>12565100</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50um 필터</td><td>Sysmex</td><td>04-0042327</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>ThermoFisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>ThermoFisher</td><td>02-671-6</td><td></td></tr></tbody></table>

이른 출생 후 마우스 두뇌로 interneuron 선구자의 homochronic 이식

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

신경 운명 결정과 성숙 유전 프로그램 및 환경 신호 사이 복잡 한 상호 작용을 요구 한다. 그러나,이 분화 과정을 조절 하는 외부 메커니즘 대 내장의 역할 disentangling 모든 발달 neurobiologists에 대 한 수수께끼 이다. 이 문제는 GABAergic 수, 과도 미 발달 구조에서 태어나 고는 telencephalon 걸쳐 분산 수와 철새 단계를 받아야 하는 매우 다른 유형의 세포 인구에 대 한 확대 됩니다. 어떻게 다른 두뇌 환경 영향 interneuron 운명과 성숙 탐험, 우리 붙일 레이블된 미숙한 interneuron 선구자 신생아 쥐 (P0-P2)에 있는 특정 한 두뇌 지역에서 수확에 대 한 프로토콜을 개발 했다. 이 나이에, interneuron 마이그레이션이 거의 완료 되 고이 세포는 상대적으로 작은 시 냅 스 통합 된 그들의 마지막 휴식 환경에 거주 하는. Cytometry 통해 단일 셀 솔루션의 컬렉션, 다음 이러한 interneuron 선구자 P0-P2 wildtype 출생 후 새끼로 이식 됩니다. 두 homotopic 수행 하 여 (예를 들어, 피 질-피 질) 또는 heterotopic (예, 피 질-해 마) 이식, 수 평가 새 뇌 환경에 미 숙 수 도전 미치는 그들의 운명, 성숙, 그리고 회로 통합. 두뇌는 성인 쥐에 수확 될 수 있으며 immunohistochemical를 포함 하 여 이식할된 셀에 posthoc 분석의 광범위 한 분석 electrophysiological 및 transcriptional 프로 파일링. 이 일반적인 접근 방식을 제공 합니다 어떻게 가지 두뇌 환경 분석 결과를 전략 수 있습니다 신경 개발의 많은 측면에 영향을 미칠 수 사와 특정 신경 특성은 주로 내장 돼 유전자 프로그램에 의해 구동 확인 또는 환경 단서입니다.

이 프로토콜 이른 출생 후 뇌 (그림 1-2)에서 특정 뇌 영역을 수확, interneuron 선구자의 단일 셀 dissociations 수집 순진한 WT에 다양 한 뇌 영역으로이 세포를 이식 하는 방법을 보여 줍니다. 산 후 새끼 들 (그림 3) Posthoc 분석, interneuron 전조 이식 받은 두뇌 세포 형태학, neurochemical 마커 및 electrophysiological 속성 특성 P30-35 사이 수확 했다. 분석 실험의이 유형은 종종 P21-P30 정상적인 쥐에 사이 수행 됩니다 하지만 이식된 세포의 성숙 해 부/분리 절차 때문에 약간 지연 될 수 있습니다, 추가 5-10 일을 기다리는 것이 좋습니다 이것에 대 한 보상 지연된 성숙입니다. 수행 하는 분석의 유형 두뇌를 수확 하기 위해 적절 한 전략을 쓰게 ...

새로운 두뇌 지구에서 젊은 신경 도전 어떻게 환경 sculpts 신경 운명과 성숙에 중요 한 통찰력을 밝힐 수 있다. 이 프로토콜 interneuron 선구자 특정 두뇌 지역에서 수확 하 고 그들에 게 어느 homotopically를 이식 하는 절차에 설명 합니다 또는 출생 후 새끼의 뇌에 heterotopically.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

이 절차의 전반적인 목표는 출생 후 새끼 쥐의 서로 다른 뇌 영역에서 인터뉴런 전구체를 채취하고, 이 세포를 연령이 일치하는 수혜자에게 이식하여 환경 변화가 인터뉴런의 운명과 성숙에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이 방법은 내재적 유전 프로그램과 환경 신호가 신경 세포의 운명을 조각하기 위해 어떻게 상호 작용하는지에 대한 발달 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 인터뉴런 전구체(interneuron precursors)가 새로운 뇌 환경으로 이식된 후 형성된 노화의 변화를 분석할 수 있다는 것입니다.세포 채취 및 이식 단계를 시각적으로 시연하는 것은 기술의 작은 오류로 인해 비효율적이고 실패한 이식 실험으로 이어질 수 있기 때문에 매우 중요합니다. 시작하려면 출생 후 1일 강아지 뇌의 전전두엽에 면도날 하나를 삽입하고 첫 번째 면도날 바로 뒤쪽 슬롯에 추가 면도날을 삽입하여 0.5mm 슬라이스 2개를 생성합니다. 선조체 조각을 거품이 일끈 자당 인공 뇌척수액 또는 sACSF가 있는 페트리 접시에 옮기고 나머지 뇌 조직을 얼음에 sACSF가 있는 페트리 접시에 넣습니다.절편을 해부 현미경 아래에 놓고 집게를 사용하여 양쪽 반구의 선조체를 집어 50ml 튜브의 sACSF에 넣은 선조체 덩어리를 얼음 위에 올려 채취합니다. 형광 리포터 마우스에서 뇌를 채취한 경우 형광 현미경을 사용하여 선조체 td-tomato 신호와 구상팔리두스의 더 강한 형광 신호를 구별합니다. 해마를 제거하려면 집게를 사용하여 정중선을 따라 뇌를 반구하고 한쪽 반구를 해부 현미경 내측 표면이 위로 향하게 놓습니다.겸자를 사용하여 복부 뇌 조직을 제거하고 피질의 등쪽과 심실을 따라 전후 접근에 걸쳐 있는 소시지 모양의 해마를 식별합니다. 집게의 끝을 전방 해마 앞에 삽입하고, 해마 피질 경계를 따라 꼬집으면서 집게를 후방으로 전진시켜 해마와 피질을 부드럽게 분리합니다. 분리된 조직을 얼음 위의 50ml sACSF 튜브에 넣고 반대쪽 반구에 대해 해마 채취를 반복합니다.그런 다음 반쪽이 절제된 피질 내측을 아래로 향하게 놓고 집게를 사용하여 피질의 가장 등쪽, 배쪽, 앞쪽 및 뒤쪽 부분을 제거합니다. 내측 피질의 나머지 사각형을 얼음 위의 50ml sACSF 튜브로 옮깁니다. 뇌를 제거한 후 소뇌와 전피질 또는 후각구를 통해 뇌 복부 쪽을 아래로 고정합니다.구부러진 집게를 사용하여 각 반구의 밑에 있는 해마 및 다른 조직으로부터 후방 피질을 부드럽게 분리합니다. 그리고 등쪽 피질을 앞으로 벗겨 기저 구조를 드러냅니다. 겸자를 사용하여 정중선의 한쪽 반구에 있는 해마를 꼬집고 뇌에서 옆으로 떼어내어 해마를 제거합니다.얼음 위에 올려 50ml짜리 sACSF 튜브에 해마를 넣고 같은 방법으로 반대쪽 해마를 채취합니다. 그런 다음 선조체의 가장자리를 부드럽게 긁어 주변 조직에서 느슨하게 합니다. 선조체 아래를 부드럽게 꼬집어 선조체 조직을 수확합니다.양쪽 반구에서 피질을 채취한 후, 앞서 시연한 바와 같이, 형광 해부 내시경으로 선조체를 옮깁니다. 집게를 사용하여 각 선조체에서 밝은 빨간색 td-tomato 양성 구상 pallidus 조직을 제거합니다. 모든 조직을 채취한 후 조직을 5mm 원형 바닥 튜브로 옮기고 각 채취 튜브의 sACSF를 2mL의 새로 준비된 프로나제-sACSF 용액으로 교체하여 가끔 가볍게 튕기면서 실온에서 20분 동안 배양합니다.배양이 끝나면 pronase-sACSF를 1-2 밀리리터의 재구성 용액으로 조심스럽게 교체하고 불로 연마 된 파스퇴르 파이프로 조직을 기계적으로 해리합니다. 조직이 흐리고 조직 덩어리가 보이지 않는 경우, 50미크론 필터를 통해 세포 용액을 5밀리리터 원형 바닥 튜브에 걸러서 형광 활성화 세포 분류 전에 세포 덩어리를 제거합니다. 유세포 분석에서 세포를 받은 후 원심분리를 위해 세포 현탁액을 1.5ml 원추형 튜브로 옮깁니다.원심분리 후 각 튜브에서 마지막 20마이크로리터의 상등액을 제외한 모든 것을 흡인하고 계수를 위해 펠릿을 재구성합니다. 필요한 경우 sACSF가 있는 세포 용액을 마이크로리터당 농도의 10에서 5번째 세포의 1-3배로 희석합니다. 끝이 가는 마이크로피펫에 미네랄 오일을 넣습니다.마이크로피펫을 나노리터 주입기에 부착하고 나노리터 주입 장치를 마그네틱베이스에 부착된 매니퓰레이터에 고정합니다. 첫 번째 새끼가 얼음 위에서 마취되는 동안 세포 용액을 여러 번 피펫팅하여 균질한 세포 분포를 보장합니다. 미네랄 오일을 배출하고 피펫에 단일 셀 현탁액을 완전히 채웁니다.발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 확인한 후 강아지를 페트리 접시 덮개에 놓고 머리는 접착 퍼티에 올려 머리 꼭대기가 비교적 평평하도록 합니다. 다이아몬드 구멍이 있는 실험용 테이프로 머리를 덮고, 머리가 단단히 고정되고 구멍을 통해 람다가 보일 때까지 피부가 늘어날 때까지 테이프를 당깁니다. 고정된 강아지를 나노리터 주입기 아래로 옮기고 팁이 람다 바로 위에 오도록 마이크로피펫을 내립니다.매니퓰레이터의 X, Y 좌표를 관찰하고 마이크로피펫이 머리의 내측, 측면 및 전후 축을 따라 적절한 좌표에 위치할 때까지 매니퓰레이터 손잡이를 조정합니다. 팁이 피부에 작은 오목한 부분을 만들 때까지 마이크로피펫을 내리고 z축 매니퓰레이터 손잡이를 단단하지만 부드럽게 돌려 마이크로피펫이 피부를 통해 두개골을 뇌로 밀어 넣습니다. 끝이 텐트 모양의 원뿔 모양의 피부 원뿔로 둘러쌀 때까지 마이크로 피펫을 약간 집어넣습니다.그리고 z축을 따라 좌표를 봅니다. 그런 다음 마이크로피펫을 적절한 실험 깊이로 낮추고 세포를 주입합니다. 세포가 전달된 후 15초 동안 기다렸다가 마이크로피펫을 후퇴시키고 원하는 경우 두 번째 위치에서 주입을 반복합니다.강아지를 가열 패드에 놓고 완전히 회복될 때까지 모니터링한 후 집 케이지로 다시 옮깁니다. 이식된 세포는 수십 개에서 수천 개에 이르는 다양한 세포 생존율로 표적 뇌 영역 전체로 이동합니다. 이식된 세포는 적절한 영역 내에 국한되어 있으며, 많은 세포가 인터뉴런 형태와 잘 특성화된 인터뉴런 신경화학적 마커를 나타냅니다.기증자 세포는 이종성 이식을 통해 새로운 환경에 이식될 때에도 생존하고 성숙합니다. 이식된 세포의 전기생리학적 분석은 잘 정의된 중간뉴런 아형을 대표하는 성인과 같은 생리학적 특성과 뚜렷한 발사 패턴을 보여주며, 이는 이식된 중간뉴런이 숙주 환경에서 적절하게 성숙할 수 있음을 시사합니다. 이식된 세포는 또한 자발적인 흥분성 시냅스후 전류를 나타냅니다.채널로돕신-2를 발현하는 이식된 중간뉴런에 인접한 피라미드 세포에서 기록하면 이러한 내인성 피라미드 세포에서 청색광에 의해 유발되는 시냅스후 GABAergic 전류가 드러납니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포를 얼음 위에 보관하고 파스퇴르 피펫으로 세포를 부드럽게 분쇄하여 세포 사멸을 최소화하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 이식된 세포에서 단일 세포 염기서열분석과 같은 다른 방법을 수행하여 환경 변화가 세포의 전사체에 미치는 영향을 보다 완벽하게 정의할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 신생아 새끼의 다른 뇌 영역에서 인터뉴런 전구체를 분리하고 이 세포를 나이가 일치하는 출생 후 새끼의 다양한 뇌 영역에 이식할 수 있어야 합니다.

homochronic-transplantation-interneuron-precursors-into-early

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Weber, R. Z., et al. 마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 뇌내 이식 및 생체 내 생물 발광 추적. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 유전자 변형 인간 신경 전구 세포(NPC)를 마우스 뇌로 정위 이식하는 방법을 보여줍니다. 연구자들은 루시페라아제와 형광 단백질을 발현하는 NPC를 주입하여 생체 내 생물발광 이미징과 사후 형광 현미경을 통해 신경학 연구에서 세포 생존, 이동 및 통합을 연구할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 인간 신경 전구 세포의 이식

이 비디오는 마우스 배아 줄기 세포에서 피질 중간뉴런 전구체를 생성하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 줄기세포의 증식 및 배아체(EB)로의 응집을 촉진하는 특정 소분자 억제제를 포함하는 배지에서 줄기세포를 배양하는 것을 수반합니다. 그 후, EB는 효소와 해리되고 접착 단백질로 코팅된 배양 플레이트 웰에 도금되어 피질 중간뉴런 전구체로의 분화를 촉진합니다.

Generating Cortical Interneuron Precursors from Mouse Embryonic Stem Cells(마우스 배아 줄기세포에서 피질 중간뉴런 전구체 생성)

출처: Quattrocolo, G., et al. 출생 후 초기 마우스 뇌에 Interneuron 전구체의 동시성 이식. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 동소성 또는 이소성 접근법을 사용하여 중간 뉴런 전구체 세포를 신생아 마우스 뇌에 이식하는 방법을 보여줍니다. 이 절차에는 마취된 수혜자 강아지를 고정하고, 표적 뇌 영역을 식별하고, 동일한 발달 단계에서 기증자 강아지에서 유래한 전구체 세포 현탁액을 주입하는 과정이 포함됩니다. 주사 후 새끼는 회복을 위해 온열 패드로 옮겨져 기증자 세포 생존 및 성숙에 대한 후속 평가가 가능합니다.

쥐 새끼의 뇌에 Interneuron 전구 세포의 이식

출처: Gonzalez-Ramos, A., et. al., 신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마로 이식. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 흥분-억제 균형을 회복하는 것을 목표로 억제성 중간 뉴런이 감소된 유전자 변형 쥐 새끼의 해마에 인간 유래 중간 뉴런 전구체 세포를 정위 주입하는 방법을 보여줍니다.

인간 유래 중간 뉴런 전구 세포를 마우스 새끼 해마에 이식

출처: Denaxa, M., el al., 초기 출생 후 마우스 뇌에 화학유전적으로 조작된 피질 중간 뉴런 전구 세포의 이식. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 관심 유전자를 운반하는 플라스미드 벡터를 배아 뇌 절편의 중간 뉴런 전구 세포에 주입한 후 플라스미드 진입 및 유전자 발현을 위한 전기천공법을 시사하는 절차를 보여줍니다. 이러한 변형된 전구 세포는 나중에 뇌 장애 치료에 사용될 수 있습니다.

마우스 피질 중간 뉴런 전구세포에서 아가로스 포매 전기천공 보조 유전자 전달

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

여기에서 우리는 초기 출생 후 마우스의 피질로 이식된 피질 interneuron 선조의 활동을 조작하기 위하여 화학유전학 공구를 이용하기 위하여 디자인된 프로토콜을 제시합니다.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

신경 프로그래밍에 의해 생성 된 인간 다 능성 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런의 이식은 신경 발달 장애에 대한 잠재적 인 치료 접근법이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런 전구체의 생성 및 신생아 마우스의 뇌에 이식하여 이식 된 뉴런의 장기 조사 및 치료 잠재력 평가를 가능하게합니다.

신경 발달 장애를 완화하기 위해 인간 줄기 세포 유래 GABA 성 뉴런을 출생 후 초기 마우스 해마에 이식

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

배우세요 생후 마우스 뇌에서 interneuron 선구체를 분리하고 동일 연령 수용체에 이식하는 방법을 통해 신경 발달 과정에서 세포 운명과 성숙이 환경 변화에 어떻게 영향을 받는지 연구하는 기술을.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

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