Name: Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 칼로레스피로메트리를 이용한 비침습적 세포 에너지 대사 분석 방법을. 산소 소비와 열 발생을 동시에 측정하여 미토콘드리아 독성 및 약물 개발 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 메리 E. Konkle와 마이클 A. Menze 국립 과학 재단 교부 금 체-160944에 의해 부분적으로 투자 되었다.

1. 세포 배양
<ol><li>인간의 간세포 암 (HepG2) 셀 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 추가 기판 (10 mM 포도 당, 2 mM 글루타민 그리고 1 mM pyruvate)를 포함 하는 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 유지 (5% CO 2 , 95% 공기, 습도 100%). 주: DMEM respirometry와 열 량에 대 한 이후 단계에서 참조 되는 경우 위의 DMEM 배합을 사용 합니다.</li>
	<li>1 x 106 세포 격판덮개 세포 100 m m 문화 접시와 subculture 그들 모든 7 일 또는 90 %confluency 도달 하기 전에 고 매체 마다 3-4 일 갱신.</li>
	<li>세포는 60-80% 합칠 때 실험을 수행 합니다.</li>
</ol>2입니다. 준비의 Respirometer 및 열 량 계
<ol><li>Respirometer 챔버로 DMEM의 2.2 mL를 피펫으로 완벽 하 게, 마 개를 삽입 하 고 스 토퍼 공백 도구 보통 공기에서 최적의 산소 보급 수 있도록 조정.</li>
	<li>저 어 지속적으로 37 ° C에서 산소 농도 (블루 추적) 및 산소 유량 (빨간 추적) 안정 될 때까지. Respirometer의 소프트웨어 실험에 사용 된 매체의 산소 용 해도 담당 하도록 프로그래밍 되어 있는지 확인 합니다. 참고: 다른 미디어는 다른 산소 용 해도 계수 (예를 들어, DMEM 0.92 =).</li>
	<li>DMEM 챔버 열기와 산소 농도의 안정화, 후 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택 하 고 100% 공기 포화에 대 한 그것을 교정.</li>
	<li>0% 산소 산소 챔버에 존재 하는 때 산소 농도 추적의 안정적인 부분을 선택에 대 한 보정 수 있습니다. 20 µ L 적정 230 m m 나트륨 dithionite 또는 모든 산소는 실험의 끝에 생물학 견본에서 사용 후 후이 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>respirometer의 100% 공기 교정 후 마 개를 닫고 챔버에 아무 거품이 있는지 확인. 참고: 산소 유량에 약간의 증가 감지 됩니다 폐쇄 실에서 polarographic 산소 센서로 (POS)는 산소 부분 압력을 측정 하기 위해 산소를 소비 한다.</li>
	<li>폐쇄 되 고 스 토퍼의 ~ 10 분, 후 안정 산소 유량을 관찰 하 여는 respirometer HepG2 세포에 대 한 준비 되는지 확인 합니다. 참고: 여기에 사용 된 열 량 계 스테인리스 ampules 활용 하며 한 용액을 참조로 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>열 량 계에의 참조 용액에 H2O (dH2O)의 [샘플 (단계 4)와 같은 볼륨] 2.5 mL를 추가 하 고 필요한 경우 펜을 사용 하 여 모자를 조입니다. 공기 흐름이 봉인된 용액을 청소 하 고 천천히 열 량 계에의 참조 채널 1 위치에 용액을 낮은. 생물학 견본 준비 될 때까지 위치 1에 남아 있다.</li>
</ol>3. Respirometry와 열 량에 대 한 HepG2 세포의 준비
<ol><li>Respirometer 고 열 량 계 준비 및 보정을 확인 합니다. 따뜻한 DMEM 그리고 물 욕조에 37 ° C에 트립 신.</li>
	<li>DMEM CO2 와 온도 대 한 매체의 평형 수 있도록 인큐베이터에서 신선한 100 mm 접시를 추가 합니다. 참고:이 매체 주사 실험에 대 한 적절 한 볼륨 ampules 사용 될 수에 따라 달라 집니다 그래서 사용 됩니다.</li>
	<li>세포는 60-80% 합칠, 다음 세척 100 mm 접시 2 x 10 mL 실내 온도 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 거꾸로 가벼운 현미경으로 확인 합니다.</li>
	<li>셀의 100 mm 접시에는 37 ° C trypsin의 3 mL를 추가 하 고 셀 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 7-10 분 동안 그들을 품 어. 37 ° C DMEM의 3 mL와 트립 신을 무력화 하 고 부드럽게 5 mL를 피펫으로와 ~ 20 번 pipetting으로 일시 중단.</li>
	<li>DMEM trypsin resuspended 셀 6 mL 균 15 mL 원뿔 튜브로 전송 하 고 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 액체를 제거 하는 175 x g.에서 5 분 동안 원심.</li>
	<li>DMEM 피펫으로 철저 하 게 셀 수 있도록 그것은 충분히 다른 해리의 ~ 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>잘 혼합된 샘플의 ~ 100 µ L을 제거 하 고 모든 8 필드 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer 이용 하 여 철저 한 세포 수를 수행 합니다. 다음 ~ 50 µ L 당 106 세포 x 2를 생성 하기 위해서는 물의 resuspension의 셀에 대 한 볼륨을 계산 합니다. 참고: 이렇게 하면 2 x 106 세포 최소한의 중간 변위와 respirometer의 각 챔버에 추가 됩니다.</li>
	<li>원심 175 x g. Resuspend에서 5 분에 대 한 셀에 계산 된 DMEM 단계 3.7에서에서 펠 릿.</li>
	<li>상공 회의소 (이 ~ 50 µ L를 해야) respirometer에서 당 2 × 106 셀을 삽입 하는 데 필요한 볼륨을 결정 하는 세포 수를 수행 합니다. 준비까지 얼음에 respirometric 측정에 대 한 셀을 저장 합니다.</li>
	<li>얼음에 집중된 셀 예제를 실행 하는 동안은 주사에 대 한 1 x 105 셀/mL의 농도 생산 하는 데 필요한 희석을 결정 합니다.</li>
	<li>샘플을 잘 혼합 하 고 각 용액에 대 한 1 x 105 셀/mL DMEM에에서 세포의 3 mL를 준비. 참고: 샘플 희석 사용 DMEM equilibrated 중간 단계 3.3에서에서 준비 해야 합니다.</li>
</ol>4입니다. 열 량
<ol><li>µW에서 열 신호는 관찰 가능 하 고 안정적인 열 량 계는 컴퓨터에 연결 되어 확인 하십시오.</li>
	<li>1 x 105 셀/mL (~2.5 x 105 셀)에 각 용액을 추가 하는 셀의 2.5 mL, 충분 한 공기를 보장은 용액의 뚜껑과 가스 보급 수 있도록 매체 사이.</li>
	<li>즉시 뚜껑, 펜을 사용 하 여 필요한 경우 조입니다. 어떤 외부 이물질 제거를 공기를 사용 하 여 봉인된 용액, 깨끗 하 고 천천히 낮은 열 량 계 1를 용액. 용액은 1 위치를 하향 조정 하는 시간을 기록 합니다.</li>
	<li>허용 15 분 동안 1 위치에 앉아 용액. 참고:이 분 동안 respirometer (5 단계)에 주입 하는 세포입니다. 이렇게 하면 CR 비율을 결정 하는 때 동일한 시간 간격 열 생산 및 산소 소비에 대 한 사용.</li>
	<li>위치 1에서 15 분 후 천천히 2 위치로 참조 및 샘플 ampules 낮은. ampules 인하 했다 시간 그리고 30 분 이상 측정 기록.</li>
</ol>5입니다. respirometry
<ol><li>용액은 열 량 계에서 위치 1에 15 분 간격 동안 respirometric 연구를 시작 합니다.</li>
	<li>철저 하 게 균질 성 해결책을 확인 하 고 주사를 pipetting 셀 샘플 혼합 < 50 µ L ~ 2 x 106 셀/챔버의 최종 농도 대 한 respirometer의 각 챔버에 세포 샘플의. 세포는 respirometer에 주입 하는 시간을 기록 합니다.</li>
	<li>주입 후 HepG2 세포는 지속적으로 내면서 37 ° c. 산소 유량과 산소 농도 있는 꾸준한 감소의 두 안정화를 위해 적어도 20-30 분을 기다립니다.</li>
	<li>화면 오른쪽에 V 당 O2 플럭스 탭을 선택 하 고 산소 유량의 안정적인 부분을 강조. 상표, 다음 통계 및 O2 플럭스 V 당에 대 한 기록 데이터를 선택 합니다. 이 녹음은 CR 비율의 계산에 사용 됩니다. 참고: 5.5 및 5.6 단계는 선택적 이다. 누출 호흡과 최대한 uncoupled 호흡 oligomycin FCCP의 titrations에 의해 계시 될 것 이다.</li>
	<li>각 챔버에 4 mg/mL oligomycin의 1 µ L를 주사 하 고 허용 ~ 산소 유량 안정화를 위한 10 분. 다음 단계에 의해 기록 안정적인 누설 호흡 률 5.4 oligomycin 추가 후 산소 유량 추적의 안정적인 부분을 강조 표시 하 여 수행.</li>
	<li>2 µ L 주사 0.2 m m FCCP 각 챔버에 각 주입 후 산소 유량 안정화에 대 한 수의 적정 후속 FCCP 적정에 약간의 감소에 의해 표시 된 최대 유량에 도달할 때까지 titrations 계속. 최대 유량 중 안정 된 호흡 속도 기록 합니다.</li>
</ol>6입니다. Calorespirometric 비율의 계산
<ol><li>샘플에서 최종 셀 수 수행 ~ 1 x 105 셀/mL 용액 (2.5 mL)에 추가 하는 셀의 총 수를 결정 하려면 hemocytometer의 모든 8 분야 활용.</li>
	<li>열 량 계 및 respirometer는 안정적인 신호는 동일한 시간에 모두에서 기록 측정 시간을 결정 합니다. 참조에 용액은 위치 2와는 respirometer로 세포의 주사의 시간으로 낮 췄 다 때 기록입니다.</li>
	<li>µW/백만 셀으로 표현 단계에서 결정 하는 시간에 존경 받는 용액에 대 한 열 출력을 표시 하는 추적 위에 커서를 배치 하 여 열 생산을 기록 합니다. 산소 소비 데이터를 수집 하 고 그것 pmol O2의 -1 백만 셀 x x로 표시 됩니다 확인 합니다.</li>
	<li>CR 비율을 계산 하려면 먼저 kJ/s, µW를 변환 하 고 kJ/mol O2로 CR 비율을 O2/s의 mol에 kJ/s를 나눕니다. 참고: CR 비율 kJ/mol O2에 표시 됩니다. ( <a href="/files/ftp_upload/57724/JoVE_Supplemental_File.docx" target="_blank">보충 파일 1</a>참조)</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Calorespirometry의 목적은 양적 호 기성 및 혐 기성 경로 신진 대사 활동에의 기여를 평가 하 고 세포 에너지 플럭스의 복합 보기를 얻을 것입니다. 이것은 방열 및 산소 유량 상응 이론 oxycaloric와 계산 된 CR 비율의 비교에서 뒤의 동시 측정에 의해 수행 됩니다. 재현 가능 하 고 신뢰할 수 있는 데이터에 대 한 몇 가지 중요 한 단계를 고려해 야 합니다. 살 균, 건강 한 세포 배양의 정비는 중요 한 이다. 세균 이나 곰 팡이 의해 오염 남용된 열 생산 또는 산소 소비, CR 비율 의미가 렌더링 될 수 있습니다. 더, 부적 절 한 셀 카운트, 혼합, 불 쌍 한 샘플 또는 이멀전의 세포는 부정확 한 CR 비율 또한 발생할 수 있습니다. respirometer에 관한 중요 한 단계는 주입 볼륨에서 50 µ L 아래 적절 한 샘플 준비 이다. 이 볼륨 최소한 매체의 상공에서 전치과 산소 소비는 제대로 2 x 106 셀을 보장 합니다. 일상적인 호흡 관찰 되 면 제안 된 프로토콜 두 추가 t...

생물 학적 시스템, 물질 대사 도중 열 릴리스 또는 엔 탈피 변화는 일반적으로 중 하나를 직접 모니터링 (통해 직접 열 량) 또는 O2 소비 및 CO2 생산 (respirometry)를 통해 통해 간접적으로. 불행히도,이 기술은 격리에 사용 되는 경우 중요 한 정보 혐 기성 경로 세포질 물질 대사에의 기여 등 손실 됩니다. Calorespirometry 열 분산 및 호흡의 동시 측정에 의존 하는 강력한 기술입니다. 완전히 산소 포유류 세포에 있는 혐 기성 물질 대사를 조사 하 고 호 기성 및 혐 기성 경로 변형된 세포에도 불구 하 고 에너지 항상성의 동시 기여 시연 calorespirometric 작업을 개척 한 완전히 산소 환경1. Calorespirometry 이후 다양 한 생물학 질문에 적용 되었습니다. 몇 가지 예로 동물 너 지론 낮은 산소 수준에서의 연구, bivalves, 지구 생물의 물질 대사 그리고 유기 토양 문제2, 의 미생물 분해의 아가미에 제 초 제와 에스트로겐의 효과 3 , 4 , 5 , 6. 또한, calorespirometry는7세포 동결 전에 계시 어떻게 대사 늘어진 포유류의 cryopreservation 향상. 각 접근, 열 량 및 respirometry는 독립적으로 세포질 organismal 생체의 우리의 지식을 증가. 그러나, calorespirometry를 사용 하 여 응답 될 수 있다 기본적인 생물 학적 질문 상대적으로 미개척 남아 있습니다.
헤스의 법칙 반응의 총 엔 탈피 변화는 초기 및 최종 상태 사이의 통로의 독립을 주장 한다. 예를 들어, 생 화 확 적인 통로 총 엔 탈피 변화 통로 내의 모든 반응의 엔 탈피 변화의 합계입니다. 열 량 둘 다 호 기성 및 혐 기성 경로 감지 하는 무차별 세포 열 생산을 측정 하기 위한 실시간 방식을 제공 합니다. 이것은 에너지가 실험 용액8의 벽을 통해 서를 제외 하 고 시스템에서 교환 되는 재단을 기반으로 합니다. 방열에 변화는 변화는 용액에서 모든 대사 반응에서 발표 하는 엔 탈피와 동일. 따라서, 부정적인 엔 탈피는 시스템에서의 열 손실에 상관 한다. 지난 4 년간 철저 한 연구 놓을 anabolism의 열역학 풍경을 특징 있다. 이것은 꾸준한 상승 검색어 "생물학" 및 "열 량"으로 여는 미국 국립 도서관 의학 (NLM) 건강의 국가 학회 (PubMed)에서 색인 아래 연구 기사에 의해 표시 됩니다. 검색 계시는 1970 년 이전 총 27 간행물 참조 생물학적 주사; 한편, 2016 년 혼자, 546 간행물 기술을 활용.
열 메서드는 열 생산을 결정 하기 위해 설립. 그러나, 더 많은 유연성은 respirometric 값을 확인 하기 위해 부여 됩니다. Respirometric 측정 O2, CO2또는 O2 와 CO2모두 구성할 수 있습니다. 또한, O2 또는 CO2 의 측정 optrodes, 클라크-유형 전극, 가변 다이오드 레이저 흡수 분광학7,,910 등 다양 한 기법에 의해 달성 될 수 있다 11. CO2 생산은 많은 respirometric 연구에 귀중 한 통계, 경작된 한 세포에 대 한 중간 종종 pH 제어12,13bicarbonic 버퍼 시스템을 사용 합니다. 합병증을 피하기 위해 CO2 측정의 중 탄산염 시스템에서 문화에 있는 세포의 calorespirometry에 대 한 다음과 같은 프로토콜 respirometric 매개 변수는 단독으로 O2 를 사용 합니다.
산소 유량을 측정 하 여 동시, 특정 respirometers ( 재료의 표참조)는 미토 콘 드 리아 기능의 상세한 평가 대 한 설계 되었습니다. 기판-uncoupler-억제제-titrations (정장) 프로토콜 잘 설립 하 고 실험 막 잠재적인 또는 반응성 산소 종 (선생님) 형성14를 측정 하도록 설계 되어와 호환 됩니다. 그대로 셀의 calorespirometry에 대 한 제시 프로토콜 카보닐기 시안-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) 등 F0F1-ATP synthase 억제제 oligomycin 화학 uncouplers의 소개와 호환 됩니다. FCCP의 추가 통해 산소 소비 미토 콘 드 리아 성능15에 잠재적인 치료의 영향을 평가 하기 위해 유용한 ATP 생산에서 결합 수 있습니다. 또한, oligomycin의 추가 누출 호흡의 정도 조명 했다. 따라서, calorespirometry 동안 수행 respirometric 측정 더 미토 콘 드리 아 생리학을 명료 하 게 하도록 설계 된 광범위 한 프로토콜와 호환 됩니다.
방열 및 산소 유량의 동시 측정 calorespirometric (CR) 비율의 계산에 대 한 수 있습니다. 이 비율은 손 튼의 상수 또는 이론적인 oxycaloric,-430-480 kJ mol-1 셀 선 또는 관심의 조직에 따라 하 고 보충된 탄소 기판1, 사이 범위에 비해 다음은 16. 따라서, 더 많은 부정적인 CR 비율 전반적인 신진 대사 활동을 증가 기여 혐 기성 경로에서 보여준다. 예를 들어 작업의 활성 성능 없이 일상적인 근육 조직 호흡에 대 한 CR 비율-468 kJ mol-1 범위 내에 이론적인 oxycaloric 동등한17,18의-448에서 배열 한다. 한편, 높은 포도 당에 있는 매체에서 경작 된 포유류 세포 분해를 수행 하는 향상 된 젖 산 발효를 표시 하 고 상대적으로 낮은 미토 콘 드 리아 참여19. -800 kJ mol-1, 더 많은 부정적인 CR 비율1,7에 의해 표시 된 세포질 물질 대사에 혐 기성 경로의 높게 한 참여를 보여주는에-490의 범위에서 CR 비율에서이 표현 형 결과 16,20.
상업 기도 하 고 비영리 세포 및 조직 유통 업체 현재 약 4000 셀 라인 150 종 이상 제공 셀 라인에서에서 파생 된 인간. 불멸 하 게 세포는 신속 하 게 많은 방해할 수 있습니다 직접 또는 간접적으로 미토 콘 드 리아 기능 잠재적인 치료제의 독성을 평가 하기 위한 편리한 도구입니다. 약물 검사 하는 동안 변환 된 셀을 사용 하 여 있을 수 있습니다 제한 된 예측 값의 부분에 바르 부르 크 효과, 많은 암의 특징 때문에. 종종, 암 기질 수준 인 산화에서 ATP를 생성 하 고 완벽 하 게 호 기성 조건19mitochondrion 종사 하지 않고 젖 산의 생산을 통해 산화 환 원 균형을 유지. 제약 개발 악명 비용이 많이 드는 이며 비효율적 시장 승인21달성에 실패 하는 인간 임상 시험에서 테스트 9 화합물에서 약 8. 잠재적인 치료제는 셀 라인에서 낮은 세포 독성으로 인해 초기 심사를 통과할 수 있습니다, 하는 동안 이러한 화합물 중 일부 mitotoxic는 가능 하다. 어떻게 이러한 독 소는 바르 부르 크 효과 표시 하지 않는 1 차 셀의 에너지 균형을 손상 할 수 있다을 감지 하는 적합 한 메서드, 없이 중요 한 정보는 종종 bottlenecking 초기 단계에 치료 개발-보였다.
Calorespirometry 생물 학적 샘플, 세포와 조직 등의 다양 한 신진 대사 활동을 분석 하는 실용적, 비 침 투 적인 접근 이다. 제시 프로토콜의 핵심 응용 프로그램의 범위와 호환 됩니다. 그러나 한 합병증,, 발견 되었습니다. 불멸 하 게 세포 보충 잠재적인 mitotoxins22, 세포를 민감하게 하기 위하여 에너지 생산을 위한 산화 인 산화 (OXPHOS)의 기여를 증가 시키는 갈 락 토스와 포도 당 자유로운 매체에 자주 교양 23. 이 대사 프로그래밍 샘플15열 량 계 사용 하는 스테인리스 ampules에 놓으면 분석을 보이지 않게 하기 위해 나타납니다. 세포 포도 당 매체에 경작 몇 시간 동안 높은 신진 대사 활동에 종사 계속 합니다. 한편, 갈 락 토스 매체에 경작 된 세포 용액, 초기 실험 시간 포인트를 제한 하는 측정에 그들의 배치의 30 분 이내 열 생산 감소. 이 문제는 불행 하 게도, 그들의 세포질 확산을 평가 하기 위해 기회를 방해. 이 특정 제한에도 불구 하 고 대부분 응용 프로그램은 호환 calorespirometric 분석 하 고이 접근을 통해 상세한 변화 정보를 얻을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HepG2 세포</td><td>미국식 배양 컬렉션</td><td>HB-8065</td><td>열량</td></tr>계 <tr><td>O2K-호흡계</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10022-02</td><td>호흡계</td></tr><tr><td>LKB 2277 열 활성 모니터(TAM)</td><td>온도 측정 AB</td><td></td><td>온도 측정은 TA Instruments에서 구입했습니다</td></tr>. 피<tr><td>루브산 나트륨(100mM)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>11360070</td><td>DMEM 배지</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Premiuim Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>에 10% 첨가 DMEM 배지</td></tr><tr><td>Trypsn-EDTA (0.25%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25200072</td>세포 <td>해리 시약</td></tr><tr><td>Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>O4876</td><td>미토콘드리아 억제제</td></tr><tr><td>카르보닐 시안화물 4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존</td><td>시그마 알드리치</td><td>C2920</td><td>미토콘드리아 언커플러</td></tr><tr><td>코닝 100mm TC 처리 배양 접시</td><td>Corning Corporation</td><td>430167</td><td>조직 배양 접시</td></tr><tr><td>포도당, 분말</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15023021</td><td>DMEM 매체</td></tr><tr><td>갈락토오스</td>용 포도당, 분말 <td>Fischer Scientific</td><td>BP656500</td> DMEM 매체 L-글루타민 (200 mM)<td>용 갈락토스</td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td>25030081 DMEM 매체</td></tr><tr><td>DMEM, 포도당 없음</td> 글루타민 <td>Thermofisher Scientific</td><td>11966025</td>세포 <td>배양 배지</td></tr></tbody></table>

calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

기본적인 생물 학적 및 생물 의학 연구에 사용 하는 많은 세포 선 둘 다 호 기성 및 혐 기성 호흡의 결합을 통해 에너지 항상성을 유지 합니다. 그러나,는 두 경로 세포 에너지 생산의 풍경에 기여 하는 정도 지속적으로 간과. 변형 된 세포 포도 당 레벨을 자주 포화에 교양 산화 인 산화 기질 수준 인 산화의 증가 의해 보상 된다 ATP 생산에 감소 종속성을 표시 합니다. 대사 균형에 있는이 교대는 미토 콘 드 리아 독 소의 존재에도 불구 하 고 증식 하는 세포 수 있습니다. 변환 된 셀의 변경 된 대사 균형, 무시에 제약 심사 결과 이후는 잘못 해석 될 수 있는 잠재적으로 mitotoxic 효과 수 있습니다 감지 되지 않을 높은 포도 당 존재 교양된 모델 셀 라인을 사용 하 여 농도입니다. 이 프로토콜은 두 개의 강력한 기술, respirometry 및 세포질 ATP 생산을 둘 다 호 기성 및 혐 기성 공헌의 양적 및 비 침 투 적인 평가 대 한 허용 하는 열 량의 페어링 설명 합니다. 호 기성 및 혐 기성 호흡 모니터링 을 통해 주사 될 수 있는 열을 생성 합니다. 한편, 산소 소비 속도 측정 하는 것은 호 기성 호흡의 정도 평가할 수 있습니다. 열 소비, 산소 소비와 동시에 측정은 때 calorespirometric 비율을 확인할 수 있습니다. 실험적으로 얻은 값 상응 이론 oxycaloric에 비해 다음 수 그리고 혐 기성 호흡의 정도 재판 될 수 있다. 따라서, calorespirometry 다양 한 약물 개발, 미생물 성장, 및 normoxic 및 hypoxic 조건 모두에서 기본적인 생체를 포함 하 여 생물학 질문을 분석 하는 독특한 방법을 제공 합니다.

Calorespirometric 측정의 재현성은 적절 하 고 일관 된 샘플 준비에 따라 달라 집니다. 샘플에서 세포 배양 준비 해야 사용할 수 없습니다 경우 접시는 자란 셀 카운트 응집으로 인해 정확 하지 않은 될 수 있습니다. 또한, 감소 된 열 흐름 이멀전의 셀에 제한 된 기판 확산으로 인해 발생할 수 있습니다. 따라서, 부착 셀을 사용 하 여, 60-80% 사이 confluency와 접시를 선택 하 고 매체 실험 전에 24 h 변경 긴요 하다.
적절 한 기 악 교정 및 유지 보수 또한 유익 하 고 재현 calorespirometric 측정을 위해 중요 하다. 에 따라 제조 업체의 설립은 respirometer에 대 한 청소 프로토콜, 에탄올과 광범위 한 세척 잔류 소수 uncouplers와 억제제 제거 되 고에 의해 측정을 부분적으로 타협 하지 않는 수 있도록 구현 억제 또는 연결을 푸는 미토 콘 드리 아. Respirometer 챔버 샘플 측정 전에 작동 하는지, 산소 농...

이 프로토콜 calorespirometry, 방열 및 에너지 대사를 평가 하는 비 침범 성 접근을 제공 하는 호흡의 직접 및 동시 측정에 설명 합니다. 이 기술은 총 세포 에너지 흐름을 모니터링 하 여 호 기성 및 혐 기성 경로 에너지 사용률에의 기여를 평가 하는 데 사용 됩니다.

Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 샘플의 대사 활성을 분석하고 혐기성 경로가 샘플 내 세포 에너지 생산에 기여하는 정도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 약물 개발 중 미토콘드리아 독성의 정도에 대한 제약 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 세포 샘플에서 산소 소비량과 열 생성을 동시에 측정할 수 있다는 것입니다.따라서 이 방법은 의약품 개발 중 치료 계획에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 냉동 보존에 대한 대사 사전 조절의 효과를 평가할 수 있는 cyrobiology와 같은 다른 분야에도 적용할 수 있습니다. 호흡계를 준비하려면 먼저 각 호흡기 챔버에 2-2밀리리터의 DMEM을 추가하고 마개를 완전히 삽입합니다.스토퍼-스페이서 도구로 스토퍼를 조정하여 매체로의 최적 산소 확산을 허용하고 산소 농도와 산소 플럭스가 안정될 때까지 섭씨 37도에서 750rpm으로 샘플을 지속적으로 교반하도록 챔버를 설정합니다. 호흡계 소프트웨어가 실험에 사용된 매체의 산소 용해도를 설명하도록 프로그래밍되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 산소 농도 트레이스의 안정적인 부분을 선택하고 100% 공기 포화를 위해 이 부분을 보정합니다.이제 스토퍼를 닫고 챔버에 기포가 없는지 주의하십시오. 약 10분 후 안정적인 산소 플럭스를 관찰해야 합니다. 열량 측정을 준비하려면 먼저 기준 앰플에 2포인트 5밀리리터의 탈이온수를 추가한 다음 캡을 조입니다.공기 펌프를 사용하여 앰플에서 외부 이물질을 제거한 다음 앰플을 천천히 내려 열량계의 기준 채널에 앰플을 배치합니다. 앰플은 세포 샘플이 있는 앰플이 준비될 때까지 위치 1에 유지됩니다. 열량계에 사용되는 DMEM은 섭씨 37도의 인큐베이터에서 가습된 분위기와 5%CO2의 평형을 이루어야 합니다.사용할 각 열량 앰플에 대해 100ml 플레이트에 3ml의 DMEM을 추가하여 실험을 시작하고 샘플이 열량 측정을 위해 준비될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 배지가 평형을 이루는 동안 도립 현미경을 사용하여 60%에서 80% 사이의 융합 도가이고 균일하게 분포된 HepG2 세포가 있는 플레이트를 선택합니다. 먼저 세포 배양 배지를 제거하고 10ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.섭씨 37도에서 예열된 트립신 3밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 7-10분 배양 후 3밀리리터의 섭씨 37도 DMEM으로 효소 반응을 중화하고 5밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리합니다. 원심분리를 위해 세포를 멸균 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 약 5ml의 새로운 DMEM에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.세포를 철저히 피펫팅하여 세포 클러스터를 분해하고 계수 후 세포를 배지 50마이크로리터당 약 200만 개의 세포로 농축합니다. 이 방법의 재현성은 일관되고 정확한 세포 수에 따라 달라집니다. 샘플이 균질하고 분석 중 어느 시점에서도 세포가 뭉치지 않도록 하는 것이 중요합니다.그런 다음 호흡 측정 및 열량 측정을 수행할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 보관합니다. 열량계를 측정하기 전에 열량계가 컴퓨터에 연결되어 있고 열량계 신호가 안정적이고 마이크로 와트 단위인지 확인하십시오. 시료 전처리 전에 인큐베이터에 배치된 평형 배지에서 세포를 밀리리터당 100, 000 세포로 희석합니다.그런 다음 각 앰플에 2포인트 5밀리리터의 세포 용액을 첨가하여 앰플의 뚜껑과 배지 사이에 가스 확산이 가능하도록 충분한 양의 공기가 유지되는지 확인합니다. 즉시 캡을 조이고 밀봉된 앰플을 공기로 청소하여 외부 이물질을 제거합니다. 그런 다음 세포 샘플과 함께 밀봉된 앰플을 천천히 내려 열량계 중 하나를 배치합니다.균질한 용액을 보장하기 위해 샘플을 철저히 혼합하고 지속적으로 교반하면서 호흡계의 닫힌 각 챔버에 200만 개의 세포를 주입합니다. 열량계의 1번 위치에서 15분 후, 기준 앰플과 셀이 있는 앰플을 모두 천천히 내려 2번 위치를 지정하고 하강 시간을 기록합니다. 세포를 호흡계에 주입한 후 10-15분 후에 산소 플럭스의 안정화와 산소 농도의 꾸준한 감소를 관찰해야 합니다.누출 호흡을 확인하려면 올리고마이신이 밀리리터당 4밀리그램 1마이크로리터를 각 챔버에 주입하고 산소 플럭스가 약 10분 동안 안정화되도록 하여 방금 설명한 대로 안정적인 누출 호흡률을 기록합니다. 그런 다음 최대 플럭스를 결정하기 위해 2마이크로리터의 영점 2밀리몰 FCCP를 챔버에 주입하여 각 주입 후 산소 플럭스가 안정화되도록 하고 최대 플럭스에 도달할 때까지 적정을 계속합니다. 최대 플럭스 동안 안정적인 호흡수를 기록합니다.샘플 측정 전에 호흡계 챔버가 작동하는 경우 산소 농도와 산소 플럭스 트레이스가 모두 안정적이어야 합니다. 앰플을 위치 2로 낮춘 후 열 출력이 안정적인 기간을 식별하고 산소 플럭스가 안정적인 해당 시간을 식별하여 열량폐활량 측정 비율을 계산할 수 있습니다. 포도당이 없는 상태에서 HepG2 세포를 배양하고 미토콘드리아 관여를 증가시키기 위해 갈락토스를 보충하면 세포는 열량계 내부에서 증식하지 않고 대신 앰플에서 약 30분 후에 대사 활성을 감소시켜 열량폐활량 계산을 열 방출이 측정된 가장 빠른 시점으로 제한합니다.산소 플럭스가 안정화되고 산소 농도가 꾸준히 감소하는 데 약 15분이 걸리기 때문에 열 생성과 산소 소비량의 측정이 동일한 시점에서 수집될 수 있도록 세포가 앰플에 피펫으로 삽입되는 시간을 기록하는 것이 중요합니다. 열량량 측정 비율을 계산할 때 세포의 안정화된 산소 플럭스가 산소 소비량의 대리 역할을 하기 때문에 추가 적정을 수행하여 산소 플럭스의 저하로 표시되는 누출 호흡과 연속적인 FCCP 적정으로 호흡을 증가시키지 못함으로 표시되는 최대 비결합 호흡을 평가할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 다른 세포주는 다른 대사 특성을 가질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 각각의 새로운 세포주는 열량 측정 및 호흡 측정 모두에 최적화되어야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 올바른 기기 보정을 보장하고 열량폐활량 측정 실험을 적절하게 수행하기 위해 열량폐활량 측정을 위해 HepG2 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세포의 mitochondrial 기능을 프로 파일링하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 기초 호흡 속도, ATP 링크된 호흡, 양자 누설, 그리고 예비 용량 : 생성된 mitochondrial 프로필 한 실험에서 측정할 수 mitochondrial 함수의 네 가지 매개 변수를 제공합니다.

C2C12 Myoblast 세포를 사용하여 Bioenergetic 프로필 실험

제시된 방법은 최소한의 마우스 골격근에서 분리된 미토콘드리아를 사용하여 마이크로플레이트 기반 호흡 측정 분석 모음의 수행을 위한 단계별 지침을 제공합니다. 이러한 분석은 일반적으로 사용되는 동물 모델에서 미토콘드리아 산소 소비량의 기계론적 변화/적응을 측정할 수 있습니다.

높은 처리량 마이크로 호흡 측정을위한 마우스 골격근의 최소 수량에서 미토콘드리아 격리 사용

고해상도 호흡율은 미토콘드리아의 산소 소비를 결정하는 데 사용된다. 이것은 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 '(I-IV) 호흡 속도, 최대 미토콘드리아 전자 전달계 용량 및 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기위한 간단한 기술이다.

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