Calorespirometry:에 대 한 강력 하 고, 비 침 투 적인 접근 세포 에너지 대사를 조사

이 절차의 전반적인 목표는 생물학적 샘플의 대사 활성을 분석하고 혐기성 경로가 샘플 내 세포 에너지 생산에 기여하는 정도를 결정하는 것입니다. 이 방법은 약물 개발 중 미토콘드리아 독성의 정도에 대한 제약 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 관심 세포 샘플에서 산소 소비량과 열 생성을 동시에 측정할 수 있다는 것입니다.

따라서 이 방법은 의약품 개발 중 치료 계획에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 냉동 보존에 대한 대사 사전 조절의 효과를 평가할 수 있는 cyrobiology와 같은 다른 분야에도 적용할 수 있습니다. 호흡계를 준비하려면 먼저 각 호흡기 챔버에 2-2밀리리터의 DMEM을 추가하고 마개를 완전히 삽입합니다.

스토퍼-스페이서 도구로 스토퍼를 조정하여 매체로의 최적 산소 확산을 허용하고 산소 농도와 산소 플럭스가 안정될 때까지 섭씨 37도에서 750rpm으로 샘플을 지속적으로 교반하도록 챔버를 설정합니다. 호흡계 소프트웨어가 실험에 사용된 매체의 산소 용해도를 설명하도록 프로그래밍되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 산소 농도 트레이스의 안정적인 부분을 선택하고 100% 공기 포화를 위해 이 부분을 보정합니다.

이제 스토퍼를 닫고 챔버에 기포가 없는지 주의하십시오. 약 10분 후 안정적인 산소 플럭스를 관찰해야 합니다. 열량 측정을 준비하려면 먼저 기준 앰플에 2포인트 5밀리리터의 탈이온수를 추가한 다음 캡을 조입니다.

공기 펌프를 사용하여 앰플에서 외부 이물질을 제거한 다음 앰플을 천천히 내려 열량계의 기준 채널에 앰플을 배치합니다. 앰플은 세포 샘플이 있는 앰플이 준비될 때까지 위치 1에 유지됩니다. 열량계에 사용되는 DMEM은 섭씨 37도의 인큐베이터에서 가습된 분위기와 5%CO2의 평형을 이루어야 합니다.

사용할 각 열량 앰플에 대해 100ml 플레이트에 3ml의 DMEM을 추가하여 실험을 시작하고 샘플이 열량 측정을 위해 준비될 때까지 플레이트를 인큐베이터에 놓습니다. 배지가 평형을 이루는 동안 도립 현미경을 사용하여 60%에서 80% 사이의 융합 도가이고 균일하게 분포된 HepG2 세포가 있는 플레이트를 선택합니다. 먼저 세포 배양 배지를 제거하고 10ml의 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

섭씨 37도에서 예열된 트립신 3밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다. 7-10분 배양 후 3밀리리터의 섭씨 37도 DMEM으로 효소 반응을 중화하고 5밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 부드럽게 해리합니다. 원심분리를 위해 세포를 멸균 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 약 5ml의 새로운 DMEM에 팔레트를 다시 현탁시킵니다.

세포를 철저히 피펫팅하여 세포 클러스터를 분해하고 계수 후 세포를 배지 50마이크로리터당 약 200만 개의 세포로 농축합니다. 이 방법의 재현성은 일관되고 정확한 세포 수에 따라 달라집니다. 샘플이 균질하고 분석 중 어느 시점에서도 세포가 뭉치지 않도록 하는 것이 중요합니다.

그런 다음 호흡 측정 및 열량 측정을 수행할 준비가 될 때까지 세포를 얼음 위에 보관합니다. 열량계를 측정하기 전에 열량계가 컴퓨터에 연결되어 있고 열량계 신호가 안정적이고 마이크로 와트 단위인지 확인하십시오. 시료 전처리 전에 인큐베이터에 배치된 평형 배지에서 세포를 밀리리터당 100, 000 세포로 희석합니다.

그런 다음 각 앰플에 2포인트 5밀리리터의 세포 용액을 첨가하여 앰플의 뚜껑과 배지 사이에 가스 확산이 가능하도록 충분한 양의 공기가 유지되는지 확인합니다. 즉시 캡을 조이고 밀봉된 앰플을 공기로 청소하여 외부 이물질을 제거합니다. 그런 다음 세포 샘플과 함께 밀봉된 앰플을 천천히 내려 열량계 중 하나를 배치합니다.

균질한 용액을 보장하기 위해 샘플을 철저히 혼합하고 지속적으로 교반하면서 호흡계의 닫힌 각 챔버에 200만 개의 세포를 주입합니다. 열량계의 1번 위치에서 15분 후, 기준 앰플과 셀이 있는 앰플을 모두 천천히 내려 2번 위치를 지정하고 하강 시간을 기록합니다. 세포를 호흡계에 주입한 후 10-15분 후에 산소 플럭스의 안정화와 산소 농도의 꾸준한 감소를 관찰해야 합니다.

누출 호흡을 확인하려면 올리고마이신이 밀리리터당 4밀리그램 1마이크로리터를 각 챔버에 주입하고 산소 플럭스가 약 10분 동안 안정화되도록 하여 방금 설명한 대로 안정적인 누출 호흡률을 기록합니다. 그런 다음 최대 플럭스를 결정하기 위해 2마이크로리터의 영점 2밀리몰 FCCP를 챔버에 주입하여 각 주입 후 산소 플럭스가 안정화되도록 하고 최대 플럭스에 도달할 때까지 적정을 계속합니다. 최대 플럭스 동안 안정적인 호흡수를 기록합니다.

샘플 측정 전에 호흡계 챔버가 작동하는 경우 산소 농도와 산소 플럭스 트레이스가 모두 안정적이어야 합니다. 앰플을 위치 2로 낮춘 후 열 출력이 안정적인 기간을 식별하고 산소 플럭스가 안정적인 해당 시간을 식별하여 열량폐활량 측정 비율을 계산할 수 있습니다. 포도당이 없는 상태에서 HepG2 세포를 배양하고 미토콘드리아 관여를 증가시키기 위해 갈락토스를 보충하면 세포는 열량계 내부에서 증식하지 않고 대신 앰플에서 약 30분 후에 대사 활성을 감소시켜 열량폐활량 계산을 열 방출이 측정된 가장 빠른 시점으로 제한합니다.

산소 플럭스가 안정화되고 산소 농도가 꾸준히 감소하는 데 약 15분이 걸리기 때문에 열 생성과 산소 소비량의 측정이 동일한 시점에서 수집될 수 있도록 세포가 앰플에 피펫으로 삽입되는 시간을 기록하는 것이 중요합니다. 열량량 측정 비율을 계산할 때 세포의 안정화된 산소 플럭스가 산소 소비량의 대리 역할을 하기 때문에 추가 적정을 수행하여 산소 플럭스의 저하로 표시되는 누출 호흡과 연속적인 FCCP 적정으로 호흡을 증가시키지 못함으로 표시되는 최대 비결합 호흡을 평가할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 다른 세포주는 다른 대사 특성을 가질 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 각각의 새로운 세포주는 열량 측정 및 호흡 측정 모두에 최적화되어야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 올바른 기기 보정을 보장하고 열량폐활량 측정 실험을 적절하게 수행하기 위해 열량폐활량 측정을 위해 HepG2 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.