Name: Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 학습하세요 심근세포에서 저산소/재산소화 후 미토콘드리아 막 전위를 측정하는 흐름세포분석법을 JC-1 염료로 활용하여 보호제 효과를 평가하는 방법입니다.

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이 연구는 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램의 중국 (No. 2017YFC1700503)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 국가 기본 연구 프로그램 (973 프로그램) 중국 (No.2012CB518602), 국립 자연 과학 재단의 중국 (No. 81370223 그리고 번호 81573957), 북경 연합 대학 (2016-1002-01-02)의 대학원생 혁신적인 연구 재단.

1입니다. 시 약 및 솔루션의 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 Myocyte 성장 매체의 500 ml Myocyte 성장 매체 보충 믹스의 25 mL를 추가 하 여 인간의 심장 myocytes (HCMs) 완전 한 매체를 준비 합니다. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.</li>
	<li>Tongxinluo (광장) 솔루션 준비 혈 청/포도 당-무료 광장 ultrafine 분말을 용 해 하 여 Dulbecco의이 글의 중간 (DMEM)를 수정 하 고 (자세한 내용은 참조11)에 대 한 DMEM을 추가 하 여 400 µ g/ml 광장의 농도 조정. 4 ° C에서 37 ° c를 사용 하기 전에 따뜻한이.</li>
	<li>JC-1 재고 솔루션 (200 x), 초순, 4 mL 및 재고 버퍼 (5 배) 15 mL 원심 분리기 튜브 어둠 속에 얼룩의 1 mL의 25 µ L을 추가 하 여 제 1 작업 솔루션의 5 mL을 준비 합니다. 여러 번 왔다 갔다 혼합 플라스틱 고 37 ° C를 사용 하기 전에 따뜻한.</li>
	<li>30 mL 얼룩 버퍼 초순의 24 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 버퍼 (5 배) 얼룩 재고의 6 mL에 추가 하 여 작업을 준비 합니다. 얼음 처럼 차가운이 솔루션을 사용 합니다.</li>
</ol>2입니다. 저 산소 증/Reoxygenation 모델의 설립
<ol><li>호치민시 6 잘 플레이트에 전체 매체와 당 판 1.0 x 105 셀. 37 ° c.에 5% CO2 와 95% 공기를 포함 하는 셀 인큐베이터에 약 70%의 confluency에 도달 성장</li>
	<li>씻어 HCMs 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS). 다른 치료에 그들을 노출 (400 µ g/mL 광장 안) 2 mL 혈 청/포도 당 자유로운 DMEM 37 ° c.에 5% CO2 와 95% 공기를 포함 하는 셀 인큐베이터에서 hypoxia 이전 30 분에</li>
	<li>무료 산소 청소 18 h (그림 1A), 저 산소 증 및 중간11,12, 에서 산소 긴장을 측정 하는 혐 기성 표시기를 유도 하는 밀폐 및 hypoxic 항아리 (2.5 L) 촉매 장착에 HCMs 품 어 13, 5% CO2 와 95% 공기에서 37 ° c.를 포함 하는 셀 인큐베이터에서 참고: 그것은 약 1.5 h 항아리에 무료 산소 청소를 촉매에 대 한 걸립니다. 따라서, 단지 열 전에 HCMs 19.5 h 항아리에 보관 됩니다. 혐 기성 표시기의 색 옅은 흰색 hypoxic 조건 (그림 1B)에 normoxic 환경에서 밝은 파란색에서 변경합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트 인큐베이터 2 h 5% CO2 와 95% 공기를 포함 하는 37 ° C에서 설정으로 이동 하 여 HCMs reoxygenate.</li>
</ol>3입니다. Cytometry HCMs의 준비
<ol><li>37 ° c는 0.25% trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 및 PBS를 따뜻한</li>
	<li>각 우물에서 매체를 발음, 1 mL의 PBS로 세포를 씻어 하 고 우물의 벽을 따라 0.25 %trypsin 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>모든 HCMs 거의 분리 (약 1 분) 때까지 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>중화는 트립 신을 우물에 DMEM 완전 한 매체 (10% 태아 둔감 한 혈 청으로 DMEM 매체)의 1 mL를 추가 합니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 HCMs centrifuging 실내 온도에 3 분 동안 500 x g에 의해 작은.</li>
	<li>신중 하 게는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>각 튜브를 0.5 mL 호치민시 완전 한 매체의 작품 및 JC-1 작업 솔루션의 0.5 mL를 추가 합니다. 아래로 pipetting으로 HCMs resuspend.</li>
	<li>전체 튜브 형광 표시기의 표백 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 커버 하 고 20 분 동안 HCMs (5% CO2 와 95% 공기를 포함 하는 37 ° C)에서 정상적인 조건에서 품 어.</li>
	<li>펠 릿 HCMs centrifuging 500 x g 4 ° c.에 3 분에 의해</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 JC-1 얼룩 버퍼의 2 개 mL 두번 HCMs 린스 합니다.</li>
	<li>샘플 튜브 (12 x 75 mm)에 얼음 처럼 차가운 얼룩 버퍼의 300 µ L의 최종 볼륨에서 HCMs resuspend 고 30 분 이내 분석에 대 한 셀을 사용 합니다. 참고: 카보닐기 시안 m chlorophenyl hydrazone (CCCP), 호흡 전자 수송 체인의 강력한 억제제를 사용 하 여 긍정적인 통제에 대 한 20 µ M의 농도에서 1 h HCMs 치료.</li>
</ol>4. 교류 Cytometer 설치
<ol><li>교류 cytometer 시작 하 고 소프트웨어에 연결 되어 있는지 확인.</li>
	<li>응용 시작 수행, 스트림을 시작 하 고는 breakoff를 설정.</li>
	<li>교류 cytometry 소프트웨어에서 두 점 플롯 윈도우를 엽니다.<ol>
<li>선택 앞으로 각각 그들의 크기 및 그들의 단위 셀의 특성을 표현 하기 위해 첫 번째 점 플롯에서 Y 축에 X 축에 빛 (FSC)과 측면 흩어져 빛 (SSC) 흩어져.</li>
		<li>X 축 눈금을 사용 하 여 셀에 JC 1 염료의 형광 강도 측정 하는 데 사용 되는 두 번째 점 플롯에 대 한 PE (575 ± 26 nm) 탐지 채널 Y 축과 FITC (530 ± 30 nm)에 대 한 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 흐름 Cytometry 측정 및 데이터 분석
<ol><li>튜브 밖으로 팔을 지원 하 고는 빈 (HCMs 하지 염색 하는 JC-1) 위치에 있도록 언로드 클릭 그것에 튜브 샘플. 튜브 지원 팔 작업 위치로 반환 부하 를 클릭 합니다.</li>
	<li>레코드 빈 샘플 튜브에서 현 탁 액에서 입자를 수집 하 고 다음 셀 인구 (P1) 첫 도트 작 (그림 3)에서 추가 분석을 위해 게이트를 클릭 합니다.</li>
	<li>다른 샘플 튜브에서 HCMs를 수집 하 고 셀 점 두 번째 점 플롯의 중심 지역에 위치 하 고 있는지 확인을 형광 채널의 전압을 조정 하 여 측정을 최적화.</li>
	<li>각 샘플 튜브의 통계를 표시 하 고 녹색 형광 강도의 빨간 형광 강도의 비율을 분할 하 여 각 샘플의 MMPs 계산.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
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<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
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<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
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<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 선물이 JC-1 분석 결과 의해 H/R. 검색에 노출 되 고 후 셀의 MMP를 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜, 세포의 MMP는 미토 콘 드리 아의 크기, 모양, 및 형광 단일 구성 요소에 영향을 미칠 수 밀도 같은 요인의 독립 14신호. 따라서, JC-1 분석 결과의 결과 상대적으로 안정적 이다. 게다가, 그것은 편리 하 고 JC-1 시험 수행에 시간 절약입니다. 이 분석 결과 재료 및 시 약, 낮은 요구 사항이 고 일반적으로에서 얼룩 MMP 측정 셀 분리 할 미만 1.5 h 걸립니다.
몇 가지 중요 한 단계는 연구자 안정적이 고 만족 스러운 결과 얻을 하려는 경우 JC-1 시험을 수행할 때 과장 된 수 없습니다. 우선, JC 1 로드 셀 흐름 cytometer에 의해 수집 때까지 차가운 얼룩 버퍼에 메시지를 저장 합니다. 온도 MMP의 안정성에 상당한 영향 그리고 한 샘플의 값 실내 온도에 짧은 시간 후 많...

관상 동맥 심장 질환 죽음은 전세계의 주요 원인입니다. 치료의 선택의 허 혈 성 상해를 줄이고 ST 세그먼트를 가진 환자에서 경색 크기 제한 상승 심근 경색 주 경 피 적인 관상 동맥 내정간섭 (PCI)1를 통해 신속 하 고 효과적인 심근 reperfusion는 2. 그러나, reperfusion 최종 경색 크기3의 30%를 위한 계정을 수 있습니다 추가 손상이 발생 합니다. 그것은 보편적으로 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)가 뿐만 아니라 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 동안 미토 콘 드 리아 손상과 세포 죽음에 중앙 인정 (I / R), cardioprotective 신호4 의 수렴 대상 이기도 하지만 , 5. 우리 mPTP 오프닝 5 ', 5를 사용 하 여 감지 mPTP 오프닝 안 미토 콘 드리 아 막 잠재적인 (MMP)4의 도발은 대해가지고 것, 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) 분석 결과.
JC-1 분석 결과 cytofluorimetric 메서드를 질적, 양적, 그리고 단일 미토 콘 드리 아6의 수준에서 MMP를 분석 하 여 추가 검증 되었습니다. JC-1 오렌지 색깔된 방출에 (590 ± 17.5 nm) 매트릭스에서 정상적인 MMP;와 미토 콘 드리 아의 빨간색 저조한, 집계 된 형태로 존재 MMP의 손실, JC-1 530 ± 15 nm의 방출 함께 녹색 형광을 생성 하는 단위체 양식으로 변환 됩니다. 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율 감소 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 같은 조건에서 MMP의 감소를 나타낼 수 있습니다 (I / R).
JC-1, 이외에 MMP Rhodamine 123 등 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine 요오드 화물 [DiOC6(3)] 막 투과성 질 성 양이온으로 공부도 했다. 그러나, 이러한 두 프로브에 비해, JC 1 MMP를 분석 하기 위한 더욱 안정적입니다. Rhodamine 123 (특히 냉각 모드7,8)에서 상대적으로 빈약한 감도 있으며 가난한 특이성. Rhodamine 123에에서 변화 때로는 작습니다 그래서 그것은 관찰/감지 하 연구원 또는 장비에 대 한 하드. 게다가, 단일 셀에서 rhodamine 123에 대 한 다른 mitochondrion 바인딩 사이트 하 고 그래서 그것이 다른 형광 방출9있을 수 있습니다 키를 누릅니다. DiOC6(3) MMP 감지에 대 한 권장 하지 않습니다도 플라즈마 막10의 도발은에 민감하게 반응 하는 그것.
따라서, 여기에 우리가 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 HCMs MMP를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 사용 합니다.

<table><tbody><tr>JC-1 <td>Beyodtime, 중국</td><td>C2006</td><td>을 가진 미토콘드리아 막 잠재력 분석 장비</td><td>장비에서 JC-1 재고 해결책 (200&times;), 주식 염색 완충액 (5&times;) 및 CCCP (10mM)</td></tr> <tr><td>Tongxinluo ultrafine 분말</td><td>이 있습니다 스자좡 시 Yiling 제약 Co., 중국</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI 장비</td><td>Becton-Dickinson, 미국</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, 미국</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>인간 심장 근세포</td><td>프로모셀, 독일</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>근세포 성장 매체 (SupplementMix)</td><td>프로모셀, 독일</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>근세포 성장 배지(즉시 사용 가능)</td><td>프로모셀, 독일</td><td>C-22070</td><td>근세포 성장 배지와 함께 사용 SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>바이오엠&에아큐트; rieux, Marcy l' Etoile, France</td><td>96127</td><td>2.5L</td></tr><tr><td>촉매(AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp; COMPANY, INC.&nbsp;, 일본</td><td>&nbsp; C-1</td><td></td></tr><tr><td>혐기성 지표</td><td>BioM&eacute; rieux, Marcy l' Etoile,</td><td>France 96118</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Becton-Dickinson, 미국</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 소프트웨어</td><td>Becton-Dickinson, 미국</td><td></td><td>버전 8.0.1</td></tr><tr><td>샘플 튜브</td><td>Corning science, 미국</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, 미국</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxia/reoxygenation 후 심장 myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 cytometry 기반 분석

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

관상동맥 폐색된의 신속 하 고 효율적인 reperfusion ST 세그먼트를 가진 환자에서 심근 경색 크기를 감소에 대 한 최선의 전략 상승 심근 경색 이다. 그러나, reperfusion 라기보다 발생할 수 있습니다 추가 cardiomyocyte 죽음, reperfusion 상해로 알려진 현상. (MMP), 미토 콘 드리 아 막 잠재력의 감소와 미토 콘 드리 아의 도발은 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 공 (mPTP)의 오프닝 reperfusion 상해의 마지막 단계로 보편적으로 인식 되 고에 대 한 책임은 미토 콘 드리 아와 cardiomyocyte 죽음. JC-1 MMP의 값에 따라 미토 콘 드리 아에서 축적 되는 질 성 양이온 염료 이다. MMP, JC-1는 미토 콘 드리 아에서 축적 하는 더 높은. 미토 콘 드리 아에서 JC-1의 증가 금액에서 녹색 형광 방출 변화에 의해 반영 될 수 있다 (~ 530 nm) 빨강 (~ 590 nm). 따라서, 빨강/녹색 형광 강렬 비율의 감소는 미토 콘 드리 아의 도발은 나타낼 수 있습니다. 여기, 우리 걸릴 JC-1 MMP, 측정을 활용 또는 산소/reoxygenation, cytometry에 의해 감지 후 인간의 심장 myocytes에서 mPTP의 오프닝.

MMP의 변화를 평가 하기 위해 JC-1 분석 결과 수행 하기 전에 실험 실시 성공적으로 조건을 확인 하는 연구자에 의해 설정 것이 좋습니다. 정상 그룹에 비해 교류 cytometry 결과 (그림 2)와 같이 산소/reoxygenation (H/R)는 크게 HCMs (Annexin V + /PI±)의 apoptosis 유도 우리 나의 세포 기반 모델을 설립 했다 나타내는 / R (45.00 ± 2.13 %vs. 11.50 p 일반 그룹에서 ± 0.18% &lt; 0.05). Tongxinluo, cardioprotective 효과와 중국 전통 의학 방해 HCMs H/R의 상태에서의 apoptosis (24.50 ± 1.13% p H/R 그룹에서 45.00 ± 2.13% &lt; 0.05).
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여기, 선물이 hypoxia/reoxygenation 또는 보호 에이전트 없이 노출 되 고 후 세포의 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 평가 하기 위해 JC 1 염료를 사용 하는 프로토콜.

Hypoxia/Reoxygenation 후 심장 Myocytes에서 미토 콘 드리 아 막 잠재력을 측정 하기 위한 교류 Cytometry 기반 분석

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

이 방법은 미토콘드리아 막 전위의 세포에 대한 저산소증/재산소화의 영향을 측정하는 데 도움이 될 수 있으며, 약제가 부상으로부터 보호하는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석법의 주요 장점은 미토콘드리아 크기와 같은 요인이 있는 경우에 MMP가 검출된다는 것입니다. 또한 재료와 광채에 대한 요구 사항이 낮습니다.6개의 웰 플레이트에 70%confluent human cardiac myocytes로 시작합니다. 인산염 완충액 식염수로 세포를 세척한 후 2밀리리터의 혈청과 포도당이 없는 DMEM에 약물 또는 차량을 추가합니다. 저산소증 전 30분 동안 섭씨 37도에서 5%CO2 및 95%공기가 포함된 세포 배양 인큐베이터에서 배양합니다.30분 후 인간 심장 근세포 접시를 2.5리터의 밀폐된 무산소 병에 넣습니다. 유리 산소를 제거하는 촉매와 매체의 산소 장력을 측정하기 위한 혐기성 표시기가 장착되어 있습니다. 용기를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.혐기성 지시약의 색깔은 normoxic 환경에서 밝은 파란색에서 저산소 조건에서 옅은 흰색으로 바뀝니다. 병에서 6개의 웰 플레이트를 제거하고 인큐베이터 선반에 2시간 동안 올려 놓아 인간 심장 근세포를 재산소화합니다. 재산소 처리 후 예열된 PBS 1ml로 세포를 헹구고 웰 벽을 따라 예열된 25% 트립신 0.5milil를 추가합니다.섭씨 37도에서 모든 인간 심장 근세포가 거의 분리될 때까지 약 1분 동안 배양합니다. 그런 다음 1ml의 DMEM complete medium을 웰에 첨가하여 트립신을 중화합니다. 세포 현탁액을 15ml 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 500배 G로 원심분리하여 HCM을 펠릿화합니다.원심화 후 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입합니다. 그런 다음 각 튜브에 5ml의 human cardiac myocyte complete medium과 5ml의 JC-1 작업 용액을 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 HCM을 다시 서스펜션합니다.형광 지표의 표백을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 정상적인 조건에서 20분 동안 세포를 배양합니다. 섭씨 4도로 예냉각된 원심분리기에서 500배 G로 3분 동안 원심분리하여 인간 심장 근세포를 펠릿화한 후, 2밀리리터의 얼음처럼 차가운 JC-1 염색 완충액으로 세포를 두 번 헹굽니다. 두 번째 헹굼 후 인간 심장 근세포를 300마이크로리터의 얼음 저온 염색 완충액에 재현탁합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

respirometric 산화 인산화 분석과 함께 사포닌 - permeabilized 섬유 준비 mitochondrial 기능의 통합 평가를 제공합니다. 생리학 및 병리 학적 상태에서 Mitochondrial 호흡은 mitochondrial 상호 작용, 형태학 및 생화학 등 다양한 규제의 영향을 반영하실 수 있습니다.

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여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

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이 프로토콜의 목표는 어떻게 다양 한 요인에에서 산소 소비를 변경할 수 있습니다 검사 마우스 신생아 cardiomyocytes 모델 시스템으로 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

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에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

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포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

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