최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

이 방법은 재생 의학에서 신경 전구 세포의 역할과 관련된 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로 말하자면, 손상이 신경 전구 세포의 행동에 어떤 영향을 미치는지 물어볼 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 척수 손상이 내인성 신경 전구체 세포 동역학에 미치는 영향을 연구하는 접근 방식을 제공한다는 것입니다.

이러한 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 수술 및 해부 단계는 정확성이 필요하고 연습을 통해 완벽하게 할 수 있지만 배우기 어려울 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에 이발기를 사용하여 마취된 쥐의 등쪽에서 등 중앙에서 목과 귀까지 털을 제거합니다.

정위 장치에 마우스를 고정한 후 4-5개의 말린 거즈를 복부 아래에 놓고 꼬리 바닥을 가볍게 당겨 몸통과 척추를 곧게 펴십시오. 흉추를 지지하기 위해 흉부 거즈 롤을 마우스 복부에서 상부 흉부 쪽으로 가로로 밀어 넣습니다. 그리고 실험실 테이프를 사용하여 꼬리와 팔다리를 별 같은 방향으로 고정합니다.

노출된 피부를 70% 에탄올과 포비돈 요오드 면봉으로 순차적으로 소독한 후 10번 메스를 사용하여 양쪽 견갑골의 중간 지점에서 흉추의 곡률까지 동물의 세로축과 평행하게 수직 절개를 만듭니다. 피부를 수축시켜 연조직과 척추 윤곽을 노출시킵니다. 그리고 슈퍼 견갑골 지방 패드의 아래쪽 테두리를 확인합니다.

그런 다음 메스를 사용하여 척추 T5에서 T8까지의 양쪽과 9개의 뼈를 따라 조심스럽지만 강력하게 잘라 척추에서 등 근육 힘줄을 분리합니다. 견인기의 치아가 척추 양쪽의 절개 부위에 삽입되도록 견인기의 위치를 변경합니다. 그리고 수축된 근육층에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추가 충분히 올라갈 때까지 각 견인기를 확장하여 노출을 조정합니다.

수술용 현미경으로 척추 위에 있는 잔여 근육 및 기타 연조직을 조심스럽게 세척하여 척추 뼈를 노출시킵니다. 이빨이 있는 집게로 척추의 가시돌기를 움켜쥐고 집게를 약간 위아래로 움직여 제거할 척추를 식별합니다. 다음으로, 한 쌍의 구부러진 무딘 가위의 한쪽 끝을 노출된 추간공의 양쪽에 삽입하고 절제할 척추 층판의 꼬리를 삽입합니다.

그리고 연결 추간 관절을 양측으로 자릅니다. 그런 다음 얇은 판을 위로 들어 올리고 얇은 판의 위쪽 부착물을 잘라내어 뼈를 분리하고 제거합니다. 척추 층을 잘라내고 제거할 때는 밑에 있는 척수가 손상되지 않도록 항상 가위를 위쪽으로 기울이도록 주의하십시오.

등쪽 정중선 정맥을 랜드마크 역할을하면서 30 게이지 바늘 끝의 45도 구부러진 샤프트를 경사면이 위로 향하게하여 척수의 등쪽 측면 표면에 1mm 깊이로 삽입합니다. 그리고 정중선의 양쪽으로 약 0.5mm 측면입니다. 바늘을 꼬리에서 꼬리 방향으로 약 2mm 이동하여 경사의 전체 길이가 코드에 삽입되도

그런 다음 항목의 경로를 되짚어 바늘을 제거합니다. 상처를 봉합하려면 견인기를 제거하고 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 정중선을 따라 부상 양쪽의 등 근육을 결합합니다. 그리고 4-0 실크 봉합사로 덮인 피부를 봉합합니다.

신경구를 분리하려면 등 전체 길이를 따라 피부의 정중선을 절개하여 근육과 척추뼈 윤곽을 노출시킵니다. 각 견갑골의 내측을 들어 올리고 가위를 사용하여 견갑골과 척추 사이의 연조직을 잘라냅니다. 아래에 있는 척추가 노출되면 척추의 곡률을 따라 위쪽 흉곽 구멍에 가위를 삽입하고 부착된 갈비뼈, 근육 및 내부 장기를 잘라내어 척추를 분리합니다.

꼬리 척추 구멍에 가위를 삽입하고 얇은 판 양쪽의 추간 관절을 자르고 손상되지 않은 탯줄이 손상되지 않도록 주의합니다. 적절한 길이의 척수가 노출되면 척수 조직을 얼음 위의 일반 인공 뇌척수액이 담긴 페트리 접시로 옮기기 전에 척수에서 측면으로 뻗어 있는 척수 신경을 조심스럽게 잘라냅니다. 해부 현미경으로 척수 조직을 절단하여 부상 부위의 주부와 꼬리 쪽을 약 2mm의 조직으로 절단하고 두 쌍의 가는 집게를 사용하여 탯줄을 등쪽과 배쪽 균열을 따라 두 개의 세로 반쪽으로 부드럽게 분리합니다.

마이크로 가위를 사용하여 손상된 등쪽 측면 백질을 잘라냅니다. 그리고 손상된 조직을 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 겸자로 척수의 절반을 잡고 척수의 꼬리 범위를 따라 두 쌍의 집게로 손상되지 않은 백질을 애타게 제거하고 적절한 뇌실 주위 영역을 분리합니다.

같은 방식으로 손상된 백질 및 관련 뇌실 주위 영역을 척수의 다른 절반에서 분리한 후, 뇌실 주위 조직 조각을 개별 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 그리고 마이크로 가위를 사용하여 튜브의 벽에 조직을 부드럽게 다집니다. 조직 소화 절차가 완료되고 단일 세포 현탁액이 얻어지면 세포 조건당 하나의 25 밀리터 조직 배양 플라스크에 10 ml의 적절한 배지를 추가하여 신경구 배양을 설정합니다.

그리고 세포 배양 인큐베이터에서 배양을 위해 분리된 신경 줄기 세포를 마이크로리터당 10개 세포의 클론 밀도까지 추가합니다. 24시간 후, 플라스크를 부드럽게 휘젓고 원심분리를 위해 내용물을 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 계수를 위해 펠릿을 1-2밀리리터의 새로운 신경 기저 배지에 재현탁합니다.

및 웰당 500마이크로리터의 적절한 해당 미토겐 보충 배지를 함유하는 조건당 하나의 24웰 조직 배양 플레이트에 클론 밀도로 세포를 플레이트화합니다. 그런 다음 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 신경구를 성장시킵니다. 경미한 척수 손상 후 5일이 지난 후, 확정 신경 줄기 세포 유래 신경구의 절대 수는 원시 신경 줄기 세포 유래 신경구의 수보다 많습니다.

결정적인 신경구는 더 큰 직경과 큰 어두운 중심을 나타냅니다. 원시 신경 구체는 크기가 더 작고 더 빽빽하게 채워져 있습니다. 경미한 척수 손상은 손상 수준에서 중심관에서 성장한 신경구의 상당한 증가를 유도하는 반면, 손상 수준의 중심관에서는 상대적으로 완만한 증가

결정적인 신경구(definitive neurosphere)는 또한 부상 수준의 병변된 백질로부터 생성될 수 있습니다. 후판 절제술만 있는 동물에서 세포를 형성하는 신경구를 포함하지 않는 영역. 원시 신경 줄기 세포의 유사한 증가는 손상 후 관찰되지만, 병변 부위 수준의 백질에 있는 원시 신경구는 예외입니다.

일단 숙달되면 수술 기술은 40분 이내에 수행할 수 있습니다. 그리고 조직 해부 및 격리는 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 수행할 수 있습니다. 수술 후 동물 균주에 따라 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 리네이트 쇼킹(lineate shocking)과 같은 추가 방법론을 사용하여 증식 역학 및 손상 후 신경 전구 세포의 자기 운명과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 척수 손상 후 신경 줄기 세포 활성화를 평가하기 위해 신경구 분석을 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.