Name: 최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 학습하세요 최소한의 척수 상해 마우스 모델에서 뉴로스피어 분석을 이용한 내인성 신경 줄기 세포 활성화 및 이동 평가 방법. 이 기술은 재생의학 연구에 필수적인 정밀한 수술 및 조직 분리 절차를 포함합니다.

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이 작품은 Krembil 재단 (운영 보조금 CMM)에 의해 자금을. WX 칼튼 마가렛 스미스 학생 상 받는 했다. NL는 온타리오 대학원 장학금을 받았다.

이 프로토콜 토론토 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 하 고 "가이드에는 관리 및 사용의 실험 동물"은 (2차 버전, 동물 관리에 캐나다 위원회 2017).
1. 최소한의 척수 상해 수술
참고: 수술 전에 있는지 확인 하십시오 모든 수술 기구와 자료 (그림 1A)는 적절 한 방법으로 살 균 된다.
<ol><li>거 즈의 4-5 사각형을 고를 거 즈의 고정된 롤 중간에 그들을 함께 찍고 여 흉부 지원 아치를 구축 합니다.</li>
	<li>유도 챔버에 마우스를 놓고 5 %isoflurane 마 취를 시작 합니다. 진행 하기 전에, 뿐만 아니라 절차 전체 발가락 핀치 반사의 부재를 확인 합니다. 으로 수술 완료 하는 데 30 분 이상 걸릴 수 있습니다, 5% (5 분)와 남은 시간 2-3%에서 최소 isoflurane 노출에 대 한 최적화.</li>
	<li>코 콘 2-3 %isoflurane 유지 보수 복용량 마 취 기계에 연결 된 마우스를 전송 합니다. 발기를 사용 하 여 중간 다시 목/귀 수술에 대 한 피부의 넓은 직사각형 영역을 노출 하에서 동물의 등에서 털을 제거 하.</li>
	<li>연결 된 원뿔에 그것의 코를 놓고 귀 바 두개골 안정화 stereotaxic 악기를 마우스를 전송. 마우스 stereotaxic 장치에 고정 되 면 5%에서 isoflurane 귀 바 및 2-3%를 다시 배치 하는 동안 유지 합니다.</li>
	<li>Intraperitoneally 수술 전 진통 약물 관리-Meloxicam (2.0 mg/kg). 아낌없이 눈 윤 활 때 취 각 막 건조 방지 하기 위해 오픈 마우스 눈에 적용 됩니다.</li>
	<li>꼬리의 기지에 가볍게 당겨서 마우스 신체 및 척추 교정 하는 동안 마우스 복 부 아래 흉부 지원 아치를 놓습니다. 실험실 라벨 테이프를 사용 하 여 꼬리와 스타 같은 위치에 모든 확장된 사지. 일단 보안, 흉부 지원 아치 rostrally,에서 밀어 위쪽 흉부 쪽으로 마우스 복 부-소품 흉부 척추 (그림 1B)를 위해.</li>
	<li>Povidone-요오드 뒤 70% 에탄올, 단계 1.3에서에서 준비 모피 잘린 피부 영역을 소독 하 여 무 균 수술 필드를 준비 합니다. 두 번 반복 합니다. 넓은 살 균 분야를 유지 하는 불 임 수술 드 레이프를 적용 합니다.</li>
	<li>#10 메스 블레이드를 사용 하 여, 수직 절 개를 두 어깨에 날개의 중간 지점에서 동물의 종 축에 평행 하 게 흉부 척추의 곡률. 피부 연 조직와 척추 컨투어가 (그림 1C)을 철회.</li>
	<li>(이 정하는 T4/5 척추 수준) suprascapular 지방 패드의 아래쪽 테두리를 식별 합니다. 동일한 #10 블레이드, 신중 하 게 하지만 강제로 잘라 양쪽 열에서 다시 근육 힘 줄을 분리 하려면 척추 뼈 T5-T8/9.</li>
	<li>척추의 양쪽에 절 개 사이트에 견인 기의 치아를 삽입 합니다. 충분히 끌어 넣어진된 근육 층 (그림 1D)에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추를 상승 견인 기를 확장 하 여 노출을 조정 합니다.</li>
	<li>수술 현미경 잔여 근육과 척추 뼈 (그림 1E) 노출를 overlying 다른 부드러운 조직 청소 신중 하 게. 이빨된 집게와 척추의 spinous 프로세스 clasping 약간 최대 그것을 이동 하 여 제거 되 고 아래로 척추를 식별 합니다. 참고:이 척추 관절의 id를 허용 하 고 관심의 척추 아래 작은 구멍 (척추 foramina)을 노출 해야 합니다.</li>
	<li>곡선 무딘가 위 한 머리, excised를 척추 lamina에 꼬리 노출된 척추 구멍의 양쪽에 삽입 하 고 양측 연결 척추 관절을 잘라.</li>
	<li>lamina를 위쪽으로 들어올리고 격리 하 고 뼈를 제거 lamina의 위 첨부 파일을 차단 합니다. 참고:이 그대로 듀 럴 색 들어 있는 척수 (그림 1 층)을 노출 합니다. 과도 한 있을 수 있습니다 영향을 받는 지역에 1 cm x 1cm 거 즈 precut를 배치 하 여 통제 될 수 있다 출혈 또는 살 균 PBS로 세척.</li>
	<li>랜드마크 역할 등 중간 정 맥 (바늘 베벨 위쪽으로 향하게)와 30 G 바늘 팁의 45 ° 구부러진된 샤프트는 중간의 어느 한쪽에 약 0.5 m m 측면에서 척수 (대략 1 밀리미터 깊은)의 dorsolateral 표면으로 삽입.</li>
	<li>이동 ~ 2 m m 바늘 꼬리에서 rostral는 중간에 (병렬로) 바늘의 베벨의 전체 길이 코드에 삽입 됩니다. 항목 (그림 1G)의 경로 통해 되돌아 바늘을 제거 합니다. 참고: 아무 출혈 해야 하지만이 단계에서 척추 조직의 붓기를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>상처를 닫으려면 견인 기를 제거 하 고 6-0 흡수 봉합 사를 사용 하 여 중간에 함께 상해의 양쪽에 다시 근육을 봉합 합니다. 4-0 살 균 실크 봉합 사를 사용 하 여 이후에 overlying 피부를 닫습니다.</li>
	<li>면봉의 끝을 사용 하 여 수술 후 감염을 방지 하기 위해 표면 sutured 스킨의 상단에 항생제 연 고를 적용 합니다. 0.1 mg/kg 피하 체액 (lactated 벨의 솔루션의 1 mL)을 함께 Buprenorphine의 수술 후 진통제를 관리 합니다.</li>
	<li>Isoflurane 기화 기 및 산소를 해제 합니다. 없는 침구와 깨끗 한 장에 장소와 stereotaxic 장치에서 마우스를 제거 합니다.</li>
	<li>케이지 마 취와 모니터 동작을 보 니 다음에서 복구에 대 한 열 램프에서 약 30 ㎝에에서 마우스를 놓습니다. 마우스 해야 5-10 분 이내 그리고 가능한 paresis 또는 깨어 있는 시 꼬리 약점 뒷 다리-다리 기능.</li>
	<li>앞으로 몇 일 동안 마우스 동작을 모니터링 하 고 적절 한 수술 치료 및 진통제 제공 (즉, 매 시, 벨의 솔루션 유체 피하, 0.1 mg/kg buprenorphine 2 lactated 매일 피하 2-3 일, 그리고 적절 한 무게 모니터링에 대 한 x )에 따라 현지 동물 시설 규정을 개별적으로 복구로 다를 수 있습니다.</li>
</ol>2. Neurosphere 분석 결과 해 부
참고: 적절 한 무 균 조직 문화 프로시저를 따릅니다.
<ol><li>효소 솔루션 준비
	<ol>
<li>알 부 민 ovomucoid 억제제 포함 하 유리 병 및 부드럽게 녹아 때까지 소용돌이를 32 mL의 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS)를 추가 합니다.</li>
		<li>미리 나누어진된 papain 유리 유리병에 EBSS의 5 mL을 추가 하 고 해산 하는 37 ° C 물 목욕에. 솔루션이 될 것 이다 (솔루션 1) 취소.</li>
		<li>EBSS의 500 µ L 고 나 유리 유리병 (솔루션 2) 1 mg/mL의 농도를 미리 나누어진된 DNase를 추가. 유리병을 앞뒤로 기울이기로 아주 부드럽게 혼합 하 고 추가이 혼합물의 250 µ L 솔루션 1. 참고: 모든 솔루션 만든 (솔루션 1과 2) 조직의 두 가지의 처리를 위해 충분 하다. 조직의 처리 하는 경우 더 많은 솔루션 준비와 수용.</li>
	</ol></li>
	<li>조직 준비 및 해 부
	<ol>
<li>실험실 정리 마우스 케이지에 isoflurane에 배어 장소와 완전히 마우스 anesthetize에 증기에 대 한 2-3 분을 허용. 다음 녹아웃, 케이지에서 마우스를 제거 하 고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인.</li>
		<li>자 궁 경부 전위 무딘 금속 개체 (즉, 금속 케이지 카드) 동물 안락사를 수행 합니다. 스프레이 70% 에탄올과 넉넉한 중반 뒤로 그것의 목에서 안락사 동물.</li>
		<li>두개골의 기지에서가 위를 사용 하 여 머리를 잘라와 바이오 가방에 삭제. 다시 근육과 척추 뼈 윤곽 (그림 2A) 노출의 전체 길이 따라 피부에 절 개를 중간 선을 확인 합니다.</li>
		<li>각 견 갑 골의 중간 부분을 리프트 (즉., 어깨 블레이드-지방 패드를 overlying 식별)가 위를 사용 하 여 부드러운 조직 (견과 척추) 사이 버려야 하 고. 기본 척추 열을 노출 하는 완전히 별도.</li>
		<li>척추의 곡률에 따라 상부 흉부 조리개가 위의 동일한 쌍을 삽입 하 고 연결 된 늑 골, 근육, 및 내부 장기 (그림 2B) 멀리 절단 하 여 척추 열을 격리.</li>
		<li>꼬리 척추 구멍/오프닝으로가 위를 삽입 하 고 하기 (등 쪽 표면)의 양쪽에 척추 관절을 잘라. 그대로 코드를 손상 하지을 특정 주의 분리 했습니다. 원하는 수준까지이 과정을 계속 하거나 코드의 길이 노출 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 잘라 옆으로 척수 조직 일반 인공 척수와 페 트리 접시에 전송 하기 전에 코드에서 확장 하는 spinal nerve(s). 얼음 (그림 2C)에 샘플을 유지.</li>
		<li>해 부 현미경 척수 조직 포함 ~ 2 mm rostral와 부상 사이트에 꼬리를 잘라. 집게의 두 쌍을 사용 하 여 부드럽게 경도 등 쪽과 복 부 균열을 따라 2 반으로 코드를 분리 (그림 2C').</li>
		<li>Microscissors, 부상된 dorsolateral 백색 질 밖으로 잘라. 15 mL 원뿔 튜브에 조각을 넣으십시오.</li>
		<li>들고 겸,으로 아래로 척수의 절반 애타게 하 고 원하는 뇌 영역을 분리 하는 척수의 rostrocaudal 범위에 따라 미세 집게의 다른 쌍을 사용 하는 백색 물질을 제거. 척수의 나머지 절반에 대 한 반복 합니다.</li>
		<li>별도 15 mL 원뿔 튜브로 뇌 조직의 조각을 놓으십시오. Microscissors를 사용 하 고 조심 스럽게 말하다 원뿔 관의 벽에 대 한 조직. 참고: 조직 분리 수정 Papain 분리 시스템 프로토콜23 , 앞에서 설명한 조직 준비 절차24에서 있습니다.</li>
		<li>조직 샘플을 새로운 솔루션 1 (2.1.3 단계)의 2.5 mL을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 로커에.</li>
		<li>부드럽게 1000 µ L 피 펫 팁 솔루션에서 조직 triturate. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 흐린 세포 현 탁 액을 원심</li>
		<li>얼의 균형 소금 솔루션, ovomucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 300 µ L의 2.7 mL 솔루션 3 준비와 DNase의 150 µ L 내가 솔루션 (2.1.3 단계).</li>
		<li>단계 (단계 2.2.13)에서 상쾌한 삭제 하 고 이전 단계 (단계 2.2.14)에서 솔루션 3의 1.5 ml resuspend.</li>
		<li>이 새로운 세포 현 탁 액 (단계 2.2.15) 불연속 밀도 그라디언트를 만들 새로운 15 mL 원뿔 튜브에 ovoimucoid 억제제 솔루션 (2.1.1 단계)의 5 mL 위에 레이어. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 2 mL에 resuspend. 실시간에서 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 neurobasal 미디어의 1 mL에 resuspend. 서 스 펜 션 뒤에 5 mL의 전체 볼륨에 대 한 미디어의 4 mL 20 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 필터링 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>도금
	<ol>
<li>표 피 성장 인자 (20 ng/mL)와 neurobasal 미디어를 보완 하 여 문화 미디어 neurosphere 성장을 위한 준비 / 섬유 아 세포 성장 인자 (20 ng/mL) / 헤 파 린 (2 µ g/mL) [대 한 확실 한 NSCs] 또는 [기본 NSCs]에 대 한 leukemina 억제 요소 (10 ng/mL). 25 mL 조직 배양 플라스 크에 10 mL의 어느 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>Hemocytometer 고 Trypan blue 염료를 사용 하 여 (단계 2.2.18)25에 셀의 수를 계산 하. 일단 계산 하 고, 조직 배양 플라스 크 (2.3.1 단계)에서 준비에 셀을 추가 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 24 h에 대 한 인큐베이터에 추가 셀 10 셀 / µ L 및 장소 조직 문화 술병의 클론 밀도. 참고: 계산 방법의 예는 다음과 같습니다: 10 µ L Trypan blue 염료와 세포 현 탁 액 및 혼합의 받아 10 µ L. hemocytometer로이 혼합물의 10 µ L를 추가 합니다. 가벼운 현미경 X 10에서 라이브 셀의 숫자를 계산 하 고 모든 셀 4 x 4 사분면의 4에서 계산 합계 합니다. 수식을 사용 하 여: 100000/2 x 10 x 1000 x [(X cells/4)] 클론 밀도 (10 셀 / µ L) 되도록 각 25 mL 조직 배양 플라스 크에 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨 주고.</li>
		<li>24 h 후 부드럽게 플라스 크를 소용돌이 고 15 mL 원뿔 튜브에 내용을 붓는 다. 실시간에서 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 삭제 하 고 다시 1-2 ml 신선한 neurobasal 미디어의 세포를 중단.</li>
		<li>2.3.2 펜션과 플레이트 세포 클론 밀도 500 µ L 각 그들의 각각 물질 보충 미디어 (확실 한 NSC 성장 위한 EFH) 및 기본 NSC 성장 위한 LIF의를 포함 하는 24-잘 조직 문화 접시에서에 있는 셀의 수를 세 단계를 반복 합니다. 참고: 2 x 10 x 1000 x 적응된 수식을 (5000 / [셀/4 X) 사용 하 여) 계산 잘 포함 하는 미디어의 500 µ L 각 도금을 셀 서 스 펜 션의 볼륨을.</li>
		<li>7 일 동안 인큐베이터 (37 ° C, 습도 95%, 5% CO2) 성장에 세포를 포함 하는 접시를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>계산
	<ol>
<li>7 일 문화에서 다음 접시를 제거 하 고 가벼운 현미경 아래를 볼. Neurospheres는 구형 식민지를 계산 하 여 계량 > dNSCs 문화에 대 한 직경 80 µ m 및 > 50 µ m 직경 pNSCs 문화에 대 한. 참고: 원하는 경우 neurospheres passaged26 추가 될 수 또는 분화. 셀은 더 이상 필요한 경우, 매체의 색깔 노란색을 20 분 대 한 웰 스 (약 1 mL)을 가속된 과산화 수소를 추가 하 여 삭제 합니다. 다음 삭제 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

외과 절차 동안 어디 연구원 동물 사이 가변성을 최소화 하 고 최적의 결과 얻기에 특히 주의 기울여야 한다 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 해야 합니다 주의 (isoflurane) 흡입된 마 취와 수술 중 마 취 장기간된 노출27와 신경 보호 효과를 표시 되었습니다로. 따라서, 부상에 따라 척수의 재생 능력, 공부를 할 때 신속 하 고 혼란 변수를 방지 하기 위해 가능한 한 효율적으로 수술을 수행 하기 위해 노력을 확인 합니다. 마우스 당 동일한 isoflurane 노출 시간 유지 가변성을 줄일 것입니다. 마우스의 호흡 속도 수술 내내 모니터링 해야 하 고 너무 느린 해서는 안됩니다 (1 호흡 매 2-3 s) 또는 무 겁 게 보람 (즉, 허 걱). 마 취의 유지 보수 복용량은 낮은 주입 받은 쥐의 메모와 함께 장시간된 마 취 때문에 죽음을 방지 하기 위해 2-3%에서 낮출 수 있습니다.
수술 중 주의 추가 척추 칼럼의 양...

중앙 신 경계 모든 다른 성숙한 신경 세포 유형1,2,,34를 수 있는 자체 갱신, multipotent 줄기 세포의 부분 모집단을 포함 되어 있습니다. 이러한 신경 줄기 세포 (NSCs) 뇌와 척수에서 전문된 틈새에 있으며 증식, 마이그레이션, 성숙한 신경 세포로 분화 하는 부상에 따라 활성화 될 수 있다. NSCs 및 그들의 자손 대뇌 피 질의 부상 모델5,6부상 사이트로 마이그레이션할 표시 되었습니다. 두뇌에 있는 NSCs 측면 심에서 그들은 이다 glial 흉터 대형7을에 분화 상해의 사이트에 마이그레이션할 표시 되었습니다. 그러나 척수,, 몇 가지 연구 수행 되었습니다 다음 척수 상해 회복을 촉진 하이 같은 생 NSCs를 다룰 수 있습니다 경우에 게. 실제로, 현재 논쟁이 있다 활성화는 척수에 줄기 세포 수영장의 중앙 운하8 안 감 뇌 틈새의 직접적인 물리적 손상에 필요한 지 여부 또는 경우는 척추에 손상을 코드 실질 (줄기를 떠나 그대로 셀 틈새)은 생 NSCs9활성화 충분 합니다.
척수 상해 (SCI) 모델의 수는 급성과 만성 부상의 병 태 생리학을 공부 하 이용 되었다. 이 모델 또한 neuroprotection, immunomodulation, 개발 세포 이식/대체 전략10,,1113를 통해 SCI를 치료에 잠재적인 치료를 테스트에 사용 되었습니다. 현재 모델에는 코드14,15에서 대규모 기능적인 적자 뿐 아니라 광범위 한 병 변 및 현상을 일으킬 압축 및 타 박상 부상 포함 됩니다. 결과 glial 흉터는 대부분 척수16의 너비/둘레의 함께 여러 척추 세그먼트를 확장할 수 있습니다. 따라서, 이러한 모델은 임상 관련, 그들은 줄 부상 다음 생 NSCs의 응답을 공부 하 고 중요 한 과제. 중앙 채널17을 마련할 수 있는 상해의 온화한 형태를 적용할 수 있습니다 부상의 화학 모델을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 이러한 유형의 부상 demyelination SCI와 관련 된에 초점을 하 고 하지 임상 관련 모델 외상 문화와 관련 된 물리적 또는 기계적 손상에 대 한
현재 부상 모델의 한계를 해결 하기 위해 우리는 바늘 트랙 최소한의 과학 모델, 원래는 쥐9, 성인 마우스 모델에서 응용 프로그램에 대 한 개발을 적응 시켰다. 우리의 적응된 부상 모델 마우스 척수의 dorsolateral 지역의 일관 된 병 변을 만들 수 있으며 상해의 수준에 중앙 운하 예비. 이 모델의 장점은 NSC 속도 론 연구 허가 상해 및 그들의 잠재적인 방사형 마이그레이션 상해의 사이트에 다음. 마우스 모델의 사용 또한 생 NSCs와 부상에 따라 그들의 자손의 혈통 추적을 허용 하는 유전자 변형 마우스의 사용을 허용 합니다. 생체 외에서 neurosphere 분석 결과이 프로토콜에 도입의 수정 된 양식을 사용 하 여 NSCs의 속성 평가 추가 수 있습니다.
Neurosphere 분석 결과 생체 외에서 식민지 형성 분석 결과 mitogens 존재 NSCs의 격리를 허용 하는. 클론 도금 밀도에서 개별 NSCs NSCs의 작은 부분 모집단 및 창시자18,19의 대부분의 구성 하는 셀의 부동성 구형 식민지를 확산. 우리의 프로토콜에서 척수의 뇌 영역에서 두 개의 별개, 직계 관련 NSCs의 설명-초기 조건 하에서 그리고 우리의 최소한의 과학 모델에 따라. 확실 한 신경 줄기 세포 (dNSCs) 익스프레스 nestin 및 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP)와 표 피 성장 인자 (EGF), 섬유 아 세포 성장 인자 (FGF) 및 헤 파 린 (함께 불리 EFH)20의 성장 된다. 이러한 dNSCs 거의 neurospheres에 시험관에게 상승을 주는 순진한 척수에 드물다. 그러나, 우리는 dNSCs 다음 최소한의 과학, 뇌 지역21에서 분리 된 neurospheres의 숫자를 확대 활성화 됩니다 보여줍니다. 기본 신경 줄기 세포 (pNSCs)은 신경 줄기 세포 계보에서 dNSCs의 업스트림. pNSCs의 pluripotency 마커 Oct4, 상당히 드문, 익스프레스 저급 고 백혈병 금지 요인 (LiF) 응답22. pNSCs neurospheres 주 문화;에 있는 myelin 기본적인 단백질 (MBP)의 존재로 인해 성인 마우스 척수에서 격리 때 형성 하지 않는다 그러나, pNSC neurospheres MBP 결핍 생쥐에서 격리 될 수 있습니다 및 그들의 숫자는 확장된 다음 부상-dNSCs21비슷합니다. 마지막으로, 우리 보여 dNSC에서 파생 된 neurospheres 일찍 최소한의 영향은 다음 번에 상해에의 사이트에서 고립 될 수 있다 이러한 결과 우리의 부상 모델 및 분석 실험 그들의 능력을 확산 하 고 부상에 대 한 응답에서 마이그레이션할 같은 뇌 NSCs의 활성화 특성을 평가할 수 있습니다 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Agricola Retractor</td><td>Fine Science Tools</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Moria Vannas-Wolff 스프링 가위 (곡선형)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-50</td><td>주문 시 맞춤 제작하여 무딘 팁을 얻으세요</td></tr><tr><td>Graefe Forceps (Straight, 1 x 2 Teeth)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>또는</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats (Straight)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td>봉합에 적합한 기타</td></tr><tr><td>집게 또는 메스 핸들 # 3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>또는 기타 적절한</td></tr><tr><td>헤어 클리퍼</td><td>amazon.ca</td><td>https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td><td>또는 기타 적절한</td></tr><tr><td>Stereotaxic 기구</td><td>Stoeling</td><td>51500</td><td>또는 기타 적절한</td></tr><tr><td>부프레노르핀</td><td></td><td></td><td>또는 적절한 제재는 내 동물 관리 시설</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td></td><td></td><td>또는 동물 보호 시설</td></tr><tr><td>Tears Naturale PM</td>에 의해 제재된 적절한 제재를 받았습니다.<td>Alcon</td><td>https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td><td>또는 기타 적절한</td></tr><tr><td>Isoflurane</td>, <td>Baxter International Inc</td>, <td>DIN 02225875</td><td>또는 기타 마취에 적합한</td></tr><tr><td>Q-tips, Cottom Swabs</td><td>amazon.ca</td><td></td><td></td>https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</tr><tr><td>면 거즈</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>30 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td>부상</td></tr><tr><td>25 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td>약물 주입</td></tr><tr><td>약물 주입용</td> <td>1mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>3090659</td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td>수액 주입용</td></tr><tr><td>4-0 봉합</td>사 <td>uoftmedstore.com</td><td>2297-VS881</td><td>피부 봉합</td></tr>용 <tr><td>6-0 봉합</td>사 <td>uoftmedstore.com</td><td>VS889</td><td></td></tr><tr><td>폴리스포린 연고</td><td>amazon.ca 102051</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>적절한</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>적절한</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>모든</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>적절한</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>적절한</td></tr><tr><td>표준 해부 도구</td><td>정밀 과학 도구</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>계수 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>신경 기저-A 매체</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17404-044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린- 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>L- 글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>12700075</td><td></td></tr><tr><td>30% 포도</td>당 <td>Sigma</td><td>G6152</td><td>1 M, 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>1 M 포도당</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO 중 9.01 g3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>155 mM, 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H33.83</td><td>g 100 mL dH2O</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>R& D 시스템</td><td>3188-AT</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>셀레늄</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Papain 해리 시스템&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>PDS 파파인 1 바이알은 2 샘플에 사용할 수</td></tr> 있습니다 <tr><td>: 표피 성장 인자</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>파우더, 1mL 호르몬 믹스로 재구성되고 20uL 바이알에 분주되어 냉동고에 저장,</td></tr><tr><td>섬유 아세포 성장 인자</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>파우더, 0.5 mL 호르몬 믹스로 재구성되고 20 &mu로 분취됩니다. L 냉동고에 보관할 바이알</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>In House</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>NUNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.69 g in 100 mL dH2O</td></tr><tr><td></td><td></td><td>100 mL dH2O에서 7.46 g</td><td></td></tr>, <tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td>, <td>100 mL dH2O,</td></tr><tr><td>108 mM, CaCl2</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C7902</td><td>100mL dH2O 중 1.59g</td></tr></tbody></table>

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 neurosphere 분석 결과

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

성인 포유류 척수에서 신경 줄기 세포 (NSCs)는 공부 생체 외에서 neurosphere 분석 결과 사용 하 여 될 수 있는 뇌 세포의 상대적으로 mitotically 무부하 인구. 이 식민지 형성 분석 결과 접시;에 외 인 요인 NSCs의 반응을 하는 강력한 도구 그러나,이 또한 힘의 적당 한 이해 및 분석 결과의 한계 vivo에서 조작의 효과 연구를 사용할 수 있습니다. 임상 관심의 한 조작 생 NSC 활성화에 상해의 영향 이다. 척수 상해의 현재 모델 제공이 줄기 세포가 있는 상해의 사이트에 NSC 틈새의 파괴를 일으킬 하는 일반적인 타 박상, 압축, 및 transection 모델의 심각도 공부에 대 한 도전. 여기, 우리는 성인 마우스 척수의 낮은 흉부 수준 (t 7/8)의 표면 dorsolateral 표면에 지역화 된 손상을 초래 하는 최소한의 부상 모델을 설명 합니다. 이 부상 모델 상해의 수준에서 중앙 운하를 예비 하 고 부상에 따라 다양 한 시간 지점에서 병 변의 수준에 있는 NSCs의 분석 합니다. 여기, 우리가 어떻게 neurosphere 분석 결과 척수 뇌 영역-기본 및 최종 NSCs에 있는 NSCs의 두 개의 별개, 직계-관련, 인구의 활성화 연구에 이용 될 수 있다 표시 (pNSCs와 dNSCs, 각각). 상해 및 백색 질 부상 사이트의 수준에서 뇌 영역에서 이러한 NSCs 문화를 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 수술 후 척수 해 우리의 pNSC 및 부상된 코드 컨트롤, 상해를 통해 그들의 활성화를 말하기에 비해 뇌 영역에서 dNSC에서 파생 된 neurospheres의 증가 수 보여줍니다. 또한, 부상, 다음 dNSC에서 파생 된 neurospheres 격리 될 수 있습니다 부상 사이트에서-상해의 사이트에 그들의 뇌 틈새에서 마이그레이션할 NSCs의 능력을 보여주는.

수술, 다음 쥐 꼬리와 최대 24 h에 대 한 가능한 뒷 다리 사지 paresis 포함할 수 있는 최소 모터 적자를 경험 한다. 이 시간 후 쥐 뒷 다리 사지 마비 또는 paresis 없고 걸음 걸이에서 최소한의 변화를 경험 한다.
그림 3 에서 5 일 최소한의 척수 상해 neurosphere 분석 결과에서 대표적인 결과 보여줍니다. DNSC에서 파생 된 neurospheres (EFH 성장)의 완전 한 숫자 보다 크면 pNSC에서 파생 된 neurospheres (LIF 성장)의 숫자 부상 후 (그림 3A 와 3B, 각각). 결정적인 neurosphere (그림 3C)와 기...

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

이 방법은 재생 의학에서 신경 전구 세포의 역할과 관련된 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 구체적으로 말하자면, 손상이 신경 전구 세포의 행동에 어떤 영향을 미치는지 물어볼 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 척수 손상이 내인성 신경 전구체 세포 동역학에 미치는 영향을 연구하는 접근 방식을 제공한다는 것입니다.이러한 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 수술 및 해부 단계는 정확성이 필요하고 연습을 통해 완벽하게 할 수 있지만 배우기 어려울 수 있습니다. 절차를 시작하기 전에 이발기를 사용하여 마취된 쥐의 등쪽에서 등 중앙에서 목과 귀까지 털을 제거합니다.정위 장치에 마우스를 고정한 후 4-5개의 말린 거즈를 복부 아래에 놓고 꼬리 바닥을 가볍게 당겨 몸통과 척추를 곧게 펴십시오. 흉추를 지지하기 위해 흉부 거즈 롤을 마우스 복부에서 상부 흉부 쪽으로 가로로 밀어 넣습니다. 그리고 실험실 테이프를 사용하여 꼬리와 팔다리를 별 같은 방향으로 고정합니다.노출된 피부를 70% 에탄올과 포비돈 요오드 면봉으로 순차적으로 소독한 후 10번 메스를 사용하여 양쪽 견갑골의 중간 지점에서 흉추의 곡률까지 동물의 세로축과 평행하게 수직 절개를 만듭니다. 피부를 수축시켜 연조직과 척추 윤곽을 노출시킵니다. 그리고 슈퍼 견갑골 지방 패드의 아래쪽 테두리를 확인합니다.그런 다음 메스를 사용하여 척추 T5에서 T8까지의 양쪽과 9개의 뼈를 따라 조심스럽지만 강력하게 잘라 척추에서 등 근육 힘줄을 분리합니다. 견인기의 치아가 척추 양쪽의 절개 부위에 삽입되도록 견인기의 위치를 변경합니다. 그리고 수축된 근육층에 너무 많은 부담을 주지 않고 척추가 충분히 올라갈 때까지 각 견인기를 확장하여 노출을 조정합니다.수술용 현미경으로 척추 위에 있는 잔여 근육 및 기타 연조직을 조심스럽게 세척하여 척추 뼈를 노출시킵니다. 이빨이 있는 집게로 척추의 가시돌기를 움켜쥐고 집게를 약간 위아래로 움직여 제거할 척추를 식별합니다. 다음으로, 한 쌍의 구부러진 무딘 가위의 한쪽 끝을 노출된 추간공의 양쪽에 삽입하고 절제할 척추 층판의 꼬리를 삽입합니다.그리고 연결 추간 관절을 양측으로 자릅니다. 그런 다음 얇은 판을 위로 들어 올리고 얇은 판의 위쪽 부착물을 잘라내어 뼈를 분리하고 제거합니다. 척추 층을 잘라내고 제거할 때는 밑에 있는 척수가 손상되지 않도록 항상 가위를 위쪽으로 기울이도록 주의하십시오.등쪽 정중선 정맥을 랜드마크 역할을하면서 30 게이지 바늘 끝의 45도 구부러진 샤프트를 경사면이 위로 향하게하여 척수의 등쪽 측면 표면에 1mm 깊이로 삽입합니다. 그리고 정중선의 양쪽으로 약 0.5mm 측면입니다. 바늘을 꼬리에서 꼬리 방향으로 약 2mm 이동하여 경사의 전체 길이가 코드에 삽입되도록합니다.그런 다음 항목의 경로를 되짚어 바늘을 제거합니다. 상처를 봉합하려면 견인기를 제거하고 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 정중선을 따라 부상 양쪽의 등 근육을 결합합니다. 그리고 4-0 실크 봉합사로 덮인 피부를 봉합합니다.신경구를 분리하려면 등 전체 길이를 따라 피부의 정중선을 절개하여 근육과 척추뼈 윤곽을 노출시킵니다. 각 견갑골의 내측을 들어 올리고 가위를 사용하여 견갑골과 척추 사이의 연조직을 잘라냅니다. 아래에 있는 척추가 노출되면 척추의 곡률을 따라 위쪽 흉곽 구멍에 가위를 삽입하고 부착된 갈비뼈, 근육 및 내부 장기를 잘라내어 척추를 분리합니다.꼬리 척추 구멍에 가위를 삽입하고 얇은 판 양쪽의 추간 관절을 자르고 손상되지 않은 탯줄이 손상되지 않도록 주의합니다. 적절한 길이의 척수가 노출되면 척수 조직을 얼음 위의 일반 인공 뇌척수액이 담긴 페트리 접시로 옮기기 전에 척수에서 측면으로 뻗어 있는 척수 신경을 조심스럽게 잘라냅니다. 해부 현미경으로 척수 조직을 절단하여 부상 부위의 주부와 꼬리 쪽을 약 2mm의 조직으로 절단하고 두 쌍의 가는 집게를 사용하여 탯줄을 등쪽과 배쪽 균열을 따라 두 개의 세로 반쪽으로 부드럽게 분리합니다.마이크로 가위를 사용하여 손상된 등쪽 측면 백질을 잘라냅니다. 그리고 손상된 조직을 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 겸자로 척수의 절반을 잡고 척수의 꼬리 범위를 따라 두 쌍의 집게로 손상되지 않은 백질을 애타게 제거하고 적절한 뇌실 주위 영역을 분리합니다.같은 방식으로 손상된 백질 및 관련 뇌실 주위 영역을 척수의 다른 절반에서 분리한 후, 뇌실 주위 조직 조각을 개별 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 그리고 마이크로 가위를 사용하여 튜브의 벽에 조직을 부드럽게 다집니다. 조직 소화 절차가 완료되고 단일 세포 현탁액이 얻어지면 세포 조건당 하나의 25 밀리터 조직 배양 플라스크에 10 ml의 적절한 배지를 추가하여 신경구 배양을 설정합니다.그리고 세포 배양 인큐베이터에서 배양을 위해 분리된 신경 줄기 세포를 마이크로리터당 10개 세포의 클론 밀도까지 추가합니다. 24시간 후, 플라스크를 부드럽게 휘젓고 원심분리를 위해 내용물을 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 계수를 위해 펠릿을 1-2밀리리터의 새로운 신경 기저 배지에 재현탁합니다.및 웰당 500마이크로리터의 적절한 해당 미토겐 보충 배지를 함유하는 조건당 하나의 24웰 조직 배양 플레이트에 클론 밀도로 세포를 플레이트화합니다. 그런 다음 7일 동안 세포 배양 인큐베이터에서 신경구를 성장시킵니다. 경미한 척수 손상 후 5일이 지난 후, 확정 신경 줄기 세포 유래 신경구의 절대 수는 원시 신경 줄기 세포 유래 신경구의 수보다 많습니다.결정적인 신경구는 더 큰 직경과 큰 어두운 중심을 나타냅니다. 원시 신경 구체는 크기가 더 작고 더 빽빽하게 채워져 있습니다. 경미한 척수 손상은 손상 수준에서 중심관에서 성장한 신경구의 상당한 증가를 유도하는 반면, 손상 수준의 중심관에서는 상대적으로 완만한 증가를 유도합니다.결정적인 신경구(definitive neurosphere)는 또한 부상 수준의 병변된 백질로부터 생성될 수 있습니다. 후판 절제술만 있는 동물에서 세포를 형성하는 신경구를 포함하지 않는 영역. 원시 신경 줄기 세포의 유사한 증가는 손상 후 관찰되지만, 병변 부위 수준의 백질에 있는 원시 신경구는 예외입니다.일단 숙달되면 수술 기술은 40분 이내에 수행할 수 있습니다. 그리고 조직 해부 및 격리는 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 수행할 수 있습니다. 수술 후 동물 균주에 따라 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 리네이트 쇼킹(lineate shocking)과 같은 추가 방법론을 사용하여 증식 역학 및 손상 후 신경 전구 세포의 자기 운명과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 척수 손상 후 신경 줄기 세포 활성화를 평가하기 위해 신경구 분석을 활용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

이 비디오는 현미경 분석을 통해 신경 전구체 세포의 이동 반응을 연구하기 위한 체외 분석인 신경 전구체 세포 신경구 이동 분석을 보여줍니다.

NPC Neurosphere Assay: 신경권에서 신경 전구 세포의 이동 반응을 평가하기 위한 In Vitro Assay

출처: Lakshman, N., et al. 최소한의 척수 손상의 마우스 모델에서 내인성 신경 줄기 세포 활성화를 평가하기 위한 신경구 분석. J. vis. 특급 (2018). 이 비디오는 쥐 척수 손상 모델에서 신경 줄기 세포(NSC)의 활성화 및 이동을 보여줍니다. 척수를 노출시키기 위해, 마취된 마우스에서 척추의 흉부 부위에서 척추를 제거합니다. 그런 다음 구부러진 바늘을 사용하여 척수의 백질에 표면 손상을 만들어 중심관을 보존합니다. 부상 후 운하를 둘러싼 NSC가 활성화되고 조직 복구를 돕기 위해 부상 부위로 이동합니다.

 신경 줄기 세포 활성화 및 이동을 연구하기 위한 최소 척수 손상 모델

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 재현 가능한 척수 압박 손상(SCI)을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 자발적인 기능 회복의 기초가 되는 적응 가소성의 메커니즘을 연구하는 데 유리한 플랫폼을 제공합니다.

신생아 마우스 척수 압축 부상 모델

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

이 기사에서는, 구체적으로, 메인 마우스 신경생성 틈새에서 유래된 산후 마우스 신경 줄기 세포로부터의 신경구 배양물의 생성을 위한 프로토콜을 설명한다. 신경구는 전구체 세포 수의 추정을 허용하는 두뇌 조직에서 신경 줄기 세포를 확인하기 위하여 이용됩니다. 더욱이, 이 3D 구조물은 세포 운명의 연구 결과허용하는 신경, oligodendrocytes 및 성상 세포를 초래하는 분화한 조건에서 도금될 수 있습니다.

산후 (P1−3) 마우스 신경성 틈새에서 신경구의 격리 그리고 확장

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

학습하세요 최소한의 척수 상해 마우스 모델에서 뉴로스피어 분석을 이용한 내인성 신경 줄기 세포 활성화 및 이동 평가 방법. 이 기술은 재생의학 연구에 필수적인 정밀한 수술 및 조직 분리 절차를 포함합니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

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