Name: 상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 형광 현미경을 이용해 Shigella 감염 시 HeLa 세포의 국소 및 전역 칼슘 신호를 분석하는 방법을. 이 기술은 병원체 유도 세포 과정을 연구하는 세포 미생물학 연구에 활용됩니다.

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원고 편집에 그녀의 도움에 감사 제니 리 Thomassin 하 고. 작품은 ANR에 의해 지원 되었다 MITOPATHO 및 PATHIMMUN를 부여, PSL IDEX Shigaforce Labex Memolife를 부여. Chunhui 태양은 중국 장학금 위원회에서 박사 그랜트의 받는 사람입니다. 로 랑 Combettes와가 트 란 반 Nhieu는 WBI 프랑스 exchange Tournesol 프로그램 N ° 31268YG의 받는 사람 (Wallonie Bruxelles 국제, Fonds 드 라 검색 과학, Ministère 프랑스어 데 레 아 페르 étrangères 등등 européennes, Ministère 데 l'Enseignement supérieur 동부 표준시 드 라 Recherche dans le 간부 des Partenariats 휴버트 Curien).

1입니다. 준비
<ol><li>
박테리아 준비
	<ol>
<li>박테리아를 접시-Shigella 야생-타입 스트레인 (M90T-AfaE) AfaE adhesin 표현-는 trypticase에 간장 (TCS) 한 접시 포함 0.01% 콩고 레드 (CR)와 18 h 37 ° c.에 대 한 그들을 품 어 참고: 그들의 재현성을 높이기 위해 단계 1.1.1에서에서 얻은 Shigella 접시 4 ° C에 저장 됩니다 및 CR 매체에 모든 식민지 빨갛게 될 것 결국 시간이 지남에 있기 때문에, 1 주일 이내 사용 해야 합니다.</li>
		<li>조 흔 격판덮개에서 3 빨간 식민지를 수확 하 여 TCS 국물 사전 문화를 예방. 참고: 3 식민지와 접종 누구의 독성 플라스 미드 유전자 재결합을 겪고 있다 단일 클론 선택의 가능성을 제한 하 수행 됩니다.</li>
		<li>200 rpm에서 37 ° C에서 16 h 떨고 인큐베이터에서 액체 세균성 문화를 성장. 75 mg/mL의 최종 농도에 암 피 실린을 추가 합니다. 으로 항생제의 과잉 큰 독성 플라스 미드의 손실로 이어질 수 있습니다 항생제 농도가 최소 억제 농도, x 3를 넘지 말아야 한다. 참고: Shigella 독성 플라스 미드의 유지 보수는 도금 크롬 플레이트 적절 한 항생제 농도와 보완에 세균성 문화에 의해 확인 되어야 한다. 백색 식민지의 플라스 미드 손실을 나타냅니다.</li>
		<li>TCS 문화 1: 100 희석에 세균성 사전 문화를 예방 200 rpm에서 2 h 떨고 인큐베이터에서 37 ° C에서 그것을 품 어. 600에서 광학 밀도 확인 nm (OD600nm)는 0.2-0.4.</li>
		<li>21 ° C에서 13000 x g에서 2 분 동안 세균성 문화를 원심 및 EM 매체 (120 mM NaCl, KCl 7mm, 1.8 m m CaCl2, 0.8 m m MgCl2, 5 mM 포도 당, 및 25 mM HEPES의 해당 볼륨에서 펠 릿 resuspend pH 7.3 =).</li>
		<li>0.1의 최종 OD600nm 에서 EM 버퍼에 세균 현 탁 액을 희석 하 고 즉시 그것을 사용 하 여 또는 21 ° C에 저장 그것을 사용 하 여 다음 60 분 이내.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 준비
	<ol>
<li>1 g/l 포도 당의 DMEM에 문화 HeLa 세포 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 보충 10% CO2와 37 ° C에서 그들을 성장 하 고. TC-7 포도 당의 4.5 g/L와 DMEM 성장 10 %FCS 및 비 본질적인 아미노산 10% CO2를 포함 하는 37 ° C 배양 기에서 포함 된 성장.</li>
		<li>셀에 대 한 유지 보수, 성장 접촉 저해를 방지 하려면 정기적으로 셀 분할 confluent 상태로; 연결 이것은 높은 캘리포니아2 + 프로브 로딩/transfection 효율을 중요 합니다.</li>
		<li>6 잘 플레이트 3 x 105 셀/잘 HeLa 세포에 대 한 실험 전날의 조밀도에 있는 살 균 25 m m 직경 원형 coverslips에 HeLa 세포를 플레이트.</li>
		<li>TC-7 셀, trypsinize 및 셀. 에 4 × 105 셀/잘 씨 및 그들에 품 10% CO2에서 37 ° C에서 5-7 일 어-인큐베이터는 극성이 있도록 실험 하기 전에.<ol>
<li>세포 배양 실험의 날까지 매일 새로 고칩니다. 참고: 유리 하단 35 m m 직경 일회용 챔버 또한 포함 하는 coverslips 웰 스 하는 대신 사용할 수 있습니다. 후자는 사용, 열띤된 무대를 통해 온도 제어 또는 목표는 충분 한, 그리고 온도 인큐베이션 챔버에 장착 된 현미경 단계가 필요 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험의 주 매체를 제거 하 고 세척 3 셀 x 21 ° c.에 1 mL 안에 매체와</li>
	<li>로드 3 m Fluo-4-오전14 21 ° c.에 30 분 안에 버퍼에 셀 참고: 하위 confluent HeLa 세포의 로드는 주요 문제를 발생 하지 않습니다, 하는 동안 편광된 TC 7 셀의 로드 자주 이기종 고 가난 하 게 효율적입니다. 이 셀에 대 한 우리가 로드 효율 분산 에이전트의 추가 의해 향상 됩니다 발견-pluronic 산-0.1%의와 20 µ M에의 최종 농도에서 음이온 운송업 자 억제 물 bromosulfophtalein의 최종 농도에 Fluo-4-오전-포함 된 Em입니다. 화학 비율을 사용 하 여 프로브 또는 유전자 인코딩-무서 워 프로브 필요한 듀얼 수집 수집 로컬 Ca2 + 응답의 이미징에 필요한 속도와 호환 되지 않습니다.</li>
	<li>워시 샘플 3 x EM와 버퍼 그리고 추가 EM buffer 오전 moiety의 가수분해 수 있도록 21 ° C의 1 mL에 그들을 품 어. 즉시 또는 다음 90 분 (21 ° C에서 유지 하는) 내 사용 Fluo-4 셀 로드.</li>
</ol>2. 감염 및 로컬 Ca2 + 응답의 이미지 수집
<ol><li>이미징 챔버 또는 유리 하단 챔버 Fluo-4 로드 셀을 포함 하는 coverslip을 놓습니다. 영상 실에서 샘플을 세척 또는 유리 하단 일회용 챔버 EM 버퍼 잠재적으로 셀 세포에서 발생 하는 화합물을 제거 하는 3 배. 안에 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>장소는 거꾸로 형광 현미경 스테이지 챔버 33 ° c.에가 열 참고:이 온도 로컬 응답을 시각화 하기 위해 Shigella 침공 프로세스와 호환 최적의 온도 Ca2 + 응답의 둔화 사이 타협으로 선택 됩니다. 우리가 침수 기름 목표 X 63을 사용 하 여 (NA = 1.25) 단계 대조 고리를 장착.</li>
	<li>현미경 필드를 선택 하 고 설정 수집 매개 변수를 포함 하 여 노출 시간 및 binning Fluo-4 형광 신호를 최적화 하기 위해 필요한 경우. 참고: 로컬 Ca2 + 이미징의 주요 과제는 낮은 진폭 및 응답의 작은 기간 요구 수집 30 매 양 여러 상용 백 조명 EM CCD 또는 C-MOS 카메라 제시 필수 로컬 Ca2 + 응답 Fluo-4를 사용 하 여 검색에 감도. 검출 감도 photodamage 또는 높은 주파수에서 Fluo-4의 형광 여기에 연결 하는 자발적인 응답 같은 유물을 제한 하는 중요 한 문제 이기도 합니다. 여기, 470의 LED 기반 조명 nm, 480 ± 40 nm 대역 통과 여기 필터, 505 nm dichroic 필터와는 527 ± 30 nm 대역 통과 방출 1.0 중립 밀도 필터를 함께 최대 강도의 5%에서 사용 되는 이러한 문제를 최소화 하기 위해 사용 되었다 아래 제한 기간의 취득의 스트림입니다. 로컬 Ca2 + 120 s 스트림의 배치 하 여 신호 분석을 정기적으로 수행 되었다. 이러한 낮은 조명 조건에서 fluorophore photobleaching 하지 2 분-스트림 인수 동안 관찰 되었다. 다양 한 분야에 사용 됩니다 제공에 같은 샘플에 연속 인수를 수행할 수 있습니다. 일반적으로 첫 번째 인수 스트림 자발적인 응답의 부재를 보장 하기 위해 박테리아 자극의 부재에서 컨트롤 필드에서 수행 됩니다. 자발적인 응답을 관찰 하는 경우 응답 없음은 관찰 될 때까지 샘플 EM 버퍼와 세척 된다.</li>
	<li>박테리아 샘플을 추가 하려면 상공에서 EM 버퍼의 500 µ L을 제거 하 고 500 µ L 세균 현 탁 액 0.05, 선택한 현미경 분야; 이동 되지 않도록 적절 한 주의 함께 마지막 세600nm 를 단계 1.1.6에서에서 준비의 추가 볼륨은 박테리아와 세포 샘플에 박테리아의 균질 배급의 적당 한 혼합을 확인 합니다.</li>
	<li>세균 이외에는 수집을 수행 합니다. 또는 인수 10 분 사용 조건 하에서 세포에 앙금을 박테리아에 필요한 시간에 해당 세균 또한 다음을 수행 합니다. 인수 스트림의 끝에 박테리아는 세포 막 주름 세균성 내 습 사이트와 관련 된 문의 시각화 하기 위해 선택된 된 필드의 위상 대조 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>이미지 인수, 파일 절감 및 전체 프로세스를 커버 하는 새로운 필드의 선택의 기간에 받을 간격 2.5, 단계와 인수 절차를 반복 합니다. 참고: 이질균, 우리 발견 수집 20 분, 5 분 마다 스트림 10 분 세균 침전, 침공 이벤트의 대부분을 커버 수 다음.</li>
	<li>인수 절차의 끝에, 캘리포니아2 + ionophore ionomycin 샘플의 Ca2 + 신호의 최대 진폭을 결정 하는 2 µ M의 최종 농도 추가 합니다. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s.</li>
	<li>캘리포니아2 +의 부재에서 형광 신호를 확인 하기 위해 10 mM의 최종 농도에 캘리포니아2 + chelator EGTA를 추가 하 여 따라. 이미지까지 신호 안정화, 보통 10 분 미만 대 한 모든 3-5 s. 참고: 글로벌 Ca2 + 유사의 상대적으로 느린 역학, 때문에 수행이 인수 (안에, 스트리밍 모드), 캘리포니아2 + 연속 치료 동안 같은 미세한 필드에 이미지에 대 한 수 있도록 모든 3-5 s.</li>
</ol>3입니다. 분석
<ol><li>같은 투자 수익에 기준 형광 δ/F0, δ의 관심 (ROI)의 지역 평균 형광 강도의 변화를 나타냅니다 및 F0 의 비율으로 시간이 지남에 cytosolic 캘리포니아2 + 유사 익스프레스는 셀 없는 분야의 관련 없는 영역을 뺍니다.<ol>
<li>해당 기준선 수준; 하 다양 한 분야에 각 셀에 대 한 기저 형광 수준 제거 이러한 수준 낮은 주파수 때문에 명확 하 게 결정 될 수 있다 고 상대적으로 짧은 기간 주어진된 스트림 수집에 로컬 Ca2 + 반응의. 참고: 계량 응답 질문에 관련 된 공부 하는 병원 성 모델의 눈에 띄는 기능. 고아 하 게, 다양 한 매개 변수는 고려 캘리포니아2 + 신호, 로컬 또는 전역 Ca2 + 응답으로 기간, 진폭, 및 이러한 응답의 빈도 보여주는 셀의 주파수를 포함 분석 하. 이질균 및 현지 응답, 분석의 다른 중요 한 측면 세균성 내 습 사이트와 응답의 공간 협회입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전역 또는 로컬 응답을 보여주는 반응 세포의 비율, 척도를 그릴 ROIs 셀, 시계열 Fluo-4 강도의 변화에 해당.<ol>
<li>가양성을 득점 하지 않으려면 로컬 Ca2 + 응답, 평균 형광 강도 셀 기준의 3 배 위의 배경 유사 또는 기간 적어도 200 ms의 진폭 등을 식별 하는 엄격한 매개 변수를 설정 합니다. 참고: 일반적으로 작은 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 어떤 배경 잡음에서 그들의 프로필. ROIs 지역 변이의 탐지에 대 한 허용 하도록 충분 한 형광 신호를 통합 하기에 충분 해야 합니다. Fluo-4 검출의 강도 따라 이러한 ROIs 2-5 m m에서 배열 하는 직경을 가진 원형에 해당할 수 있습니다.</li>
		<li>로컬 또는 글로벌 응답 인지 확인 하기 위해 동일한 셀의 고유 영역에 2 지역에서 평균 Fluo-4 형광 강도의 변화를 측정 합니다. 참고: 셀의 다 수의 분석 이미징 선택된 영역에 대 한 시간별 평균 형광 강도의 변이의 온라인 스크린 디스플레이 허용 하는 소프트웨어의 사용에 의해 촉진 된다. 상용 이미징 소프트웨어는 같은 옵션, 하지만이 또한 수행할 수 있습니다 투자 수익 강도 진화 플러그인을 사용 하 여 얼음 프리웨어를 사용 하 여.</li>
		<li>로컬 응답을 보여주는 셀의 비율을 결정 합니다. 참고:이 비율을 지원 하기 위해 충분 한 숫자에 있어야 현미경 분야에서 분석 하는 셀의 총 수에서 계산 되는 통계적으로 의미는 비-파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여.</li>
		<li>로컬 응답의 기간을 결정 합니다. 참고: 로컬 Ca2 + 응답 구별 될 수 있다 더 그들의 기간 범위에 따라 (즉, 5, 10 s 사이 또는 10 위, 500 밀리초 보다 작아야 s) Shigella 침공 사이트와 함께 그들의 협회.</li>
	</ol>
</li>
	<li>응답의 진폭을 수량화 합니다. 첫째, 최대 캘리포니아2 + 및 셀 배경 수준 단계 2.1.7에서 결정 보정. Fluo-4 부하 각 셀에 대 한 다를 수 있습니다 이후 필드에 개별 셀에 대 한 이러한 결정을 수행 합니다.<ol>
<li>최대 응답의 상대적 비율로 응답의 진폭을 표현 한다.</li>
		<li>통계 뒤에 잠재적인 차이 응답의 진폭에 샘플을 분석 하는 파라메트릭 테스트 정상 테스트를 사용 하 여 테스트를 수행 합니다.</li>
		<li>시각 이미지는 해당 단계에서 세균을 이용한 막 주름을 각각 그들의 지 방화에 의해 세균성 내 습 사이트를 기준으로 이러한 반응의 협회를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 수 없다.

이 원고는 우리 Shigella의 확장된 활동 동안 글로벌 Ca2 + 응답 Shigella 침공의 상대적으로 짧은 활동 기간 동안 로컬 Ca2 + 신호를 따라 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 아래 키를 캘리포니아2 + 의 검색을 최적화 하기 위해 해결 되어야 할 문제를 찾을 수 있습니다 생물 학적 과정을 어떤 방해를 최소화 하면서 신호.
화학 대 유전자에 캘리포니아2 + 프로브 인코딩:
로컬 Ca2 + 유사 이미지, 우리는 그것의 높은 양자 수율 및 그것의 빠른 응답 역학 Fluo-4 화학 프로브를 사용 합니다. 듀얼 파장 수집을 수행할 수 없습니다 이후 인수에 필요한 속도 또한 비율 프로브를 사용 하 여를 걸로 하겠습니다. 그러나 병원 성 미생물의 사용, 캘리포니아2 +</sup...

캘리포니아2 + cytoskeletal 개편, 선 동적인 응답 및 호스트 병원 체 상호 작용1,2,3에 관련 된 세포 죽음 통로 포함 하 여 모든 알려진된 세포 프로세스를 통제 한다. 생리 적인 조건 하에서 기초 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 낮은 수백 nM 범위에에서 있지만 주 작동 근 자극에 따라 일시적 증가를 받게 될 수 있습니다. 이 변이 자주 플라즈마 및 바인딩과 그물 막에 펌프와 채널의 행동을 통해 진동 동작을 표시합니다. 이러한 진동의 패턴 기간, 기간, 및 캘리포니아2 + 증가의 진폭에 의해 특징 및 세포, 차례 차례로, Ca2 + 코드4,5로 알려져 있습니다 무엇에 특정 응답을 방 아 쇠에 의해 해독 . 병 적인 조건 하에서 cytosolic 캘리포니아2 + 농도 증가 지속된 미토 콘 드리 아 막의 permeabilization 및 프로-apoptotic 또는 괴 사 성 요인6,의 출시와 관련 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 7.
이질균, 세균성이 질의 원인이 되는 에이전트 유형 III 분 비 체계 (T3SS)8,9를 사용 하 여 호스트 셀에 이펙터를 주입 하 여 상피 세포를 침입 한다. Shigella 침공 호스트 세포의 지역 및 글로벌 Ca2 + 신호는 T3SS에 의해 elicited와 연결 됩니다. 기 공 형성에 관해서는 독 소, 호스트 세포 막에 삽입 하 고이 필요 T3SS 이펙터의 주입은 T3SS translocon PLC 및 이노 시 톨 (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)의 활성화에 대 한 책임-종속 Ca2 + 릴리즈입니다. 지역화 된 PLC 자극과 생산 말라는 예외적인 오랫동안 InsP3 종속 Ca2 + Shigella 침공 결과의 사이트에서의 축적의 조합10을릴리스 합니다. 유형 III 이펙터 IpgD, phosphatidyl 4, 5 bisphosphate (PIP2)-4-인산 가수분해 효소, 제한 지역 PIP2, 로컬 Ca2 + 의 감 금에 기여 하는 InsP3를 생성 하는 PLC에 대 한 사용 가능한 기판의 수량을 제어 함으로써 세균성 내 습 사이트11,12에 응답 합니다. 이러한 로컬 Ca2 + 응답 가능성이 Shigella 침공 사이트10걸 중 합에 기여 한다. 그러나 이질균에 의해, elicited 또한 글로벌 캘리포니아2 + 응답 세균성 내 습 프로세스에 불가결 하지만 플라즈마 막에서 connexin hemichannels의 열고는 세포 외에서 ATP의 릴리스 트리거 구획입니다. 출시 된 ATP paracrine 방식으로 행동, 캘리포니아2 + 진동 응답 감염된 셀 옆 셀에 자극. IpgD 글로벌 Ca2 + 응답을 형성 하는 느린 역학과 엉뚱한 고립 된 응답에 대 한 책임 이기도 합니다. 결국, 장기간된 세균 감염 시 IpgD InsP3 중재 Ca2 + 신호 억제에 지도 한다. 캘리포니아2 + 신호는 간섭를 통해 IpgD 지연 캘리포니아2 +-종속 calpain 활성화 초점 접착 구조의 해체와 조기 분리로 이어지는 셀13감염.
캘리포니아2 + 신호 병의 중요 한 측면에 관련 된, 하는 동안 미생물의 사용 다양을 한 클래식 주 작동 근 연구에서 발생 하지 않는 기술적인 문제를 발생 시킵니다. 프로토콜 설명 여기는 일반적으로 사용 되 형광 캘리포니아2 + 화학 표시기 Fluo-4 우리 Shigella 감염 시 로컬 Ca2 + 신호 특성 설계를 사용 합니다. 이러한 신호 검출을 위한 중요 한 단계는 캘리포니아2 + 신호에 세균성 이펙터의 역할을 특성화 하는 데 필요한 그들의 정량 분석에 대 한 구현 절차 뿐만 아니라 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 버전 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED 조명 시스템 pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 디쉬 35mm, 높이&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy (TCS) 육수</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS 한천</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri Serotype V. AfaE adhesin</td><td></td></tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>AfaE 부착물을 발현하는 동원성 ipgD 돌연변이 균주</td><td></td></tr></tbody></table>

상피 세포의 shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

캘리포니아2 + 모든 알려진된 세포질 과정에서 포함 된 유비 쿼터 스 이온 이다. 글로벌 Ca2 + 응답 세포 운명에 영향을 미칠 수 있습니다, 하는 동안 무료 캘리포니아2 + cytosolic 농도에서 내부 상점 또는 원형질 막 채널을 통해 유입에서 릴리스 연결할 로컬 유사 대뇌 피 질의 세포 프로세스를 통제 한다. 병원 체는 준수 또는 호스트 셀 트리거 기본 호스트 원형질 막, 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호에 영향을 미치는 가능성이 있는 걸 골격의 개편을 침공. 이러한 이벤트는 확장된 활동을 통해 의사 확률적으로 낮은 주파수에서 발생할 수 있습니다, 때문에 병원 균에 의해 유도 된 Ca2 + 신호 분석 해결 되어야 할 주요 기술 과제를 발생 시킵니다.
여기, 우리는 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 상피 세포의 Shigella 감염 시의 검출에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 이러한 프로토콜에 장기간된 노출에 연결 된 인공 물 및 photodamage 캘리포니아2 + 형광 프로브의 여기와 관련 된는 엄격 하 게는 동안 정의 된 시간 기간 동안 수집 매개 변수를 제어 하 여 트러블 슈팅을 Shigella 침공. 절차는 엄격 하 게 분석 하는 진폭 글로벌 cytosolic 캘리포니아2 + 신호 주파수 확장된 감염 속도 론 화학 프로브 Fluo-4 사용 하는 동안 구현 됩니다.

Shigella 침공은 관련 된 비정형 오랫동안 로컬 Ca2 + 응답:
위에서 언급 한 프로토콜에 따라 Fluo-4 로드 HeLa 세포 WT Shigella 와 도전 그리고 스트림 인수 Ca2 + 신호 분석을 수행 했다. 대표적인 실험 단일 셀, 그리고 해당 단계 대조 이미지 (그림 1A, 왼쪽에 대 한 관심의 영역에서 평균 Fluo-4 프로브의 형광 강도의 시간 경과 이미지 시리즈 그림 1에 표시 됩니다. 패널)입니다. Shigella 침공 사이트 막 주름 위상 대비 이미지 (그림 1A, 화살표)에서 발견에 의해 특징입니다...

여기, 선물이 HeLa 세포 이질균에 감염 하 여 elicited 칼슘 (캘리포니아2 +) 응답을 시각화 하는 프로토콜. 세균 감염의 매개 변수를 최적화 하 고 캘리포니아2 + 형광 프로브 이미징, 비정형 글로벌 및 로컬 Ca2 + 신호 감염 활동의 넓은 범위를 통해 박테리아에 의해 유도 된 특징 이다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아2 + 응답 이미징

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

화학 프로브를 사용한 이 형광 현미경 분석의 전반적인 목표는 병원성 Shigella에 감염되는 동안 숙주 세포에 의해 유도된 지역 및 글로벌 칼슘 반응을 분석하는 것입니다. 이 방법은 세포골격 재조직 또는 세포 사멸을 유발하는 병원체 유도 신호와 같은 세포 미생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 화학 프로브를 사용하여 병원체에 의해 전환된 국소 과정과 관련된 국소 칼슘 신호를 따를 수 있다는 것입니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 생물학적 샘플의 무결성을 보존하면서 국소 칼슘 신호를 따를 수 있는 매개변수 설정으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 먼저 0.01%콩고 레드가 함유된 트립티카제 소이 또는 TCS 한천 플레이트에 AfaE 접착력을 나타내는 야생형 Shigella를 플레이트하고 플레이트를 섭씨 37도에서 18시간 동안 배양합니다. 줄무늬가 있는 플레이트에서 3개의 빨간색 콜로니를 선택하고 TCS 육수에 암피실린 밀리리터당 75마이크로그램을 접종하여 사전 배양을 준비합니다.섭씨 37도, 200rpm의 진탕 인큐베이터에서 16시간 동안 액체 배양물을 성장시킵니다. 다음으로, 1:100 희석으로 박테리아 사전 배양을 TCS에 접종합니다. 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 200rpm으로 2시간 동안 배양합니다.600나노미터에서 광학 밀도가 0.2 - 0.4인지 확인합니다. 배양액을 섭씨 13, 000g 및 21도에서 2분 동안 원심분리하고 펠릿을 등가량의 EM 배지에 다시 현탁시킵니다. EM buffer에 있는 박테리아 현탁액을 최종 OD 600 0.1로 희석하여 즉시 사용하거나 21°C에서 보관한 후 60분 이내에 사용한다.10%FCS가 보충된 포도당 1리터당 1g으로 DMEM에서 HeLa 세포를 성장시키고 10%CO2로 섭씨 37도에서 배양물을 성장시킵니다.DMEM에서 1리터당 4.5g의 포도당, 10%FCS 및 비필수 아미노산으로 TC7 세포를 성장시키고 섭씨 37도 및 10%CO2에서 배양합니다. 세포 유지를 위해 세포를 정기적으로 분할하여 융합 상태와 연결된 성장 접촉 억제를 피하십시오.이는 높은 칼슘 프로브 로딩 및 transfection 효율에 매우 중요합니다. TC7 세포를 트립신화하고 계산합니다. HeLa 세포를 사용한 실험 전날, 웰당 5개의 세포에 대해 10의 3배 밀도로 6웰 플레이트에 있는 멸균된 직경 25mm 원형 덮개 슬립에 세포를 플레이트합니다.그런 다음 실험 전에 분극을 허용하기 위해 웰당 5개의 세포에 10배의 4배로 세포를 파종하고 5-7일 동안 배양하여 매일 배지를 교체합니다. 실험 당일에는 배지를 제거하고 1ml의 EM 배지를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 3개의 마이크로몰 Fluo-4 AM 및 EM 완충액을 세포에 로드하고 플레이트를 섭씨 21도에서 30분 동안 배양합니다.EM 버퍼를 사용하여 샘플을 세 번 세척한 다음 1ml의 EM 버퍼를 추가하고 섭씨 21도에서 셀을 배양하여 AM 부분의 가수분해를 허용합니다. Fluo-4가 로드된 세포가 들어 있는 커버슬립을 이미징 챔버 또는 유리 바닥 챔버에 놓습니다. EM 버퍼를 사용하여 샘플을 세 번 세척하여 세포 용해로 인해 발생할 수 있는 화합물을 제거합니다.그런 다음 1ml의 EM 버퍼를 추가합니다. 챔버를 섭씨 33도로 가열된 도립 형광 현미경 스테이지에 놓습니다. 현미경 필드를 선택하고 필요한 경우 노출 시간 및 비닝을 포함한 획득 매개변수를 설정하여 Fluo-4 형광 신호를 최적화합니다.샘플에 박테리아를 추가하려면 챔버에서 500마이크로리터의 EM 버퍼를 조심스럽게 제거하고 500마이크로리터의 박테리아 현탁액을 추가하여 0.05의 최종 OD 600을 얻습니다. 즉시 획득을 수행하거나 박테리아가 세포에 침전될 때까지 10분 정도 기다립니다. 획득 스트림이 끝나면 선택한 필드의 위상차 이미지를 획득하여 세포와 접촉하는 박테리아와 박테리아 침입 부위와 관련된 멤브레인 주름을 시각화합니다.이미지 획득, 파일 저장 및 전체 프로세스를 포괄하는 새 필드 선택 기간에 적합한 간격으로 획득 절차를 반복합니다. 획득 절차가 끝나면 칼슘 신호의 최대 진폭을 결정하기 위해 칼슘 이오노포어 이오노마이신의 2마이크로몰을 샘플에 추가합니다. 신호가 안정화될 때까지 3-5초마다, 보통 10분 미만 동안 이미지를 획득합니다.그런 다음 칼슘 킬레이터 EGTA를 최종 농도 10밀리몰에 추가하여 칼슘이 없는 경우 형광 신호를 확인합니다. 신호 안정화까지 3-5초마다, 일반적으로 10분 미만 동안 이미지를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 이미지 분석을 수행합니다.이 실험에서는 Fluo-4가 로드된 HeLa 세포에 야생형 Shigella를 적용하고 칼슘 신호를 분석하기 위해 스트림 획득을 수행했습니다. Fluo-4 프로브의 형광 강도에 대한 일련의 타임 랩스 이미지 시리즈는 단일 세포에 대한 관심 영역에서 평균화되고 해당 위상차 이미지가 표시됩니다. 유리 세포질 칼슘의 비정형적 국소 증가는 Shigella 침입 부위에서 2.5초에서 5초에 이르는 다양한 진폭과 지속 시간으로 관찰되며, 그 후 감염된 세포에서 전반적인 증가가 뒤따릅니다.이 예에서, 유형 III 효과기 IpgD가 결핍된 포스파티딜 4, 5-비스포스페이트 인산가수분해효소(phosphatidyl 4, 5-bisphosphate phosphatase)는 야생형 시겔라(Sigella) 균주에 비해 장기간에 걸쳐 더 전반적이고 덜 비정형적인 국소 반응을 유도했습니다. 이 실험에서 볼 수 있듯이, 확장된 감염 동역학에 대한 전반적인 칼슘 반응의 이미징은 야생형 Shigella에 대한 챌린지 후 30분 후에 반응 빈도가 감소하는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 칼슘 작용제 히스타민에 대한 용량 의존적 세포 반응의 정량화는 시겔라 감염의 말기 단계에서 이노시톨 삼인산 의존성 칼슘 방출의 억제를 보여줍니다.이 절차에 따라 주어진 프로세스에서 칼슘 신호의 역할을 다루기 위해 호환 가능한 유체와 이미징을 동시에 결합하는 모든 방법을 수행할 수 있습니다. 병원체와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 폐기물 처리, 오염된 표면 또는 장비 청소와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

imaging-ca2-responses-during-shigella-infection-of-epithelial-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Vonaesch, P. 외, 포유류 세포의 박테리아 도전 후 스트레스 과립 형성의 면역형광 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 병원성 박테리아인 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri )에 의해 상피세포가 감염되고 그로 인한 숙주 세포 반응을 보여줍니다. 박테리아 효과 단백질은 숙주 번역을 방해하여 세포의 적응 반응인 스트레스 과립이라 불리는 막 없는 소기관 형성을 촉진합니다.

암성 상피세포의 시겔라 감염 중 스트레스 과립 형성

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

이 비디오는 인간 상피 세포의 Shigella 감염 시 지역 및 전역 칼슘 이온 반응을 감지하는 기술을 보여줍니다. Shigella는 숙주 세포에 침입하여 침입 효과기를 방출하여 세포 내 칼슘 수치에 영향을 미칩니다. 국소 및 전체 세포질 칼슘의 진폭과 빈도는 형광 지표를 사용하여 연구됩니다.

박테리아에 감염된 세포의 칼슘 반응을 연구하기 위한 이미징 기술

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

병원균의 확산을 대응하기 위해 숙주 세포는 박테리아를 구획하고 자식 작용을 유도하는 자신의 세포 골격을 재구성. 조직 배양 세포, 호스트와이 프로세스를 기본 병원체 결정의 사용 이질균 감염 식별 특징으로한다. 시겔 감염 제브라 피쉬 모델을 사용하여, 분자 발견 및 메커니즘의 역할은 생체에 조사된다.

사용<em&gt; 시겔 flexneri</em&gt; 자식 작용 - 세포 뼈대의 상호 작용을 연구하는

본 프로토콜은 시험관 내 상피 세포주를 사용하여 Shigella 부착, 침습 및 세포 내 복제를 조사하기 위한 감염 분석을 설명합니다.

Shigella를 사용한 상피 세포 감염 분석

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을...

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

우리는 흐름 cytometric 부정적인 선택하여 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포 (AECII)의 급속한 절연을 설명합니다. 이 AECII 높은 생존 능력과 정결을 표시하고 면역 또는 전염성 질환과 같은 호흡기 질환에서의 역할에 대한 기능과 분자 연구 광범위한 적합합니다.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

연쇄상 구균 폐렴을 이용한 뮤린 비소하린의 식민지화및 신봉또는 모집된 세포의 후속 추출이 설명된다. 이 기술은 나아레를 통해 유체의 비소하린과 수집을 플러시하는 것을 포함하며, 시투에서mRNA 발현의 차동 세포 정량화 및 분석을 포함한 다양한 판독에 적응할 수 있다.

연쇄상 구균 폐렴으로 비강 내 식민지 화 중 염증 반응의 특성화

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

배우세요 형광 현미경을 이용해 Shigella 감염 시 HeLa 세포의 국소 및 전역 칼슘 신호를 분석하는 방법을. 이 기술은 병원체 유도 세포 과정을 연구하는 세포 미생물학 연구에 활용됩니다.

상피 세포의 Shigella 감염 동안 캘리포니아^{2 +} 응답 이미징

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