Name: 망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 쥐 망막 미세혈관 페리사이트를 시각화하는 세 가지 면역조직화학 기법: 크라이오섹션, 홀마운트, 저삼투압 혈관 격리법. 이 방법들은 안과학 연구에서 페리사이트 증식과 이동을 연구하는 데 필수적입니다.

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연구는 Lundbeck 재단, 덴마크에 의해 투자 되었다.

프로토콜 최적화 하 고 성인 남성 알 비 노 쥐에 설명 했다. 모든 실험 절차, 동물 ARVO 문에서 규정 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 했다. 동물은 이산화탄소와 이후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다.
1. 쥐 망막 조직 준비
<ol><li>
곳을 알아내는-섹션
	<ol>
<li>메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.<ol>
<li>선택 사항: 투 열 버너를 사용 하 고 포함 하는 동안 제복 패션에 눈을 찾으시는 시 신경을 통해 수직 cryostat 단면에 대 한 내부 각도에 눈을 표시 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate. 주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>넣어 눈 짧게 4% 포름알데히드에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 만들기 전에 안정.</li>
		<li>현미경으로 각 막 제거 하 고 2-4 h에 대 한 PBS에 4% 포름알데히드에 잠수 하기 전에 집게를 가진 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.</li>
		<li>자당 10%와 25% 자당 Sörensen의 인산 염 버퍼에 순차적으로 헹 구 십시오.</li>
		<li>Yazulla 매체 돼지 피부와 30% 알 부 민 닭고기 달걀 흰색에서에서 3% 젤라틴 준비에 포함 합니다. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기-20 ° c.에 조직 스토리지</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체-마운트
	<ol>
<li>메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.</li>
		<li>집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate. 주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>짧게 메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 만들기 전에 안정화를 PBS에서 4% 포름알데히드에 눈을 넣어.</li>
		<li>현미경으로 각 막 제거 하 고 집게로 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.</li>
		<li>망막 시 신경으로 망막 색소 상피에서 집게 주요 찢는 피하기 위해 작은 개방 움직임을 사용 하 여 구분 합니다.</li>
		<li>해 부가 위 시 신경에서 망막 및 시 신경 머리 쪽으로 망막 주변에서 몇 밀리미터 길이의 4 개의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.</li>
		<li>유리 슬라이드에 망막을 확산 하 고 5-10 분 동안 건조 허용 합니다.</li>
		<li>포름알데히드는 망막에 떨어지는 여 20-30 분 동안 4% 포름알데히드를 수정 했다. 주의: 유리에서 분리 수 있습니다으로 망막에 직접 적용 되지 않습니다.</li>
		<li>PBS와 린스. 최적의 결과 rinsing 후 직접 면역-얼룩</li>
	</ol>
</li>
	<li>
침투성 절연
	<ol>
<li>메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다.</li>
		<li>집게와 눈을 신중 하 게 주변 조직이 노출 측면 기울기. 연결 및 근육 조직에 해 부가 위 컷 하 여 눈을 enucleate. 주의: 당기지 마십시오 눈 너무 열심히 시 신경에 과도 한 압력 망막 손상이 발생할 수 있습니다.</li>
		<li>메스의 팁과 가벼운 압력을 적용 하 여 각 막 limbus에서 초기 구멍을 확인 합니다.</li>
		<li>현미경으로 각 막 제거 하 고 집게로 렌즈를 제거 해 부가 위 각 막 limbus 따라 자릅니다.</li>
		<li>망막 시 신경 머리 쪽으로 망막 색소 상피에서 집게 주요 찢는 피하기 위해 작은 개방 움직임을 사용 하 여 구분 합니다.</li>
		<li>망막 시 신경에 해 부가 위 무료, 망막 24-잘 접시에 이온된 수 1 mL에 놓고 실 온에서 1 시간에 1.5 m m 진동 궤도와 200 rpm에 흔들. 참고:이 하, 망막 표시 됩니다 덜 가장자리에서 정의 된.</li>
		<li>1 망막 맥 관 구조에서 lysed 세포 파편을 분리 하 여 실 온에서 또 다른 30 분 동안 흔들어 200 U DNAse를 추가 합니다. 참고: 파편 우물에서 폼을 시작할 수 있습니다.</li>
		<li>최소 3 번 신경 세포 파편을 제거 하려면 150-300 rpm에서 떨고와 5 분 동안 이온된 물에에서 린스. 망막 신경 세포 파편의 제거를 나타내는 각 린스 더 투명 하 게 될 것입니다.<ol>
<li>어두운 백그라운드를 사용 하 여 투명 한 절연된 망막 맥 관 구조를 명확 하 게 볼을 24-잘 접시로 봐야.</li>
			<li>(선택 사항): 진동 속도 맥 관 구조 나타나지 않으면 무료 신경 레이어 (반투명)의 시점에서 더 린스 단계를 추가 하거나, 또는 피펫으로 액체는 맥 관 구조에 발음을 사용 하 여. 주의: 선택적 단계 중 하나는 맥 관 구조를 손상 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>실 온에서 PBS에 4 %paraformaldehyde 린스 PBS에 3 번의 1 mL에 10 분을 수정. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 4 ° c.에 조직 스토리지</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. Immunohistochemistry
<ol><li>
곳을 알아내는-섹션의 얼룩
	<ol>
<li>10 µ m cryo-섹션 젤라틴 포함 망막 시 신경 통해 수직 단면으로 잘라내어 유리 슬라이드에 게 건조 (최소 1 시간) 곳을 알아내는-섹션을 두고.</li>
		<li>0.25%와 PBS에서 유리 슬라이드 잠수함 트라이 톤 X-100 (PBS-T) 15 분.</li>
		<li>1: 100 PDGFRβ, PBS-T + 1% BSA cryo-섹션에 희석 1: 500 NG2 기본 항 체를 drip 하 고 하룻밤 4 ° C에서 보육 실에서 품 어.</li>
		<li>PBS-T 15 분에 2 번 유리 슬라이드 잠수함 그리고 1: 100 반대로 마우스 알 렉 사 Fluor 594 연결 하 고 1: 100 반 토끼 FITC 연결 보조 항 체 PBS-T cryo-섹션에 3 %BSA에서 희석을 똑.</li>
		<li>유리 슬라이드는 어둠 속에서 실 온에서 1 h를 품 어.</li>
		<li>PBS-T 2 x 15 분에에서 유리 슬라이드를 씻어. 참고: 옵션: 더블, 트리플 immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 순차적 얼룩 수행할 수 있습니다 2, 3 번 각각 2.1.6 2.1.3에서 절차를 반복 하 여.</li>
		<li>안티-페이딩 마운팅 중간 포함 DAPI는 coverslip로 얼룩진된 곳을 알아내는-섹션을 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전체-마운트의 얼룩
	<ol>
<li>PBS-T 전체 마운트에 똑 하 고 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>부 어 하 고 1: 100 PDGFRβ, PBS-T + 1 %BSA 희석 1: 500 NG2 기본 항 체 물방울 4 ° C에서 촉촉한 실에서 밤새 품 어.</li>
		<li>부 어 하 고 PBS-T를 2 x 15 분에 유리 슬라이드를 씻어에 똑.</li>
		<li>부 어 하 고 1: 100 반 토끼 Cy2-고 1: 100 반대로 마우스 Cy3 연결 이차 항 체 품 어 어둠 속에서 실 온에서 습 한 약 실에 1 시간에 3 %BSA PBS-T에 희석에 똑.</li>
		<li>부 어 하 고 어둠 속에서 2 x 15 분에 린스를 PBS-T에 똑. 참고: 옵션: 더블, 트리플 immunofluorescent 얼룩이 지기에 대 한 순차적 얼룩 수행할 수 있습니다 2, 3 번 각각 2.2.5 2.2.2에서 절차를 반복 하 여.</li>
		<li>안티-페이딩 마운팅 중간 포함 DAPI는 coverslip로 얼룩진된 전체 마운트를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소형 고립 된 맥 관 구조의 얼룩
	<ol>
<li>소형 고립 된 맥 관 구조 100 rpm 및 실내 온도 10% 당나귀 혈 청 PBS에 희석의 500 µ L/잘 떨고와 1 시간을 차단 합니다.</li>
		<li>하룻밤 실 온에서 품 어와 1: 100 PDGFRβ 및 1: 500 NG2 1 차 항 체에 PBS에 10% 당나귀 혈 청 희석의 600 µ L/잘 100 rpm 동요.</li>
		<li>행 구 기는 망막 5 분에 대 한 PBS에 3 x 네트워크와 1: 100 반대로 마우스 알 렉 사 Fluor 594 연결 하 고 1: 100 반 토끼 FITC 연결 보조 항 체에 PBS 떨고 100 rpm 및 어둠 속에서 1 시간 실 온에 10% 당나귀 혈 청 희석에 품 어</li>
		<li>5 분에 대 한 PBS-T에서 헹 구 고 어둠 속에서 PBS-T에서 3 x 5 분 린스 다음 15 분 동안 0.2 ng/mL PBS T에 DAPI에서에서 품 어.</li>
		<li>플라스틱 파스퇴르 피펫으로의 끝을 잘라, PBS-T와 함께 그것을 축 축 하 고 4-잘 유리 챔버 슬라이드를 망막 네트워크를 전송 하는 데 사용할. 참고: moistening 단계는 파스퇴르 피펫으로의 내부에 집착 하는 망막 맥 관 구조를 방지 해야 합니다.</li>
		<li>망막 맥 관 구조를 전개. 이 엉 킴을 맥 관 구조를 발생할 수 있습니다 집게와 망막 맥 관 구조를 만지지 마십시오. 참고: 전개 할 수 챔버 슬라이드를 앞뒤로 기울이기 또는 망막 맥 관 구조에 액체의 방울 발음.</li>
		<li>우물에서 매체를 제거 합니다. 액체의 표면 장력은 슬라이드의 아래쪽에 맥 관 구조를 평평 것입니다.</li>
		<li>현미경으로 올바른 전개 챔버 슬라이드에서 우물 플라스틱을 제거 하기 전에 확인 합니다.</li>
		<li>안티-페이딩 장착 매체와는 coverslip 스테인드 맥 관 구조를 탑재 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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선물이 microvascular 망막 pericytes의 연구에 적용 될 수 있는 3 개의 망막 준비 기술. 아래, 우리 각 메서드 사이 비교를 제공 하 고 프로토콜에서 중요 한 단계를 강조.
곳을 알아내는-단면, 망막은 잘라 화살 섹션에 따라서, 그것은 동일한 망막에서 수많은 견본을 얻을 수. 이 방법에서 결과 숫자 섹션 항 체 특이성 및 적정 테스트로 불필요 한 동물 희생을 방지 하기 위한 이상적인 선택 하기가. 예비 일은 좋은 결과 위해 결정적 이다. 그것은 눈을 안 하지만 눈 주위의 모든 근육을 잘라 눈 해 부 동안 중요 합니다. 힘을 사용 하는 경우 망막의 위험이 있다. 눈 컵은 얇은, 때문에 하나 하지 너무 오래 수정 해야 합니다. 2-4 h에 대 한 PBS에 4 %paraformaldehyde 침수 조직을 해결 됩니다. 더 이상 고정, 관심사의 항 원을 파괴의 위험이 있다. 최고의 가능한 immunostainings를 생성 하기 위해 그것은 유리에 대 한 가능한 플랫...

이 세포는 맥 관 구조의 무결성에 중요 한 역할으로 망막 pericytes 많은 연구 실험실의 초점입니다. 당뇨병 성 망막 증1, 허 혈2, 녹 내장3 등 병 적인 조건 pericytes의 기능을 포함 하는 혈관 특성이 있다. Pericytes는 내부 망막 모 세관 plexuses에서 발견 된다. 중앙 망막 동맥 내부 망막을 공급 하는 모 세관 plexuses의 2 개의 층으로 분기 한다. 내부 관 침대는 신경 절 세포와 안 핵 층 사이 위치 해 있습니다. 깊은 계층 더 조밀 하 고 복잡 한 이며 내부 및 외부 핵 층4,5사이 지역화 됩니다. 또한, 망막의 일부는 또한 광선 parapapillary 모세 나 세 번째 네트워크를 포함 합니다. 이들은 긴, 신경 섬유 중 고 거의 직선 모 세관 다른 하나 또는 다른 두 plexuses6anastomose. 모 세관 벽에서 pericytes 지하실 멤브레인에 포함 하 고 혈관 내 피 세포의 abluminal 사이드 라인.
이 날짜에, 다른 혈관 세포에서 그들을 차별화 수 있는 이러한 pericytes의 독특한 생물 학적 마커 없는 있다. 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)는 일반적으로 사용 되 마커는 모두 다른 혈관 세포도 하지만 pericytes에 선물. Pericytes의 더 다양 한 형태 및 단백질 식7에서 pericyte 하위 집합의 존재에 의해 복잡 합니다. 현재, 최고의 식별 마커 단백질의 조합 및 혈관 벽에서 pericyte의 독특한 위치에 의존 합니다. 여기 쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo-섹션, 전체 마운트, 당뇨의 및 절연 혈관 네트워크의 immunohistochemical PDGFRβ/NG2 얼룩에 대 한 세 가지 다른 조직 준비 기술 설명 합니다.
곳을 알아내는-섹션, 망막과 공 막 시 신경을 통해 잘립니다. 신경의 모든 계층 구조의 시각화 수 있습니다. 망막의 고유 10 층 등 되며/오신 형광 핵 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8얼룩으로 구상 될 수 있다 핵 및 axonal/돌기 구조를 교환으로 명백 하다. 레이어9 와 그것은 신진 대사 요구 사항을 다 특정 층의 두께 또는 총 휴무를 결정 하는 방법을 제공 한다 (예를 들어, 망막 신경 절 세포의 손실 이다 망막 허 혈10의 특징 중 하나 11). 맥 관 구조 가로 각각 망막 층12,13내의 모 세관 plexuses를 별도로 공부 하는 게 가능 하 망막을 통해 삭감으로 분명 하다.
더 전통적으로, 망막 맥 관 구조 네트워크의 조사는 망막 전체-마운트에 수행 됩니다. 이 조직 준비, 망막은 잘라내어 꽃 모양의 구조로 결합. 메서드는 전체 아키텍처 망막 맥 관 구조를 강조 표시할 수 있습니다 상대적으로 빠른 조직 준비 기술 이며 따라서 neovascularization murine 망막에서의 조사에 적용 종종. 전체 장착 망막에 microvasculature의 성공적인 시각화 또한 개발 신생아 마우스와 쥐 망막14,15,,1617,18, 에서 보고 19.이 연구는 신생아 망막14에 비해 성인에서 더 큰 모 세관 자유로운 지역으로 더 정의 된 pericytic 활동을 공개.
시각화의 또 다른 방법은 소형 격리 후 망막 microvasculature입니다. 이 조직 준비 기술 망막 혈관과 신경 세포의 해제 되 고 모세 혈관에서 발생 합니다. 격리 망막 혈관 네트워크의 2 차원 이미지의이 유형은 일반적으로 망막 트립 신 소화20 후 수행 하 고 pericyte 손실 및 모 세관을 포함 하 여 당뇨병 성 망막 증의 혈관 이상이 평가 하는 데 사용 변성20,,2122. 침투성 격리 방법 그들은 RT-PCR와 서쪽 더 럽 히23,,2425완료 되었습니다 망막 혈관 유전자와 단백질 규제 응답의 조사를 제공 합니다. 여기 검사 microvascular pericytes 트립 신 소화 하는 대신 소형 고립 된 망막 맥 관 구조의 무료-플 로트 immunohistochemical 얼룩에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>돼지 껍질에서 추출한 젤레틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자에서 추출한 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>디옥시리보뉴클레아제(DNAse) 소 췌장에서 추출한 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>0.15M NaCl에 용해</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>잭슨 ImmunoResearch</td><td>017-000-121, 로트 129348</td><td></td></tr><tr><td>토끼 anti-PDGFR&beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 마우스 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>안티 페이딩 마운팅 매체</td>에 용해 <td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>안티 페이딩 마운팅 미디어 with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 4웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

망막 cryo-섹션, microvascular pericytes의 immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

망막 pericytes 눈의 많은 질병에 중요 한 역할을 한다. 얼룩 기법 및 microvascular 망막 혈관의 Immunohistochemical pericytes는 안 과학 연구의 중심. Microvascular pericytes를 시각화 하는 적절 한 방법을 선택 하는 것이 생명 이다. 곳을 알아내는-섹션, 전체 마운트, 그리고 혈소판 유래 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)에 대 한 항 체를 사용 하 여 소형 고립 된 맥 관 구조에 얼룩 망막 microvascular pericyte immunohistochemical을 설명 합니다. 장점과 망막 microvascular pericytes의 시각화에 대 한 세 가지 조직 준비의 각각의 단점을 강조 하기 위해 수 있습니다. 곳을 알아내는-섹션 모든 망막 층의 transsectional 시각화를 제공 하지만 단지 몇 가끔 가로의 상처는 microvasculature 포함. 전체-마운트 전체 망막 맥 관 구조에 대 한 개요를 제공 하지만 시각화는 microvasculature의 곤란 하실 수 있습니다. 침투성 격리 신경 세포의 제거로 전체 망막 맥 관 구조를 시각화 하는 방법을 제공 하지만이 조직 매우 깨지기 쉬운.

성공적인 프로토콜 microvascular pericytes를 시각화에 대 한 세 가지 다른 망막 준비를 제공 합니다. 이러한 각 메서드 PDGFRβ 및 NG2 immunoreactivity 공동 지역화와 모 세관 내 피 foridentification 주위에 포장 하는 pericytes의 독특한 위치를 사용 합니다.
곳을 알아내는-섹션, 신경 레이어 DAPI 셔 서 핵과 내부 형광 밀도 의해 확인 될 수 있다와 깊은 모 세관 plexuses 포함 PDGFRβ 그리고 NG2 immunoreactivity (그림 1)를 표시 하는 pericytes. 선박 (그림 1, 화살표)의 주변에 원형 또는 말굽 모양의 immunoreactivity로 혈관 벽에 peric...

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

이러한 메서드는 pericyte 확산 또는 마이그레이션과 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 절차의 주요 장점은 다양한 시각화 옵션을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 카린 드레이시그와 프랭크 W.Blixt, 우리의 실험실에서 두 개의 포스트 문서가 될 것입니다.눈을 방출하기 위해 먼저 메스를 사용하여 쥐 눈꺼풀에서 약 0.5 cm의 후방 및 전방 슬릿을 만듭니다. 집게로 눈을 잡고 주변 조직을 노출하기 위해 측면에 조심스럽게 기울어. 결합 및 근육 조직에서 해부 가위로 절단하여 눈을 방출합니다.눈을 4% 포름알데히드와 인산염 완충식염에 1~2분 간 간략하게 배치합니다. 메스 끝에 가벼운 압력을 가하여 각막 림푸스에 구멍을 만들기 전에 나트륨 버퍼에서 잠시 헹구세요. 각막 변두를 해부 가위로 잘라 각막과 렌즈를 집게로 제거합니다.2 ~4 시간 동안 PBS에서 4 %의 포름 알데히드에서 망막으로 나머지 조직을 잠급. 10%의 자당과 25%의 자당을 함유한 소렌슨의 인산염 완충제에 몰입하여 조직을 보호합니다. 용기의 바닥에 침몰한 후 조직을 옮김시합니다.야줄라 배지에 모신 피부의 젤라틴 3%와 치킨 달걀 흰자 30%의 알부민으로 제조했습니다. 다음으로, 젤라틴 임베디드 망막의 10미크론 수직 극저섹션을 시신경까지 잘라냅니다. 냉동 섹션을 유리 슬라이드에 놓고 최소 1 시간 동안 건조하십시오.일단 건조되면 PBS에서 슬라이드를 0.25 % Triton-X 100으로 15 분 동안 잠급하십시오. 이어서, PBST에서 1:100 PDGF 수용체 베타 및 1:500 NG2 1차 항체의 혼합물을 냉동절에 드립시키고 밤새 섭씨 4도에서 습한 챔버에 놓는다. 다음 날, PBST에 슬라이드를 매번 15분 동안 두 번 침지하여 섹션을 세척합니다.그런 다음 1:100 항 마우스 알렉사 플루오 594 연결 및 1:100 안티 래빗 FITC 연결 이차 항체의 혼합물을 물방울 3% BSA와 PBST에 희석 하 고 어둠 속에서 1 시간 동안 배양. 인큐베이션 후 매번 15분 동안 PBST에서 유리 슬라이드를 두 번 헹구십시오. 염색된 극저커버부를 DAPI와 커버슬립이 들어 있는 변색 방지 마운팅 배지를 장착합니다.두 번째 망막 조직 준비 기술은 전체 마운트입니다. 각막제거 후, 포셉의 작은 개구 운동을 사용하여 망막과 망막을 시신경쪽으로 분리한다. 해부 가위로 시신경에서 망막을 풀고 망막 주변에서 시신경 헤드쪽으로 3~4밀리미터 길이의 슬릿을 만듭니다.망막을 유리 슬라이드에 펴서 5-10분 동안 건조시다. 망막에 4%포름알데히드를 드립하고 20~30분 동안 수정합니다. 고정 후 PBS로 헹구는 다.최적의 결과를 얻으려면 헹구기 직후 면역 스테인이 발생합니다. 먼저 PBST를 전체 마운트에 드립시키고 실온에서 15분 동안 배양합니다. PBST를 부어, 다음 기본 항체 용액을 추가하고 하룻밤 섭씨 4도에서 습한 챔버에 인큐베이션.다음 날, 1 차적인 항체를 부어 PBST에 물방울을 부어 매번 15 분 동안 망막을 두 번 헹구었다. 두 번째 세척을 쏟아 부은 후, 이차 항체 용액을 망막에 떨어 뜨리고 어둠 속에서 실온에서 습한 챔버에서 1 시간 동안 배양하십시오. 이차 항체 인큐베이션에 따라, 이전과 같이 PBST로 두 번 세척하십시오.염색된 전체 마운트에 DAPI와 커버 슬립이 들어 있는 페이딩 방지 장착 배지를 장착합니다. 망막 전체를 장착하는 대안으로 망막 혈관은 저혈압 절연에 의해 격리될 수 있습니다. 먼저, 망막을 24웰 플레이트에 1밀리리터에 넣고 실온에서 1시간 동안 1.5mm 진동 궤도로 200rpm에서 흔들어 준 다음, 200단위의 DNAse 1을 추가하여 망막 바스컬레에서 용액 세포 잔해를 분리하고 30분 동안 또 다른 온도에서 흔들어 줍니다.150~300rpm에서 흔들리면서 각각 5분 동안 탈이온화된 물에 망막을 헹구어 신경 세포 이물질을 제거합니다. 망막은 각 헹구기와 더 투명해져야 하며, 이는 뉴런 세포 이물질의 제거를 나타냅니다. 헹구고, 실온에서 10 분 동안 4 %의 파라 포름알데히드와 PBS의 1 밀리리터에 망막을 고정합니다.PBS로 세 번 헹구는 다. 면역 염색을 진행하는 경우, 100 rpm에서 흔들림으로 PBS에서 희석 된 10 %의 당나귀 혈청의 500 마이크로 리터로 저혈압 절연 혈관을 차단하십시오. 차단 후, 1:100 PDGF 수용체 베타 및 1:500 NG2 1차 항체로 구성된 1차 항체 용액의 600 마이크로리터에서 하룻밤 사이에 망막을 배양하여 10%의 당나귀 혈청 및 PBS로 희석하였다.다음 날, PBS에서 매번 5분 동안 망막망을 세 번 헹구고, 1:100 항 마우스 알렉사 플루어 594번째 연결 및 1:100 안티래빗 FITC 연결 보조 항체로 배양하고, 10%의 당나귀 혈청과 PBS로 100rpm에 100rpm에 흔들립니다. PBST에서 5분간 세척한 후 밀리리터 당 0.2 나노그램DAPI 및 PBST를 15분간 배양합니다. 빛으로부터 보호하면서 PBST로 5분간 세 번 씻습니다.다음으로 플라스틱 파스퇴르 파이펫의 끝을 잘라냅니다. 파이펫 팁을 사용하여 날카로운 가장자리를 제거하고 PBST로 파스퇴르 파이펫을 적신 다음 망막 혈관을 파이펫에 흡입하고 4웰 유리 챔버 슬라이드로 분배합니다. 나모하는 단계는 파스퇴르 파이펫의 내부에 집착 망막 혈관을 방지하는 것이 중요합니다.챔버 슬라이드를 앞뒤로 기울여 망막 혈관을 배치합니다. 챔버 슬라이드의 우물에서 매체를 제거합니다. 액체의 표면 장력은 슬라이드의 바닥에 혈관을 평평하게합니다.필요한 경우 망막 혈관에 액체를 떨어뜨려 펼쳐집니다. 챔버 슬라이드에서 플라스틱 우물을 제거하기 전에 현미경으로 올바른 전개를 보장합니다. 염색된 혈관을 탈구에 탈색 방지 마운팅 미디엄과 커버 슬립을 장착합니다.NG2 면역 조직 화학은 망막의 내부 부분 내에서 양성 혈관을 드러낸다. 화살표는 혈관에서 원형 및 말굽 모양의 면역 반응성을 나타냅니다. 화살촉은 세로절단 용기를 가리킨다.PDGF 수용체 베타 면역히스토케는 NG2와 유사한 면역 반응성을 나타낸다. 다시 화살표와 화살촉은 혈관의 면역 반응성을 나타냅니다. 이 이미지는 녹색의 NG2, 빨간색의 PDGF 수용체 베타, 파란색DAPI의 병합을 나타낸다.3개의 상이한 필터를 겹쳐서 NG2 및 PDGF 수용체 베타가 공동 국화되는 것으로 밝혀졌다. 이 이미지는 NG2가 빨간색으로 염색한 면역 염색 된 전체 마운트 준비를 보여줍니다. 면역 반응성은 아블루민 성 동맥에서 강렬한 염색과 피상 혈관 네트워크를 따라 볼 수 있습니다.신경 세포는 NG2 염색 된 미세 혈관 사이의 DAPI 블루 핵으로 볼 수 있습니다. 이 이미지는 녹색 및 PDGF 수용체 베타에서 NG2로 염색된 저혈압 분리 된 쥐 망막 혈관 네트워크를 빨간색으로 보여줍니다. 전체 네트워크는 NG2 면역 반응성을 보였다.PDGF 수용체 베타 면역 반응성은 세포 소마에서 발견되었다. 더 높은 배율에서, PDGF 수용체 베타 염색은 혈관 네트워크의 세포 소마에서만 볼 수 있음이 분명하며, 이는 백혈구 면역 반응성을 나타낸다. NG2 및 PDGF 수용체 베타와 함께 염색하는 DAPI를 포함하여 이 고배율 이미지에서 2개의 정의되지 않은 혈관 벽 세포에 있는 3개의 pericytes를 제시합니다.이러한 절차에 따라, 부드러운 근육 세포 또는 내피 얼룩 같은 다른 면역 염색 추가 질문에 대답 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 망막 혈관의 세포는 어떻게 허혈을 따르는 것처럼 보이나요?

retinal-cryo-sections-whole-mounts-hypotonic-isolated-vasculature

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

신생아 쥐 망막에서 혈관 신생을 조절 다른 유전자 또는 약물의 역할의 조사를 허용하는 혈관의 잘 특성화 생리 학적 모델을...

혈관을 조사하기 위해 신생아 마우스 망막의 전체 마운트 면역 형광 염색<em&gt; 생체 내</em

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

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면역 조직 화학을 위한 마우스 망막 극저온 단면도 단면도의 준비

이 문서에서는 전체 마운트 망막 제제및 증식 및 비증식 망막병에서 자주 변경되는 혈관 매개 변수의 정량적 측정에 필요한 프로토콜에 대해 잘 확립되고 재현 가능한 렉틴 얼룩 분석법에 대해 설명합니다.

비증식 및 증식 망막증을 가진 마우스의 전체 산 망막에 있는 혈관 매개변수의 정량화

이 프로토콜은 전체 토끼 눈의 고품질 냉동 절개를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 토끼 눈 절제술, 고정, 포매 및 절편 절차에 대해 자세히 설명하며, 이는 큰 눈에 면역조직화학을 활용하는 모든 연구에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Whole Rabbit Eye의 고품질 냉동 절개 획득 

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

현재의 방법은 같은 biopsies 및 뇌 조각과 같은 작은 어려운 관리, 조직 조각의 sectioning 재현할 그라 이오 스탯 수 있습니다. 우리는 조직의 처리와 정기적으로 400 미크론 두께의 뇌 조각 5-10 미크론 시리얼 섹션을 생성하는 표준 그라 이오 스탯을 촉진하기 위하여 간단한 알루미늄 동결 단계를 활용.

Immunohistochemistry에 대한 슬라이스 준비 씬 Sectioning

학습하세요 쥐 망막 미세혈관 페리사이트를 시각화하는 세 가지 면역조직화학 기법: 크라이오섹션, 홀마운트, 저삼투압 혈관 격리법. 이 방법들은 안과학 연구에서 페리사이트 증식과 이동을 연구하는 데 필수적입니다.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

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