망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

이러한 메서드는 pericyte 확산 또는 마이그레이션과 같은 안과 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 절차의 주요 장점은 다양한 시각화 옵션을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 카린 드레이시그와 프랭크 W.Blixt, 우리의 실험실에서 두 개의 포스트 문서가 될 것입니다.

눈을 방출하기 위해 먼저 메스를 사용하여 쥐 눈꺼풀에서 약 0.5 cm의 후방 및 전방 슬릿을 만듭니다. 집게로 눈을 잡고 주변 조직을 노출하기 위해 측면에 조심스럽게 기울어. 결합 및 근육 조직에서 해부 가위로 절단하여 눈을 방출합니다.

눈을 4% 포름알데히드와 인산염 완충식염에 1~2분 간 간략하게 배치합니다. 메스 끝에 가벼운 압력을 가하여 각막 림푸스에 구멍을 만들기 전에 나트륨 버퍼에서 잠시 헹구세요. 각막 변두를 해부 가위로 잘라 각막과 렌즈를 집게로 제거합니다.

2 ~4 시간 동안 PBS에서 4 %의 포름 알데히드에서 망막으로 나머지 조직을 잠급. 10%의 자당과 25%의 자당을 함유한 소렌슨의 인산염 완충제에 몰입하여 조직을 보호합니다. 용기의 바닥에 침몰한 후 조직을 옮김시합니다.

야줄라 배지에 모신 피부의 젤라틴 3%와 치킨 달걀 흰자 30%의 알부민으로 제조했습니다. 다음으로, 젤라틴 임베디드 망막의 10미크론 수직 극저섹션을 시신경까지 잘라냅니다. 냉동 섹션을 유리 슬라이드에 놓고 최소 1 시간 동안 건조하십시오.

일단 건조되면 PBS에서 슬라이드를 0.25 % Triton-X 100으로 15 분 동안 잠급하십시오. 이어서, PBST에서 1:100 PDGF 수용체 베타 및 1:500 NG2 1차 항체의 혼합물을 냉동절에 드립시키고 밤새 섭씨 4도에서 습한 챔버에 놓는다. 다음 날, PBST에 슬라이드를 매번 15분 동안 두 번 침지하여 섹션을 세척합니다.

그런 다음 1:100 항 마우스 알렉사 플루오 594 연결 및 1:100 안티 래빗 FITC 연결 이차 항체의 혼합물을 물방울 3% BSA와 PBST에 희석 하 고 어둠 속에서 1 시간 동안 배양. 인큐베이션 후 매번 15분 동안 PBST에서 유리 슬라이드를 두 번 헹구십시오. 염색된 극저커버부를 DAPI와 커버슬립이 들어 있는 변색 방지 마운팅 배지를 장착합니다.

두 번째 망막 조직 준비 기술은 전체 마운트입니다. 각막제거 후, 포셉의 작은 개구 운동을 사용하여 망막과 망막을 시신경쪽으로 분리한다. 해부 가위로 시신경에서 망막을 풀고 망막 주변에서 시신경 헤드쪽으로 3~4밀리미터 길이의 슬릿을 만듭니다.

망막을 유리 슬라이드에 펴서 5-10분 동안 건조시다. 망막에 4%포름알데히드를 드립하고 20~30분 동안 수정합니다. 고정 후 PBS로 헹구는 다.

최적의 결과를 얻으려면 헹구기 직후 면역 스테인이 발생합니다. 먼저 PBST를 전체 마운트에 드립시키고 실온에서 15분 동안 배양합니다. PBST를 부어, 다음 기본 항체 용액을 추가하고 하룻밤 섭씨 4도에서 습한 챔버에 인큐베이션.

다음 날, 1 차적인 항체를 부어 PBST에 물방울을 부어 매번 15 분 동안 망막을 두 번 헹구었다. 두 번째 세척을 쏟아 부은 후, 이차 항체 용액을 망막에 떨어 뜨리고 어둠 속에서 실온에서 습한 챔버에서 1 시간 동안 배양하십시오. 이차 항체 인큐베이션에 따라, 이전과 같이 PBST로 두 번 세척하십시오.

염색된 전체 마운트에 DAPI와 커버 슬립이 들어 있는 페이딩 방지 장착 배지를 장착합니다. 망막 전체를 장착하는 대안으로 망막 혈관은 저혈압 절연에 의해 격리될 수 있습니다. 먼저, 망막을 24웰 플레이트에 1밀리리터에 넣고 실온에서 1시간 동안 1.5mm 진동 궤도로 200rpm에서 흔들어 준 다음, 200단위의 DNAse 1을 추가하여 망막 바스컬레에서 용액 세포 잔해를 분리하고 30분 동안 또 다른 온도에서 흔들어 줍니다.

150~300rpm에서 흔들리면서 각각 5분 동안 탈이온화된 물에 망막을 헹구어 신경 세포 이물질을 제거합니다. 망막은 각 헹구기와 더 투명해져야 하며, 이는 뉴런 세포 이물질의 제거를 나타냅니다. 헹구고, 실온에서 10 분 동안 4 %의 파라 포름알데히드와 PBS의 1 밀리리터에 망막을 고정합니다.

PBS로 세 번 헹구는 다. 면역 염색을 진행하는 경우, 100 rpm에서 흔들림으로 PBS에서 희석 된 10 %의 당나귀 혈청의 500 마이크로 리터로 저혈압 절연 혈관을 차단하십시오. 차단 후, 1:100 PDGF 수용체 베타 및 1:500 NG2 1차 항체로 구성된 1차 항체 용액의 600 마이크로리터에서 하룻밤 사이에 망막을 배양하여 10%의 당나귀 혈청 및 PBS로 희석하였다.

다음 날, PBS에서 매번 5분 동안 망막망을 세 번 헹구고, 1:100 항 마우스 알렉사 플루어 594번째 연결 및 1:100 안티래빗 FITC 연결 보조 항체로 배양하고, 10%의 당나귀 혈청과 PBS로 100rpm에 100rpm에 흔들립니다. PBST에서 5분간 세척한 후 밀리리터 당 0.2 나노그램DAPI 및 PBST를 15분간 배양합니다. 빛으로부터 보호하면서 PBST로 5분간 세 번 씻습니다.

다음으로 플라스틱 파스퇴르 파이펫의 끝을 잘라냅니다. 파이펫 팁을 사용하여 날카로운 가장자리를 제거하고 PBST로 파스퇴르 파이펫을 적신 다음 망막 혈관을 파이펫에 흡입하고 4웰 유리 챔버 슬라이드로 분배합니다. 나모하는 단계는 파스퇴르 파이펫의 내부에 집착 망막 혈관을 방지하는 것이 중요합니다.

챔버 슬라이드를 앞뒤로 기울여 망막 혈관을 배치합니다. 챔버 슬라이드의 우물에서 매체를 제거합니다. 액체의 표면 장력은 슬라이드의 바닥에 혈관을 평평하게합니다.

필요한 경우 망막 혈관에 액체를 떨어뜨려 펼쳐집니다. 챔버 슬라이드에서 플라스틱 우물을 제거하기 전에 현미경으로 올바른 전개를 보장합니다. 염색된 혈관을 탈구에 탈색 방지 마운팅 미디엄과 커버 슬립을 장착합니다.

NG2 면역 조직 화학은 망막의 내부 부분 내에서 양성 혈관을 드러낸다. 화살표는 혈관에서 원형 및 말굽 모양의 면역 반응성을 나타냅니다. 화살촉은 세로절단 용기를 가리킨다.

PDGF 수용체 베타 면역히스토케는 NG2와 유사한 면역 반응성을 나타낸다. 다시 화살표와 화살촉은 혈관의 면역 반응성을 나타냅니다. 이 이미지는 녹색의 NG2, 빨간색의 PDGF 수용체 베타, 파란색DAPI의 병합을 나타낸다.

3개의 상이한 필터를 겹쳐서 NG2 및 PDGF 수용체 베타가 공동 국화되는 것으로 밝혀졌다. 이 이미지는 NG2가 빨간색으로 염색한 면역 염색 된 전체 마운트 준비를 보여줍니다. 면역 반응성은 아블루민 성 동맥에서 강렬한 염색과 피상 혈관 네트워크를 따라 볼 수 있습니다.

신경 세포는 NG2 염색 된 미세 혈관 사이의 DAPI 블루 핵으로 볼 수 있습니다. 이 이미지는 녹색 및 PDGF 수용체 베타에서 NG2로 염색된 저혈압 분리 된 쥐 망막 혈관 네트워크를 빨간색으로 보여줍니다. 전체 네트워크는 NG2 면역 반응성을 보였다.

PDGF 수용체 베타 면역 반응성은 세포 소마에서 발견되었다. 더 높은 배율에서, PDGF 수용체 베타 염색은 혈관 네트워크의 세포 소마에서만 볼 수 있음이 분명하며, 이는 백혈구 면역 반응성을 나타낸다. NG2 및 PDGF 수용체 베타와 함께 염색하는 DAPI를 포함하여 이 고배율 이미지에서 2개의 정의되지 않은 혈관 벽 세포에 있는 3개의 pericytes를 제시합니다.

이러한 절차에 따라, 부드러운 근육 세포 또는 내피 얼룩 같은 다른 면역 염색 추가 질문에 대답 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 망막 혈관의 세포는 어떻게 허혈을 따르는 것처럼 보이나요?