Name: 캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 배우세요 재조합 엘라스틴 유사 단백질을 발현 및 정제하여 조절 가능한 하이드로겔을 제작하고 3D 세포 캡슐화 및 형광 면역염색을 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 외기질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자 감사 토니 파머와 H. 간디 (스탠포드 신경외과) 그림 4에서 murine NPCs 벡터 아트를 제공 하는 사용 하 고 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 3.0 Unported 라이센스 (https://creativecommons.org/ 아래 Servier 의료 예술에서 적용 licenses/by/3.0/legalcode)입니다. 이 작품의 일부에는 스탠포드 나노 공유 시설 (SNSF), 수상 ECCS-1542152에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는 수행 되었다. N.A.S. 지원 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 건강의 국가 학회 (32 GM 008412)의 인정합니다. C.M.M. 사전 박사 친목 (F31 EB020502) 그리고 Siebel 학자 프로그램 NIH NRSA에서 지원을 인정 한다. S.C.H. 재생 의학 (RT3-07948)는 건강의 국가 학회 (U19 AI116484 및 R21 EB018407), 국립 과학 재단 (DMR 1508006), 및 캘리포니아 연구소에서 지원을 인정합니다. 이 연구는 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 인간 발달 (NICHD), 국립 연구소에 의해 지원 되는 재생 재활 연구 및 교육 (AR3T), 얼라이언스에서 자금 지원을 받은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS), 국립 생물 의학 이미징 및 생명 공학 (NIBIB)의 수상 번호 P2CHD086843에서 건강의 국가 학회. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 의견을 대표 하지 않는다.

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저자는 공개 없다.

재조합 형 단백질 표정과 정화 높은 재현성 바이오 소재를 합성 하는 강력한 도구입니다. 때문에 크게 상용화 분자 클로닝의 출현, 사용자 정의 재조합 형 플라스 미드 구입하실 수 있습니다 여러 공급 업체에서 크게 ELPs 같은 재료와 함께 일 하는 시간을 감소 시키는. 마찬가지로, plasmids 원래 작품 연방 계약에 의해 지원 되었다 미래 일 비영리 사용 될 것입니다 때 원래 실험실에서 직접 요청할 수 있습니다. 전체 ELP 아미노산 시퀀스 여러 ELP 변종31이전 게시 되었습니다. 그러나, 재조합 단백질의 최종 정화에 식에서 프로세스는 일반적으로 감소 수익률 또는 낮은 품질의 제품으로 이어질 수 있는 중요 한 단계의 숫자 포함 됩니다. ELP 준비에 대 한 가장 일반적인 문제 중 일부는 다음 중 하나에 발생: (1) 저장된 세균성 주식의 품질, 세균 막, 그리고 (3) 단백질 정화 열 사이클링을 통해 방해 (2) 첫 번째 동결-해 동 주기.
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지난 세기 동안 2 차원 (2D) 조직 문화는 근본적인 세포 생물학에서 공부 시험관에대 한 통합 도구 집합으로 개발 했다. 또한, 2 차원 세포 배양에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 간단한 프로토콜은 많은 생물학과 의학 분야에 걸쳐 그것의 채용에 이르렀다. 그러나, 과거의 연구 표시 했다 전통적인 2D 플랫폼 이어질 수 있는 결과 그 수집 된 vivo에서에서 현저 하 게 이탈, 귀중 한 시간을 일으키는 원인이 되 고 자금 낭비 임상 지향적인된 연구1,2, 3. 우리와 다른 가설 것이 불일치 최적의 확산 및 다양 한 종류의 세포 성숙에 필요한 수 있는 2D 표면에 경작 하는 셀에 제공 하는 네이티브 생화학 및 생물 단서의 부족에 표시 될 수 있습니다.
이러한 제한 및 도움 다리 2D 간의 격차를 해결 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문, 연구원은 세포 캡슐화1,4,5 개발된 3 차원 (3D) 히드로 플랫폼을가지고 ,6. Hydrogels는 이상적인 재료는 세포 외 기질 (ECM) 생체 내에서 그들의 조직 같은 기계적 성질 및 영양분의 빠른 수송을 가능 하 게 물을 부 어 구조의 내 인 성 microenvironment을 정리 하 고 신호7,8요인. 또한, 3D hydrogels 독립 제어할 발판의 기계 및 생 화 확 적인 속성을 설계할 수 있습니다. 매트릭스 역학9,10,,1112 와 셀 접착제 ligands13,,1415 셀에 영향을 잘 알려져 있습니다. 생체 외에서 행동 하 고 vivo에서. 따라서, 가변 속성 3D hydrogels 셀과 그들의 microenvironment 간의 인과 관계를 연구 하는 플랫폼을 제공 합니다. 이상적인 3D 하이드로 겔 매트릭스에 대 한 기준 간단 하 고, 비 세포 독성 세포 캡슐화로 생리 적으로 관련 된 기계적 특성의 독립적인 tunability 및 기본 세포 접착 모티프의 모방을 포함.
모두 합성 (예., 폴 리 에틸렌 글리콜, polylactic 산, 폴 리 (glycolic acid)) 자연스럽 게 파생 (예., alginate, 콜라겐, Matrigel) hydrogels 있다 이점이 문화 플랫폼 2D 생체 외에서 ; 그러나, 그들은 또한 그들의 적용을 제한 하는 중요 한 단점이 있다. 첫 번째, 포유류 세포에 잠재적으로 독성이 될 수 있는 가혹한 가교 조건을 요구 하는 많은 합성 하 고 자연스럽 게 파생 된 플랫폼, 선도적인 세포 생존7감소. 또한, 많은 합성 플랫폼 네이티브 bioactivity 부족 그리고 증가 비용 및 복잡성16을 추가할 수 있는 보조 화학 반응을 통해 공업화 될 해야 합니다. 마지막으로, 자연스럽 게 파생 된 자료는 일반적으로 내장 바이오 액티브 도메인을 포함, 그들은 종종 높은 일괄 배치 변화를 시달려 고 종종 상대적으로 약한 젤7,17형성에 제한 됩니다.
재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스를 명시적으로 제어 함으로써 재료 설계에 대 한 고유한 도구 집합을 제공 하 고, 확장 하 여, 최종 하이드로 겔의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 재산18발판. 또한, 대장균 (대장균) 단백질을 표현 하의 잘 알려진 생물 학적 기계를 활용 하 여 재료 생산 수 있습니다 효율적이 고 일관 되 게 제한 남북 및 내부-일괄 가변성. 여기에 제시 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP)는 3 개의 조작된 도메인: 항 체를 태그를 통해 붙일 라벨을 허용 (1) T7, His6 태그, 수 여 탄성 기계적 성질 및 화학에 대 한 (2)는 ' 엘라 스 틴 같은 ' 지역 가교, (3) 세포 접착 모티프에 대 한 인코딩 ' 바이오-액티브 ' 지역.
엘라 스 틴 같은 지역 4 'Xaa' 아미노산 사이트 이소류신 (Ile), 하지만 될 수 있는 어떤 아미노산 프롤린 제외 될 하도록 정식 (발-프로-Gly-Xaa-Gly)5 엘라 스 틴 시퀀스를 기반으로 합니다. 이 시퀀스는 간단한 정화 후 식 열 사이클링19,20를 통해 악용 될 수 있는 낮은 중요 한 솔루션 온도 (LCST) 동작으로 재조합 ELPs endows. 이 LCST 속성 열 집계에 다른 온도에 게스트 'Xaa' 찌 꺼 기21,22를 수정 하 여 조정 될 수 있습니다.
여기, 5 엘라 스 틴 같은 반복 중 하나에 'Xaa' 위치는 아민 제시 리 (리스) 아미노산, 히드로 가교에 이용 되는 대체 되었습니다. 우리의 이전 작품 비 세포 독성과 강력한 아민 반응 crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 (THPC)23반응을 통해 가교를 보이고 있다. 다양 한 전체 단백질 콘텐츠 및 crosslinker 농도, 우리 hydrogels 순수 관련 강성 범위 (~0.5-50 kPa)9,,2324스팬 조정 될 수 있습니다 생산 수 있습니다. 기계적 성질, 튜닝 외에 히드로 내 세포 접착 ELP 단백질의 백본 내의 정식 셀 접착제 도메인의 통합에서 유래한 다. 예를 들어 비 바인딩 'RDGS' 변종 세포-매트릭스 접착24을 제한 확장된 fibronectin 파생 'RGDS' 아미노산 시퀀스의 세포 접착 및 스크램블, 동안 구조적 유연성을 허용 합니다. 세포 접착 비 접착 단백질 뿐만 아니라 총 단백질 농도의 비율을 변조, 우리가 효과적으로 리간드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 hydrogels 생산 수 있습니다. 릴리스할, 히드로 플랫폼 독립적으로 튜닝할 수 없는 다양 한 종류의 세포 최적의 3D 문화에 대 한 분리 된 생 화 확 및 생물 속성을 개발 했습니다.
매트릭스 강성 및 접착제 ligand tunability, 재조합 hydrogels 셀 확산, 확산, 및4 3D 컨텍스트 내에서 마이그레이션에 필요한 디자인 특정 소재 저하 프로필 기능 제공 , 9.이 저하 특히 대상으로 확장된 'RGDS'9 또는 엘라 스 틴 같은 시퀀스25프로 테아의 분 비 세포에서 제공. ELP hydrogels 세포 생존 능력 및 기능 immunocytochemistry 양적 역에 대 한 DNA/RNA/단백질 추출 등 공부에 필요한 후속 생 화 확 적인 분석 실험을 지원 하기 위해 표시 되었습니다 또한 전사-연쇄 반응 (qRT-PCR)와 서 부 오9점. ELP 변종 vivo에서 모델의 수에도 사용 되었습니다 그리고26면역 시스템 의해 잘 용납 될 것으로 알려져 있습니다.
합쳐, ELP 다양 한 합성 또는 자연스럽 게 파생 된 소재 플랫폼, 생화학 및 생물 tunability의 동일한 정도 부족에 비해 혜택을 자랑 하는 셀 캡슐화 연구 소재 플랫폼으로 고 재현성입니다. 또한, ELP의 간단 하 고 세포 독성 비 사용 다양 한 세포 유형 (예., 병아리 지 루트 중추14,24, murine 신경 조상 세포9, 인간 간 엽 줄기 세포27, 소 신생아 chondrocytes28, 인간 내 피 세포29,30) 2 차원 세포 배양에 비해 생 3D ECM의 더 순수 관련 모델에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리 recombinantly 파생의 표현에 대 한 프로토콜을 제시, 3D에 대 한 가변 히드로 플랫폼으로 사용 하기 위해 ELPs 세포 캡슐화. 우리는 더 다운 스트림 형광 라벨 및 캡슐화 된 세포의 confocal 현미경 검사 법에 대 한 방법론을 제시.

<table><tbody><tr><td>Elastin-like Protein Expression and Purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm Petri Dishes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>RICCA Chemical</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>ammonium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3920-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1760-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>9002-18-0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS Competent Cells</td><td>Invitrogen</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Amresco</td><td>0230-100G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 I</td><td>시그마-알드리치</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐염, 디하이드레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O2793-500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1755-10G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.5007</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>MP Biomedicals</td><td>195381</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S 8045-1KG</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터 유닛 (0.22 & m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>훌륭한 국물</td><td>Millipore</td><td>71754-4</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu; m 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 두께의 실리콘 시트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>70338-05</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 조직 배양 플레이트&nbsp;</td><td>코닝</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치 (2mm)</td><td>인테그라 밀텍</td>스 <td>33-31</td><td></td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치 (4mm)</td><td>인테그라 밀텍스</td><td>33-34</td><td></td></tr><tr><td>일회용 생검 펀치 (5mm)</td><td>인테그라 밀텍스</td><td>33-35</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 인산염 완충 식염수(DPBS)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 12 mm 유리 커버슬립</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(하이드록시메틸)포스포늄 클로라이드 (THPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404861-100ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Tryspin/EDTA</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td><강한>3D ELP 하이드로겔 내 세포의 면역세포화학</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% (w/v) 파라포름알데히드(PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15701</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>로슈</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디하이드로클로라이드)</td><td>분자 프로브</td><td>D1306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 혈청</td><td>Lampire Biological Labs</td><td>7332100</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 마우스 2 차 항체 (AF488)</td><td>분자 프로브</td><td>A-11017</td><td></td></tr><tr><td>염소 항 토끼 2 차 항체 (AF546)</td><td>분자 프로브</td><td>A-11071</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Nestin 1 차 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>556309</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Sox2 주요 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>23064S</td><td></td></tr><tr><td>네일 폴리시</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 하드셋 마운팅 미디엄&nbsp;</td><td>벡터 연구소</td><td>H-1400&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

캡슐화 및 3d에서 셀의 immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 hydrogels의 생산

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

2 차원 (2D) 조직 문화 기술 근본적인 세포 생물학의 우리의 이해에 필수적인 되었습니다. 그러나, 전통적인 2D 조직 문화 시스템 부족 결과 사이의 중요 한 결과 3 차원 (3D) 매트릭스 분리 수집 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 한계를 해결 하기 위해 연구자는 vivo에서 세포 microenvironment의 생 화 확 및 생물 속성을 흉내낼 수 있는 3 차원 하이드로 겔 조직 문화 플랫폼 설계 있다. 이 연구는 3D 셀 캡슐화 및 다운스트림 생 화 확 적인 분석 실험을 지 원하는 소재 플랫폼을 개발할 필요가 동기가 있다. 재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스의 특정 컨트롤에 대 한 허용 및 따라서, 확장, 결과의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 속성 3D 하이드로 겔 소재 설계 및 개발에 대 한 고유한 도구 제공 매트릭스입니다. 여기, 우리는 recombinantly 파생 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP), 양식 hydrogels 독립적으로 조정할 수 있는 기계적 특성 및 세포 접착 ligand 농도에 사용 될 수 있는 표현에 대 한 프로토콜을 제시. 우리 더 ELP hydrogels 내 셀 캡슐화에 대 한 방법론을 제시 하 고 다운스트림 분석 및 정량화에 대 한 셀을 포함의 후속 immunofluorescent 얼룩.

ELPs이이 프로토콜에 사용 되는 5 개 영역으로 구성: T7 태그, His6 태그, enterokinase (EK) 분열 사이트, 생체 활성 영역 및 엘라 스 틴 같은 지역 (그림 1). T7 His6 태그 표준 서쪽 오 점 기술을 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. EK 분열 사이트의 소개 태그 영역의 효소 제거 필요한 경우 수 있습니다. 바이오 액티브 지역 확장, fibronectin 파생 셀-접착제 ('RGDS') 또는 비-접착제 ('RDGS') 시퀀스를 인코딩합니다. 마지막으로, 엘라 스 틴 같은 영역의 중앙 반복 이용 잔류물 사이트 측면에 서 반복 포함 ~ 32 ° C31의 LCST를 달성 하기 위해 이소류신 THPC 통해 가교를 가능 하 게에서 lysine 그룹을 포함 합니다.
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그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 3D 세포 캡슐화를 위한 조정 가능한 하이드로겔로 사용하기 위해 재조합으로 파생된 엘라스틴 유사 단백질을 발현하고 정제하는 것입니다. 또한 이 프로토콜은 캡슐화된 세포의 컨포칼 현미경에서 다운스트림 형광 라벨링을 위한 방법론을 제시합니다. 이 방법은 3D에서 세포-세포외 기질 상호 작용의 역할을 이해하는 것과 같은 생체 재료, 재생 의학 및 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 여러 세포 유형 연구에 적합한 재현 가능하고 조정 가능한 모듈식 재료 플랫폼을 제공한다는 것입니다. 전반적으로 이 기술의 구현은 향후 세포 기반 재생 요법의 성공을 좌우할 수 있는 중요한 세포 ECM 신호 매개변수에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다. 암피실린(ampicillin)과 클로람페니콜(chloramphenicol) 한천 플레이트를 관심 있는 ELP를 암호화하는 벡터를 포함하는 미리 만들어진 박테리아 스톡으로 줄무늬를 만듭니다.그런 다음 줄무늬가 있는 플레이트를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 거꾸로 배양하여 박테리아가 성장할 수 있도록 합니다. 다음 날, 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 예열된 스타터 배양을 접종합니다. 섭씨 37도의 셰이커에서 16시간 동안 배양물을 배양합니다.배양 기간이 끝나면 혈청학 피펫을 사용하여 20ml의 스타터 배양액을 각 발현 플라스크로 옮깁니다. 플라스크 쉐이킹이라는 표현을 한 시간 동안 그대로 둡니다. 1시간 후, 발현 플라스크에서 600나노미터의 부분 표본에서 광학 밀도를 측정합니다.판독값이 0.6에 도달하자마자 셰이커의 온도를 섭씨 32도로 낮추십시오. 판독값이 0.8에 도달하면 1ml의 1몰 멸균 여과된 IPTG를 첨가하여 발현 플라스크에서 ELP 발현을 유도합니다. 7시간 동안 문화를 표현할 수 있습니다.7 시간 후에, 지면 원심 분리기에 있는 12, 000 x g에 4 섭씨 온도에 15 분 동안 표정 매체를 원심 분리하십시오. 원심분리 후 주걱을 사용하여 원심분리기 용기에서 세포 펠릿을 수집하고 미리 계량된 지퍼락 백에 넣습니다. 다음으로, 세포 펠릿을 멸균 여과된 TEN 완충액에 용해시킵니다.세포 펠릿을 마사지하여 균질한 용액을 형성합니다. 현탁액 세포 펠릿이 재활성화된 지퍼락 백을 섭씨 80도의 보조 용기에 동결합니다. 해동된 세포 펠릿에 세포 용해물 100ml당 약 30-40mg의 deoxyribonuclease와 100mm의 100mmmolar PMSF를 추가합니다.섭씨 4도의 용해물을 셰이커에서 밤새 배양합니다. 세 번째 동결-해동 주기에 따라 섭씨 4도에서 1시간 동안 샘플을 최소 15, 000 x g로 원심분리합니다. 원심분리 후 원심분리기 용기에서 상층액을 붓고 용액을 새 원심분리기 용기로 옮깁니다.상등액 100밀리리터마다 염화나트륨 5.84g을 3부로 추가하여 최종 1몰 농도를 얻습니다. 현탁액을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후, 섭씨 37도에서 1시간 동안 최소 15, 000 x g에서 샘플을 원심분리합니다.원심분리 후, 원심분리기 용기에서 상등액을 버리고 펠릿을 매스화합니다. 다음으로, 원심분리 후 얻은 펠릿 그램당 10밀리리터의 오토클레이브 초순수를 추가합니다. 단백질이 완전히 용해되도록 하려면 금속 주걱을 사용하여 펠릿을 으깨고 다시 현탁시킵니다.재부유한 펠릿을 섭씨 4도에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 배양합니다. ELP를 추가로 정제하기 위해 총 3회 동안 냉간 및 고온 원심분리 단계를 반복합니다. 다음으로, 3.5 킬로달톤 투석막의 잔류 상등액을 섭씨 4도의 예냉된 초순수 4리터에 3일 동안 다이얼화하여 단백질 용액을 탈염합니다.최종 투석 용액을 예냉된 원심분리기에서 원심분리합니다. 상등액을 섭씨 80도에서 미리 계량된 원뿔형 튜브에 얼립니다. 마지막으로, 냉동 용액을 3일 동안 동결 건조한 다음 최종 동결 건조 제품의 무게를 측정하여 단백질 수율을 결정합니다.생검 펀치를 사용하여 0.5mm 두께의 실리콘 시트에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 각 구멍 주위에 사각형을 자릅니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 개별 금형의 각 측면에 있는 플라스틱 랩을 제거합니다.플라스틱 랩을 제거한 후 핀셋을 사용하여 후속 플라즈마 본딩을 위해 동일한 수의 베어 실리콘 몰드와 유리 커버 슬립을 48웰 플레이트의 뚜껑에 교대로 배치하십시오. 모든 세포 배양 물질이 제조된 후 다운스트림 하이드로겔 캡슐화를 위한 관심 세포 유형의 준비가 시작될 수 있습니다. 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리한 후 원하는 수의 세포를 1.5ml 원심분리 튜브로 분취합니다.그런 다음 약 200 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다. 원심분리 후 상등액을 흡입하고 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. ELP 원액의 세포 펠렛을 최종 부피의 80%까지 재현탁합니다.그런 다음 피펫을 사용하여 용액을 ELP의 균질한 세포 현탁액에 혼합합니다. 나머지 20%의 최종 부피에 대해 THPC 원액을 셀 ELP 현탁액에 추가합니다. 기포의 형성을 피하면서 균질한 혼합물의 형성을 보장하기 위해 여러 번 피펫을 사용하십시오.다음으로, 원 운동으로 셀 ELP THPC 혼합물을 24웰 플레이트의 각 금형에 피펫팅합니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 섭씨 37도에서 추가로 15분 동안 샘플을 배양합니다.배양이 끝나면 750마이크로리터의 따뜻한 세포 배양 배지를 24웰 플레이트의 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 원하는 배양 기간 동안 하이드로겔을 섭씨 37도로 둡니다. 먼저 각 웰에서 매체를 흡인합니다.그런 다음 1ml의 따뜻한 DPBS로 우물을 씻으십시오. 세척이 완료된 후 각 웰에 750마이크로리터의 고정 용액을 추가합니다. 그런 다음 24웰 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다.배양 후, 각 우물에서 정착 용액을 흡인하고 고정액을 유해 폐기물 용기에 버립니다. 그런 다음 샘플에 DPBS 1ml를 추가하고 DPBS를 즉시 유해 폐기물 용기에 폐기합니다. 다음으로, 750마이크로리터의 투과화 용액을 추가하여 로커의 실온에서 분당 15회전으로 샘플을 1시간 동안 투과화합니다.1시간 후 투과화 용액을 흡입하고 샘플에 750마이크로리터의 차단 용액을 추가합니다. 샘플을 실온에서 3시간 동안 로커에 그대로 두십시오. 그런 다음 항체 희석 용액으로 원하는 1차 항체를 희석합니다.다음으로, 각 샘플에 500마이크로리터의 항체 용액을 추가합니다. 섭씨 4도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, 1차 항체 용액을 흡인한 다음 PBST로 샘플을 실온에서 분당 15회전으로 1시간 3회 세척합니다.다음으로, DAPI 원액 1밀리리터당 5밀리그램에 적절한 2차 항체를 희석하여 밀리리터당 2.5마이크로그램의 최종 농도를 달성합니다. 그런 다음 각 샘플에 500마이크로리터의 용액을 추가합니다. 다음으로, 알루미늄 호일을 사용하여 24웰 플레이트를 덮고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.다음 날, 2차 항체 용액을 흡인하고 PBST로 샘플을 로커에서 실온에서 30분 동안 각각 3회씩 세척합니다. 다음으로, 유리 슬라이드 표면에 하드셋 마운팅 매체 한 방울을 놓고 샘플을 장착 매체에 놓습니다. 마지막으로, 매니큐어를 사용하여 샘플을 유리 커버 슬라이드에 밀봉하여 오염이나 샘플 이동을 방지합니다.여기서, 통제된 조건에서 전체 길이 ELP를 가진 표적 단백질의 발현은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석 모두에서 37킬로달톤의 밴드의 존재에 의해 검증됩니다. 그러나 통제되지 않은 조건에서는 웨스턴 블롯을 사용하여 여러 저분자량 띠도 볼 수 있습니다. 저분자량 밴드는 엘라스틴 유사 도메인 반복이 4개 미만인 단백질에 해당하며, 이는 단백질이 발현 중에 완전히 번역되지 않았음을 나타냅니다.이 결과는 섭씨 32도 이상에서 표현식을 수행할 때 일반적입니다. 하이드로겔 기계적 특성을 일정하게 유지하면서 세포 접착 리간드 농도를 변경하기 위해 피브로넥틴 유래 세포 접착제를 포함하는 ELP 변이체와 비세포 접착제 서열의 비율을 조정합니다. 또한, 쥐 신경전구세포는 3% ELP 하이드로겔에 캡슐화되어 있을 때 7일 동안 생존할 수 있습니다.살아있는 세포는 calcein AM 염색으로 인해 녹색으로 식별되는 반면, 빨간색 ethidium homodimer는 죽은 세포에 의해 우선적으로 흡수됩니다. 신경전구세포의 줄기세포 표현형을 검증하기 위해 세포가 3D ELP 하이드로겔에 캡슐화될 때 Sox2 및 nestin과 같은 표준 마커의 발현도 면역염색을 통해 시각화됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 다양한 세포 유형의 다운스트림 캡슐화를 위해 엘라스틴 유사 단백질을 발현하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 또한 세포 표현형 조절에서 3D 미세환경의 역할을 조사할 수 있습니다.

production-elastin-like-protein-hydrogels-for-encapsulation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 합성 hydrogels 내에서 세포의 3 차원 (3D) 캡슐에 대한 프로토콜을 제시한다. 캡슐화 절차는 캡슐화된 세포의 행동을 평가하는 두 가지 일반적으로 사용되는 crosslinking의 방법 (마이클 타입뿐만 아니라 가벼운 - 시작 자유 라디칼 메커니즘),뿐만 아니라 기술의 번호를 설명합니다.

조직 공학을위한 3D Hydrogels에서 셀룰러 봉지

이 동영상은 3D 하이드로겔로 캡슐화된 세포를 면역 염색하는 기술을 보여줍니다. 신경전구세포를 포함하는 하이드로겔 배양액은 고정, 투과화 및 차단 용액으로 처리되어 비특이적 면역 염색을 방지합니다. 특정 단백질에 결합하기 위해 1차 항체 칵테일을 첨가한 다음 형광 표지된 2차 항체와 핵 염색을 추가합니다. 그런 다음 샘플을 슬라이드에 장착하고 컨포칼 현미경으로 관찰합니다.

3D 하이드로겔 시스템에 캡슐화된 세포의 면역염색

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

우리는 3차원 세포 배양 응용을 위한 합성 하이드로겔 매트릭스의 광 매개 형성 및 후속 생화학적 패터닝을 위한 순차적 프로세스를 설명합니다. 세포 적합성 photoclick chemistry를 가진 하이드로겔의 구성 및 변형이 입증되었습니다. 또한 패턴을 정량화 및 관찰하고 이러한 하이드로겔 내에서 세포 생존력을 결정할 수 있는 손쉬운 기술이 제시됩니다.

세포 배양 응용 프로그램에 대한 히드로 겔의 빛 매개 형성 및 패터닝

이 폐 세포 외 기질에서 3 차원 세포 배양 지지체를 제작하는 방법이다. 그대로 폐 세 차원 세포의 성장을 지원할 수있는 하이드로 겔로 처리된다.

3 차원 세포 배양을위한 폐 세포 외 매트릭스에서 조정 히드로 겔

단백질 기반 hydrogels 3 차원 구조를 조작 하는 다른 메서드 여기 소재 속성에 대해 계산 됩니다. 세포 접착 펩 티 드와 함께 macroporous 네트워크는 공업화 하 고 두 개의 서로 다른 모델 셀 라인을 사용 하 여 세포 배양에서 그들의 타당성을 평가.

셀 문화 응용 프로그램에 대 한 단백질 기반 Hydrogels 아키텍처의 쉬운 조작

이 프로토콜 cryogelation 기술로 제작을 통합 하 여 탄력 있는 3D macroporous microcryogels의 제작을 설명 합니다. 재생 치료를 촉진 하기 위하여 쉽게 주입된 비보 수 또는 생체 외에서 높은 처리량 마약 검사에 대 한 배열로 조립 셀 로딩 시 3D microtissues 생성 됩니다.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

여기는 키토 산 기반의 주 사용 hydrogels 동적 것 화학을 사용 하 여 손쉬운 준비에 설명 합니다. 하이드로 겔의 기계적 강도 및 3D 세포 배양에서의 응용 프로그램을 조정 하는 방법은 제시 하는.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 기사에서는 세포외 기질 경화 및 섬유아세포 활성화를 연구하기 위해 광조정 가능 하이드로겔을 3D 바이오프린팅하는 방법을 설명합니다.

섬유아세포 활성화를 연구하기 위한 3D 바이오프린팅 광조정 가능 하이드로겔

배우세요 재조합 엘라스틴 유사 단백질을 발현 및 정제하여 조절 가능한 하이드로겔을 제작하고 3D 세포 캡슐화 및 형광 면역염색을 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 세포 외기질 상호작용 연구에 활용됩니다.

캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산

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