Name: 신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 학습하세요 인간 위장 생검 조직에서 세포질과 핵 단백질을 분리하는 세포 분획법을. 신선 및 냉동 표본 모두에 적용 가능하며 단백질 정량화와 면역침전 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 비디오 녹화 및 편집을 위한 Ander 로페즈와 Miren Telletxea의 도움을 인정 합니다. ACR는 Ikerbasque 친교와 Asociación 드 Celiacos 마드리드 (ACM)에서 연구 프로젝트에 의해 자금이 다. JRB은 프로젝트 ISCIII/PI16에 의해 00258와 공동 투자에 의해 유럽 연합 ERDF/ESF "유럽을 벌기 위해 방법" 이다. 연구 프로젝트 그랜트 2015111068 바스크 보건의에 의해 자금이 다. IRG 및 AJM 각각 UPV/EHU와 바스크어 교육부에서 predoctoral 친교 교부 금에 의해 지원 됩니다.

이 연구는 Cruces 대학 병원 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 모든 과목 또는 그들의 부모 로부터 동의 가져온 후 분석 수행 했다.
1. 생 컬렉션
참고: 환자의 원심 십이지 장 생 검 표본 얻을 수 있습니다 일상적인 진단 내 시경 생 검 관리 동안 무게에 2, 10 밀리 그램 사이 범위. Biopsied 조직 상피, 면역과 내 피 세포를 포함 하 여 다른 세포 유형으로 구성 된 복잡 한 조직이 이다. 임상 소화기 전문 내과 내 시경을 수행 다음 임상 지침을 설립.
<ol><li>내 시경 후 생 검 살 균 필터 종이에 놓습니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여을 1.5 mL 튜브에 biopsies 전송, PBS, 담가 cryotube로.</li>
	<li>실험실에 도착할 때까지 얼음에 튜브를 유지.<ol>
<li>즉시 신선한 biopsies의 처리를 시작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 생 검, 플래시 동결 튜브를 포함 하는 생 검 및 사용까지 액체 질소에 저장. 참고: 그것은 차가운 보충된 버퍼 1 추가 될 때까지 냉동 샘플을 유지 하는 것이 중요입니다.</li>
</ol>2. 버퍼 준비
참고: 시작 하기 전에, 보충 버퍼 다음과 같습니다.
<ol><li>1mm DTT (최종 농도)를 추가 하 고 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물 칵테일 (최종 농도 x 1) 1 및 고 침투성 버퍼를 버퍼 2 (표 1).<ol>
<li>샘플 당 버퍼 2의 버퍼 1과 150 µ L의 1.5 mL를 준비 합니다. DTT는 샘플의 산화를 방지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미 보충된 버퍼 1 0.1%의 최종 농도를 1% 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)를 추가 하 여 핵 워시 버퍼를 준비 합니다. 샘플 당 핵 워시 버퍼의 1 mL를 준비 합니다.</li>
</ol>3. 생 검 균질
<ol><li>
신선한 생 검
	<ol>
<li>전동된 믹서에 일회용 유 봉을 배치 합니다. 유 봉 튜브의 아래쪽에 도달 하면 확인 하십시오.</li>
		<li>생 검는 cryotube에서 고 피 펫 팁 1.5 mL 튜브에.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 보충된 버퍼 1의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>조직을 완전히 중단 될 때까지 유 봉과 생 검을 균질 하 고 얼음에 그것을 유지.</li>
		<li>일단 모든 biopsies 무 균 4 단계 진행. 참고: 일회용 pestles biopsies 사이 변경 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
냉동된 생 검 주의: 처리 액체 질소 신중 하 게; 액체 질소는 피부와 눈의 접촉 냉동 중상이 발생할 수 있습니다. 액체 질소로 작업 하는 경우에 항상 손과 눈을 보호 합니다.<ol>
<li>Cryotubes 질소 탱크에서 검색을 저장 하는 상자에서 몇 가지 액체 질소를 가져가 라.</li>
		<li>질소 탱크에는 생을 찾아서는 cryotube 액체 질소와 함께 상자에 배치. 모든 생 검에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에는 cryotube에서 생 검을 전송. 참고: Biopsies 냉동된 관에 연결할 것입니다. 튜브에서 분리 됩니다 그래서 살 균 피 펫 팁 생을 밀어.</li>
		<li>보충된 버퍼 1의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>조직을 완전히 중단 될 때까지 유 봉과 박격포를 사용 하 여, 모든 절차를 걸쳐 4 ° C에 온도 유지 하는 조직 균질 참고: 버퍼를 추가 하기 전에 녹여 biopsies 못하게 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 세포질 절연
<ol><li>10 분 동안 얼음에 무 균된 생 검 품 어.</li>
	<li>각 샘플 0.05%의 최종 농도를 1% 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)의 10 µ L를 추가 합니다. 참고: 셀 팽창 하 고 온화한 세제 세포 막 중단 됩니다으로 삼투성 세포에 의해 버스트 것 이다.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>짧게 소용돌이 그리고 2 분 4 ˚C에서 400 x g에서 원심 분리기.</li>
	<li>Vortexing, 후에 상쾌한을 제거 하 고 새로운 깨끗 한 1.5 mL 튜브; 전송 이 세포질 분수 될 것입니다. 펠 릿을 버리지 마십시오.</li>
</ol>5. 핵 절연
<ol><li>핵 워시 버퍼의 200 µ L와 이전 단계에서 펠 릿 resuspend</li>
	<li>G와 4 ° C x 400에서 2 분 동안 관을 원심</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 두 번 더 세척 절차를 반복 합니다. 참고:은 세척 핵 분수에 세포질 오염을 제거 됩니다.</li>
	<li>3 세척 후 버퍼 2의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>흔들어 샘플 적극적으로 30 분에 대 한 4 ˚C에서 또는, 얼음과 소용돌이 매 5 분에 샘플을 품 어.</li>
	<li>떨고, 후 원심 최고 속도로 10 분에 대 한 샘플 (> 12000 g x)와 4 ° C</li>
	<li>Vortexing, 후에 상쾌한 새로운 깨끗 한 1.5로 전송 합니다. mL 튜브입니다. 이 핵 분수 될 것입니다.</li>
</ol>6. 단백질 정량화
참고: bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 키트 단백질 계량. 분수에 있는 단백질의 농도 0.5와 5 µ g / µ L, 핵 보다에서 더 낮은 것 사이 범위 것입니다 (2 밀리 그램 생 검에서 결과 단백질 농도 표 2 참조).
<ol><li>다음 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 금액 (µ g)12표준 곡선을 준비: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>샘플 당 최종 BCA 믹스의 100 µ L를 사용 하는 데 필요한 시 약을 준비 합니다.</li>
	<li>2 µ L 96 잘 접시에 각 단백질 분수의 플라스틱, BCA 믹스를 추가 하 고 독서에 대 한 제조업체의 지침을 따르십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜 장 검의 핵과 세포질 분별 법에 사용 됩니다. 순화 된 단백질 변성 하지 하 고 그림 2 와 3 만 immunoprecipitation, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA) 같은 네이티브 접힌 단백질을 필요로 하는 분석 실험에 또한 같이 서쪽 오 점 분석에 사용 될 수 있다 또는 네이티브 polyacrylamide 젤 전기 (페이지)
설명된 방법 삼 투 세포 세포 막 핵 막에 영향을 주지 않고 버스트 함께 조직의 기계적 균질에 의존 합니다. 다운스트림 분석에 사용할 세포질 및 핵 단백질의 깨끗 한 분별입니다. 그것은 단백질과 인산 가수분해 효소 억제제의 추가 의해 과정에서 단백질의 저하를 제어 해야 합니다. 또한, 추출 된 단백질 다운스트림 기능 분석에 사용 될 경우, 변성 및 샘플의 베이스를 피하기 위해 중요 하다 또한. 4 ° C에서 프로세스를 수행 해야 하...

단백질 세포 내의 거의 모든 생물 학적 기능에 참여 하 고 그들의 구조, 수량 또는 위치에 달라진 병원 성 시나리오를 발생할 수 있습니다. 조직 샘플 분류 메서드는 질병의 복잡성을 줄이기 위해 유용한 접근 관련 단백질 분석. 일부 연구 단백질 지역화 정보를 사용 하거나 특정 세포질 격실에서 단백질을 풍부 하 게 그대로 단백질의 재현 분별에 대 한 프로토콜은 특정 생물 학적 질문에 대답 하는 데 유용 합니다. 단백질의 subcellular 지 방화를 결정 하 고 그들의 compartmental 재배포 또는 기저에 상호 작용을 모니터링 질병 상태 질병을 식별 하는 데 도움이 됩니다 관련 기능 차이1,2. 따라서,이 방법은 reproducibly 장 조직 생 검, 두 신선 하 고 냉동, 세포질 및 핵 subcellular 구획으로 충분치를 목표로 합니다.
장 생 샘플 정기적으로 내 시경 절차3 (그림 1) 동안 얻은 고 단백질 정량화 또는 immunoprecipitation 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다. 이후 조직 샘플에서 장의 상피 질병 병 인4에 직접 관련 될 수 있습니다 단백질 포함 됩니다, 장 생 검 견본 장 질병 특정의 성공적인 식별에 대 한 매우 귀중 한 소스는 단백질입니다. 임상 정보와 함께 저장된 냉동, 환자의 조직 샘플 단백질 분석을 위한 유용한 리소스 이며 간단 하 고 재현성 샘플 준비의 제한 금액을 사용 하 여 셀 compartmental 정보를 제공 하는 중요 한 문제는 동결 조직5.
세포질 분수의 분리에 대 한 몇 가지 상용 키트 하지만 이들은 더 비싼 그리고 일반적으로 보다 더 많은 시간이 소요 여기에 제시 된 프로토콜. 여러 단계 그라데이션 원심 기반 프로토콜 및 지속적인 기온 변화도 또한 이전에 사용 된 다른 조직6,7에 다양 한 세포질 구획의 분류에 대 한 합니다. 그러나, 지속적인 기온 변화도의 일관성을 유지 하 종종 어려운 작업입니다. 세포 막의 순차적 용 해에 따라 비슷한 프로토콜 이전 설명 하지만 그들은 일반적으로 두 개 이상의 버퍼가 필요 이며 시간에 손을 더 이상8 .
조직 샘플을 위하여 때 명심 그 조직 샘플 존재-셀 및 셀-매트릭스 상호 작용 되는 둘 다 하지 경작된 한 세포에 중요 한 단백질 추출을 진행. 세포와 세포 외 기질 단백질 품질을 영향을 주지 않고 적절 한 고장 장 조직 단백질 격리9중요 한 요소 것입니다. 이 프로토콜에서-셀 및 셀-매트릭스 연락처가 먼저, 셀을 공개 하 고 개별 셀에 도달 하는 버퍼를 허용. 단백질 구획 분류 전에 혼합을 방지 하려면 연락처의 붕괴는 셀 이나 핵 막의 무결성을 변경 하지 않고 이루어져야 합니다.
10장 점 막 다양 한 프로 테아의 농축으로 추출 하는 동안 단백질 저하를 제어 하는 것이 중요입니다. 잠재적인 단백질 저하를 최소화 하기 위해 여러 프로 테아 제 억제 물 단백질 추출 버퍼에 포함 되어야 합니다. 또한, 추출 기능 분석에 사용 될 경우,이 단백질 활동11의 손실이 발생할 것 이다 단백질 또는 베이스의 변성을 피하기 위해 필수적입니다. 이 위해 프로토콜 4 ° C에서 수행 하 고 신선한 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 그냥 더 베이스를 억제 하기 위해 사용 하기 전에 0.1 m m의 최종 농도에 버퍼에 추가 됩니다.
세포 분별 법의 첫 번째 단계 조직 장애 이며 세포 세포의 용 해. 앞에서 설명 했 듯이, 셀과 휴식 그들 최소 손상으로 열을 세분화 하는 목표가입니다. 장 조직 샘플을 균질 해야 합니다, 그리고 셀 lysed 세포 막의 최대 파손을 달성 하기 위해. 이 프로토콜을 사용 하 여 자동화 한 유 봉 믹서 고속 vortexing 작업에 의하여 초 이내 무 균 장 조직 휴식. 균질, 후 조직 세포는 세포 막 버스트 것 이다 하지만 것입니다 핵 그대로 유지, 비 변성 시키기 세제 (nonyl phenoxypolyethoxylethanol)와 핵을 분리 하는 짧은 소용돌이의 추가 의해 따라 소형 버퍼에서 incubated 세포질 분수. 세포질의 제거 후 세포 핵 막 떨고와 마 버퍼에 버스트입니다.
여기에 제시 된 방법은 내 시경 절차와 범위 2 및 10 mg에 무게 동안 얻은 신선 하 고 냉동 장 biopsies의 subcellular 분별에 대 한 적절 한 방법입니다. 프로토콜은 간단 하 고 재현성 고 기본적인 실험실 장비 및 한 시간에 시 약을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>시그마 Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마 Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마 Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>단백질분해효소 및 인산가수분해효소 억제제</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>세제</td></tr><tr><td>BCA 분석</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>단백질 정량 키트</td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 유봉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce 균질기</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

이 프로토콜의 목적은 인간의 창 자 조직 특정 단백질 또는 다른 조직 (즉, 건강 한 상태에서 단백질 복합물의 지역화 분석에 대 한 핵 및 세포질 구획에 내 시경으로 얻은 충분치 대 질병)입니다. 이 메서드는 모두 신선 하 고 냉동 장 조직 샘플;의 분류 그것은 모든 실험실에 대 한 편리 하 고 시간이 소요입니다.

그림 1 에서는 그대로 villi와 토 굴 구조는 장 생 섹션의 얼룩이 지는 hematoxylin 오신.
이 프로토콜을 사용 하 여 핵과 세포질 분별 법의 대표적인 결과 그림 2 와 3에 나와 있습니다. 신선한 (Fh), 냉동된 (Fz), 그림 2에 표시 된 실험에서 생 검 했다 동시에 분류 한 다음 여기에 제시 된 프로토콜 그리고 서쪽 오 점 각 샘플의 20 μ g를 사용 하 여 수행 되었다. 각 분수와 생 검에 단백질 농도 표 2에 표시 되 고 단백질 농도 매우 신선한 냉동된 조직 사이 다른. 2 mg biopsies에서 추출한 단백질의 수익률은 주위 3-4 µ g...

여기, 우리는 인간의 신선 하 고 냉동 장 biopsies에 세포질 및 핵 단백질의 subcellular 분리에 대 한 간단한 세포 분별 법을 수행 하는 프로토콜을 제시.

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

다음 프로토콜의 목표는 냉동 또는 신선한 위장 표본에서 세포 내 분획을 생성하는 것입니다. 단백질은 세포 내에서 거의 모든 생물학적 기능에 참여합니다. 어떤 변형이든, 그들은 위치 사이에서 추출되어 병원성 시나리오로 이어질 수 있습니다.일부 연구에서는 단백질 국소화 평가를 활용하거나 특정 세포 구획에서 단백질을 침입해야 합니다. 따라서 온전한 단백질의 재현 가능한 분획은 이 점에서 중요합니다. 장 생검 샘플은 최근 내시경 검사 중에 얻을 수 있으며 단백질 정량화 또는 면역 침전 연구에 효과적으로 사용할 수 있습니다.임상 장 샘플은 조직 및 질병 특이적 단백질을 효과적으로 식별하기 위한 중요한 자원입니다. 이 방법의 이름은 특정 단백질 또는 단백질 복합체의 국소화 분석을 위해 내시경 검사로 얻은 인체 장 조직을 핵 및 세포질 구획으로 분획하는 것입니다. 이 방법은 둘 다의 분별 역할을 합니다.첫째, 얼어붙은 장 생합성이 발생합니다. 냉동 조직 절차의 경우 추출 직후 샘플을 동결하고 사용할 때까지 액체 질소에 보관하십시오. 저온 균질화 완충액이 추가될 때까지 샘플을 동결 상태로 유지하는 것이 중요합니다.신선한 검체의 경우 생검을 1.5mL 마이크로튜브로 옮기고 절차가 시작될 때까지 얼음에 보관합니다. 냉동 조직 샘플은 일반적으로 cryotube의 벽에 부착되며, 조직은 원뿔형 1.5mL 마이크로튜브로 옮기기 전에 멸균 피펫 팁을 사용하여 분리할 수 있습니다. DDT와 포스파타제 및 프로테아제 억제제가 보충된 완충액 200mL를 샘플이 들어 있는 마이크로튜브에 추가합니다.조직이 완전히 파괴될 때까지 샘플을 용기로 균질화하고 얼음 위에 보관합니다. 얼음 위에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 세포막을 파괴하기 위해 각 샘플에 1% 세제 10mL를 최종 농도 0.05%로 추가합니다.얼음 위에서 5분 동안 배양합니다. 간단히 와류를 일으킨 후 400g에서 4도에서 2분간 원심분리합니다. 세포질 단백질 분획을 포함하는 상등액을 제거하고 깨끗한 튜브에 옮깁니다.펠릿을 버리지 마십시오. DDT와 포스파타제 및 프로테아제 억제제가 보충된 200mL의 완충액에 펠렛을 다시 현탁시킵니다. 400g에서 2분간 원심분리기를 사용합니다.상층액을 버리고 세척 절차를 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척 후 펠릿을 100mL의 버퍼 2에 다시 현탁시킵니다. 4도에서 30분 동안 세게 흔듭니다.4도에서 최고 속도로 10분 동안 원심분리기를 사

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

신선 및 냉동 위장 표본의 세포 내 분획(Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens)

현미경 coverslips에서 포유 동물 세포의 현장 subcellular 분별 (분리)에서 단백질 지방화의 시각이 있습니다.

자기편 및 비 점착 성의 포유 동물 세포의 현장 Subcellular 분별 (분리)에서

이 비디오는 신선 동결 신경교종 조직에서 단핵을 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 분리된 단핵은 중추 신경 조직의 신경교종에서 관찰된 종양 간 및 종양 내 이질성에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 snRNA(single-nuclei RNA) 염기서열 분석 및 snATAC(Single-nuclei Assay for Transposase-Accessible Chromatin) 염기서열 분석과 같은 염기서열 분석 기술의 검체로 사용할 수 있습니다.

신선 냉동 신경교종 조직에서 핵 분리: 신경교종 종양 샘플에서 온전한 핵을 얻는 방법

여기에서는 기저에 있는 크립트 베이스 세포에서 공간적으로 구별되는 쥐 결장 상피 표면 세포를 분리하는 간단한 방법을 설명합니다.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

여기에서는 MF 표현형을 가진 동결된 위, 소장 및 결장 조직 생성 세포에서 1차 섬유아세포/근섬유아세포(MF) 배양을 분리하고 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 세포는 CD90, α-SMA 및 비멘틴을 발현합니다. MF는 효소 활성 및 사이토카인 생산을 포함한 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리

이 프로토콜의 목표에서 고정, 갓 절제 인간의 창 자 조직 레이저 캡처 기정 (LCM)를 사용 하 여 격리 장 중추에서 높은 무결성 RNA 샘플을 얻을 것입니다. 이 프로토콜 포함 플래시-냉동 인간 창 자 조직, cryosectioning, ethanolic 얼룩 및 탈수, LCM, 샘플 준비 및 RNA 추출.

신선한 냉동 인간 조직에서 장의 중추의 격리에 대 한 레이저 캡처 서의 최적화

여기, 선물이 원형질 막, 세포질 및 고속 원심 분리의 사용 없이 U937 세포의 미토 콘 드리 아를 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 정화 subcellular 분수 immunoblotting 통해 단백질 지역화의 후속 검사에 대 한 사용할 수 있습니다.

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

이 프로토콜은 DNA 손상을 평가하기 위해 혜성 분석실험에 사용하기 위해 부검 시 고품질 냉동 조직 샘플을 준비하기 위한 몇 가지 절차를 설명합니다: 1) 다진 조직, 2) 위장관에서 긁힌 상피 세포, 3) 큐브 조직 조직 다진 장치를 사용하여 균질화를 요구하는 샘플.

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

종양 내 이질성은 진모를 포함한 종양의 내재된 특징입니다. 우리는 단일 핵 RNA 및 ATAC 염기서열 분석 연구를 위한 신선한 동결 신경교종 조직에서 단 하나 핵을 격리하기 위하여 완충과 그라데이션 원심분리의 조합을 이용하는 간단하고 효율적인 프로토콜을 개발했습니다.

단일 핵 RNA-seq 및 ATAC-seq를 위한 신선한 냉동 뇌 종양에서 핵 절연

이 분획 프로토콜을 통해 연구자들은 포유류 세포에서 세포질, 핵, 미토콘드리아 및 막 단백질을 분리 할 수 있습니다. 후자의 2 개의 세포 내 분획은 isopycnic 밀도 구배를 통해 추가로 정제됩니다.

아이소피크닉 밀도 구배 정제에 의한 U937 세포의 세포 분획

이 프로토콜은 조직 해리 조건, 단일 세포 현탁액의 동결 보존 및 분리된 핵 평가에 대한 권장 사항을 포함하여 10x Genomics 플랫폼을 사용하여 다중 종양 시퀀싱을 위해 고형 종양 검체에서 핵을 분리하는 데 신뢰할 수 있고 최적화된 접근 방식을 제공합니다.

Multiome Sequencing을 위한 신선 및 냉동 고형 종양 검체에서 최적화된 핵 분리

우리는 장 조작을 통해 생성된 수술 후 장폐색의 쥐 모델을 설명합니다. 위장 통과 기능, 병리학적 변화 및 면역 세포 활성화는 수술 후 24시간 후에 평가되었습니다.

수술 후 장폐색 쥐 모델

학습하세요 인간 위장 생검 조직에서 세포질과 핵 단백질을 분리하는 세포 분획법을. 신선 및 냉동 표본 모두에 적용 가능하며 단백질 정량화와 면역침전 연구에 활용됩니다.

신선 하 고 냉동 위장 표본에서 subcellular 분류

더 많은 동영상 탐색