Name: Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 생체 내 마우스 전지에서 복합 근육 활동 전위(CMAP) 측정법으로 말초 신경의 축삭 퇴행 및 탈수초화를 조기에 감지하는 방법입니다. 이 기술은 반복 측정이 가능한 최소 침습적 접근법으로 신경 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 구 루벤에 의해 지원 되었습니다 ('여는 미래'와 C1), 과학 연구 플랑드르 (FWO-삼기엔), 티에리 Latran 재단 협회 안테나 contre 레 Maladies 신경-Musculaires (ABMM), 근 위축 증에 대 한 기금 협회 (MDA)는 ALS 협회와 ALS 리가 (벨기에). PVD는 FWO 삼기엔의 수석 investigatorship 보유 하고있다. RP 중앙 치료 클리닉 (CRC) 아일랜드에서 교부 금에 의해 지원 되었다와 현재 지원 되는 FWO 아일랜드 (누이)의 국가 대학.

모든 동물 표준 조건 하에서 지침에 따라 구 루벤-의 루벤 대학 및 관련된 유럽 지침 (유럽 연합 지침 2010/63/EU 동물 실험에 대 한) 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험 구 루벤의 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 동물 준비와 마 취
<ol><li>마우스 isoflurane/산소 흡입으로 마 취를 유도. 마 취의 유도 isoflurane의 4%와 2-3%를 사용 하 여 산소의 2.5 L/min 흐름에서 유지 보수에 대 한. 즉,마우스의 상태에 따라 마 취의 유지 보수에 대 한 isoflurane 비율 조정, 작고 약한 쥐 덜 마 취약을 필요로 합니다. 고통 철수 반사의 부재를 확인 하는 패드를 걷고 hindlimb에 가벼운 압력을 적용 하 여 적절 한 마 취 예를 들어, 확인 합니다.</li>
	<li>마 취 동안 체온의 감소를 방지 하기 위해 37 ° C에서 온도 조절 난방 격판덮개를 사용 하 여 마우스 몸 온도 제어 합니다.</li>
	<li>마 취의 유지 보수를 위해 nosecone와 마우스에 맞게. 동물은 nosecone 기도 차단 하지 않습니다 및 동물 꾸준히 호흡을 확인 하 여 산소의 충분 한 공급을가지고 있는지 확인.</li>
	<li>녹음을 하는 동안 마우스 충분히 호흡 속도 (마 취에서 약 1 Hz)와 가벼운 압력에 철수 반사의 부재를 관찰에 의해 마 취 여부를 모니터링 합니다. 마 취가 충분히 깊은 경우 수동으로 isoflurane 농도 증가.</li>
	<li>측정 후 복구 난방 격판덮개에는 적외선 램프의 온 정에서 sternal recumbency, 약 2-5 분을 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지 마우스를 둡니다. 두지 마십시오 마우스 무인과 다른 생쥐의 회사에서 그것은 완전히 마 취에서 복구 될 때까지.</li>
</ol>2. 뒷 다리와 앞 발에 CMAP의 측정
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg"> 그림 1입니다. CMAP 측정을 위한 전극의 위치. 전극의 위치는 뒷 다리-(A) 및 (B)의 앞 발에 대 한 제공 됩니다. 전극 다음과 같이 열거 된다: 1: 양극과 2: 음극 자극 전극, 3: 활성 기록 전극, 4: 참조 전극 및 5: 접지 전극. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol><li>27 G 바늘 전극을 사용 하 여 hindlimb 및 forelimb CMAP 측정. 관광지의 전극 위치 그림 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>전극 배치는 hindlimb에 다음과 같습니다.<ol>
<li>경향이 위치에서 생리대에 마우스를 놓습니다. 무릎에 hindlimb를 확장 하 고 접착 테이프 (그림 1A)를 사용 하 여 작업 표면에 발을 첨부.</li>
		<li>약 2 cm의 거리와 좌 골 노치의 양쪽에 피하 자극 전극 배치 (1 = 양극 및 2 = 음극) 전극 사이. 기본 근육 puncturing 없이 피부와 푸시 피부 아래 바늘의 약 5 m m 통해 수직으로 바늘을 삽입 하려면 피부를 들어올립니다.</li>
		<li>마찬가지로, 피하 gastrocnemius 근육 정렬 기록 전극 (3) 장소. 30도 각도에서 아 킬 레 스 힘 줄 옆 피하 참조 전극 (4)를 삽입 하 고 피부 아래 바늘의 2-5 m m를 두고. 비슷한 방식으로 자극 전극, 피하는 마우스 측면 접지 전극 (5) 배치 하지만이 전극의 위치 측정에 대 한 중요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음과 같이 앞 발에 전극 배치 합니다.<ol>
<li>부정사 위치 및 몸 (그림 1B)의 측면에 두 앞 발을 확장 하는 사용 접착 테이프에 생리대에 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>자극 전극 배치 (1 양극 2 = = 음극) 상 완 총 신경으로 forelimb의 양쪽에 피하. 기본 근육 puncturing 없이 피부와 푸시 피부 아래 바늘의 약 5 m m 통해 수직으로 바늘을 삽입 하려면 피부를 들어올립니다.</li>
		<li>피부를 들어올려이 두 근 brachii 근육 위에 피하 기록 전극 (3)를 배치 합니다. 30도 각도로 3 m m 깊이에서 걷는 패드에 참조 전극 (4)를 놓으십시오. 접지 전극 (5) 피하는 마우스 측면에 놓습니다. 참고: 전극이이 설정에서 서로 가까이에 있습니다. 이 기록을 왜곡으로 서로 감동에서 전극을 방지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 데이터 수집
<ol><li>컨트롤러 단위에서 재발 자극 버튼을 눌러 자극을 시작 하 고 증가 자극의 강도 컨트롤러 노브. 1 펄스/s 0.1 ms 자극 기간을 사용 하 여 모든 축 삭 자극. 소프트웨어에 드롭다운 메뉴에서 올바른 주파수 및 기간을 선택 합니다.</li>
	<li>Supramaximal 자극에 도달 (5-20 mA; demyelinating에 조건 최대 60 mA), 증가 자극 CMAP 응답의 진폭을 증가 중단 때까지 강도 컨트롤러 노브를 설정 하 여 적용. 거기에서 CMAP 진폭 그것의 극대 응답에 도달 했습니다 수 있도록 20% 자극 증가 추가. 끝 재발 자극 버튼을 다시 누르면 자극.</li>
	<li>녹음에 다음 사항을 나타내는 표식 도구를 사용 하 여: 자극, 응답, 최대 긍정적인 최대 및 최대 부정적인 피크 (그림 2)의 개시의 개시.</li>
	<li>(그림 2) 응답의 개시에 자극의 개시에서 지연으로는 대기 시간 (밀리초)을 결정 합니다. 진폭 증가 하기 시작 하는 초기 점으로 응답의 개시를 정의 합니다. 대기 시간을 사용 하 여 축 삭에 있는 demyelination 평가.</li>
	<li>최대 긍정적인 피크 (그림 2) 최대 부정에서 진폭 (mV)를 측정 합니다. 진폭의 크기를 사용 하 여 기능 축 삭의 수 상관.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg"> 그림 2입니다. CMAP 응답의 대표 이미지. 설명 CMAP 응답 진폭 및 대기 (A) 시간 계산에 사용 하는 포인트를 나타내는. 대기 시간 CMAP 응답의 발병에 자극에서 지연에 의해 결정 됩니다. 피크 대 피크 진폭에 복 형 파의 최대 긍정적인 피크 최대 부정에서 측정 됩니다. 건강 한 비-유전자 변형 동물 (B) 및 장시간된 대기 시간 및 감소 된 진폭 (C)와 병에 걸린 동물의 대표 기록. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="6"><li>전극의 정확한 배치 기록의 결과 값에 영향을 미칠 수 있습니다, 이후 전극 교체와 같은 신경 세 번 측정 supramaximal 자극을 사용 하 여 큰 반응을 얻을 수 있도록. 기록의 평균을 사용 합니다.</li>
</ol>

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<li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport%3A+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

중요 한 기록 방법을 질병의 진행과 특히 신경 질환의 동물 모델에서 치료의 효능을 평가 하기 위한 필수적입니다. Cmap을 결정 하는 것은 일상적으로 사용 클리닉에서 및 실험 설정에 neuropathic 신경 근육 학 장애3,18에 신경 전도 평가 하는 최소 침 습 electrophysiological 기술입니다. 여기, 우리는 CMAP forelimb의 상 완 신경 총 신경의 신경 전도 측정 하기 위하여 쥐에 기록에 대 한 새로운 응용 프로그램을 설명 합니다. 제시 방법 마우스 모델을 neurodegeneration의 신경 기능을 더 다양 하 고 상세한 경도 평가 있습니다.
바늘 전극 반지 전극 보다 약간 더 침략 적 이며 경도 연구에서 특히 주의 해야 한다 조직 피해를 최소화 하기 위해. 방법의 1 개의 가능한 결점은 신경이 나 근육을 피어 싱에서 결과 부상이 다. 그러나, 전극의 주의 피하 배치, 후 부상 및 근육과 신경의 막을 수 있습니다. 대조적으로, 반지 전극을 사용 하 여 메서드 여기에 제시 된 방법에서는 신체의 큰 부분에서 모피의 면도 필요 하지 않습니다. 결과적으로, 아무 불편 또는 동물에 대 한 체온 조절에 효과 있다.
전극의 위치는 CMAP 진폭 및 대기의 정확 하 고 일관 된 기록에 대 한 중요 하다. 그것은 전극 위치를 변경 하 고 최대한 자극을 확인 하는 각 사이트에서 2 ~ 3 측정을 수행 하는 것이 좋습니다 그리고 응답 달성 된다. 정확한 녹음 복 형 곡선 그림 2에서 같이 생산 한다. 방법 표준화, 신경 손상 없이 비-유전자 변형 쥐 적절 하 고 일관 된 전극 최적의 자극에 대 한 위치를 설정 하려면 최고의 모델은. 재사용 가능한 바늘 전극 반복된 사용을 위해 적당 한 그들은 정기적으로 살 균 된다, 예를 들어 동물, 20 분에 대 한 글을 하는 경우 그리고 선명도 대 한 검사.
건강 한 성인 쥐에 제시 방법으로 기록 하는 CMAP 진폭은 일반적으로 좌 골 신경 및 상 완 신경 총 자극 후 80-100 mV. 이 20-40 mV8,,1920의 결과 생산 하는 반지 전극에 대 한 피부에 의해 발생 하는 높은 임피던스 때문에 특히 반지 전극으로 측정 응답 보다 큽니다. ALS 마우스 모델에서 좌 골 신경 또는 상 완 신경 총 마비 사지에 자극 후 CMAP 진폭 10-30 mV 감소. CMAP 진폭의 크기는 CMAP 진폭 개발21동안 증가 때문에 젊은 동물에 더 작다.
우리가 여기에 설명 하는 메서드는 ALS, denervation, 그리고 후속 모터 적자, 앞 발13보다 hindlimbs에서 이전 발생의 마우스 모델에 특히 유용 합니다. Denervation, 뿐만 아니라 메서드는 CMAP 진폭에 방해 또는 저 능 아 거부로 결정 되는 reinnervation를 검출할 수 있었다. 추가 질병 진행;의 후속을 방해 하는 증상 발병의 나이에 이미는 hindlimbs의 근육에 CMAP 진폭에 있는 극적인 감소 CMAP 진폭 질병의 초기 단계에 매우 낮은 값을 도달, 질병 과정에서 더 감소 하지 않습니다 그들은. 반면, axonal 손실 상 완 신경 총 신경의 앞 발에 더 느린 걸음에 진행 하 고 질병의 더 긴 기간 동안 질병 진행을 측정 하기 위한 더 민감한 옵션을 선물 한다. 또한, 덜 퇴 화 앞 발 axonal 기능 향상을 목표로 하는 치료 접근을 평가 하기 위한 더 유력한 사이트를 제공할 수 있습니다.
그것은 분명 그 제시 기법 제공 소설 마우스의 특성에 대 한 신경 근육 학 장애의 모델입니다. 좌 골 신경 및 상 완 신경 총에서 바늘 전극 가진 CMAP 녹음 axonal 손실을 평가 하 고 뒷 다리-또한 앞 발 처럼 demyelination를 신속 하 고 재현할 수 방법입니다. 주목할 만한 모터 적자 기록 될 수, 따라서 이러한 결함의 초기 정량화를 허용 하기 전에 방법의 감도 axonal 적자도 있습니다. 또한, 반복 테스트의 가능성 필요한 동물의 수를 감소 하 고 개별 동물에 다른 사이트에서 신경 근육 학 및 neuropathic 질병의 진행에 대 한 자세한 개요를 제공 합니다.

전기 생리학 등 모터 신경 장애, plexopathies, neuropathies, 신경 근육 접합 질환 myopathies 신경 근육 학 장애에서 진단 도구로 사용 됩니다. 루 경화 증 (ALS), 모터 신경에 주로 영향을 받습니다에 axonal 손상과 근육 마비1 에 반영 됩니다 감소 CMAP 진폭 신경 유도 학문 (NCS)에. Charcot Marie이 질병 (CMT) axonal 변성 및 demyelination NCS2를 사용 하 여 주변 신경에서 추정 될 수 있습니다. 이 기술은 질병 진행3,4평가로 확인 진단 뿐만 사용할 수 있습니다. NCS는 활동 전위의 진폭5의 크기에서 추론, axonal 병리학의 평가 및 demyelination-감소 전도 속도에 결과의 범위 연장 원심 대기 시간, 또는 유도 블록 6.
CMAP 측정 모두 인간과 쥐에서 신경 전도 평가 하는 신속 하 고 중요 한 방법입니다. 반면 환자는 NCS 수행 정기적으로 다른 신경 및 근육, 마우스에 기록 하는 다양 한 사이트에서 CMAP 측정은 일반적으로 hindlimbs에 신경 기능을 평가 하기 위해 좌 골 신경에 대해서만 수행 됩니다. 그러나, 몇몇 동물 연구에서 것 기록에서 앞-hindlimbs, CMAP 예를 들어 앞-와 ALS 마우스 모델에서 hindlimbs 사이 차동 질병의 진행에 따라.
여기, 바늘 전극을 사용 하 여 쥐의 앞 발에서 Cmap을 기록 하는 방법을 소개 합니다. 또한, 우리는 Cmap 바늘 전극과 마찬가지로 hindlimbs에서 측정 하는 방법을 제공 합니다. 반지 전극과 hindlimbs에서 Cmap의 측정 이전7,8발표 되었습니다. Cmap 바늘 전극을 사용 하 여 녹음 빠른 측정 방법, 그것의 모피, 면도 필요 하지 않습니다 이며 뒷 다리-와 앞 발을 측정 하기 위한 절차는 숙련 된 연구원에 대 한 동물 당 불과 10 분 걸립니다. 또한,이 최소한 침략 적 접근은 동물에서의 여러 신경 경도 후속 수 있도록 반복 측정 가능 합니다.

<table><tbody><tr><td>Resuable 피하 바늘 전극, Pl / Ir</td><td>Technomed</td><td>TE / S61-434</td><td>바늘은 길이 13mm (0.51 인치), 직경 0.4mm (27G)</td></tr><tr><td>Natus 전기 진단 시스템</td><td>Natus 신경학</td><td>UltraPro S100</td><td>EMG 장치</td></tr><tr><td>시너지</td><td>Natus 신경학</td><td>버전 20.1.0.100</td><td>UltraPro S100</td></tr><tr><td>Physitem 컨트롤러</td> 용 EMG 소프트웨어 <td>Rothacher-Medical GmbH</td>의<td>TCAT-2LV</td><td>가열 패드</td></tr><tr><td>콤비 벳 기본 마취 시스템 디지털 유량계 TEC 3 기화</td><td>Rothacher & 파트너</td><td>CV 30-301-D</td><td>Isoflurane 기화기 및 유량계</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000 mg/g&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare UK Limited</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>SOD1-G93A 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#002726</td><td>ALS tg 및 non-tg control littermates, only female</td></tr><tr><td>PrP-hFUS-WT3 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#017916&nbsp;</td><td>ALS tg 및 non-tg 대조군 새끼, 모든 그룹은 수컷과 암컷으로 균형을 이룹니다.</td></tr><tr><td>C57BL/6Jax 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Non-tg 마우스, 남성 및 여성</td></tr><tr><td>C61-PMP22</td><td>마우스 마우스 라인은 M. Sereda 교수 (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, G&ouml; ttingen, Germany).</td><td></td><td>CMT tg 및 non-tg 대조군 새끼, 모든 그룹은 수컷과 암컷으로 균형을 이룹니다.</td></tr></tbody></table>

vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

신경 축 삭의 기능을 평가 신경 근육 학 질환의 진행에 자세한 정보를 제공 합니다. Electrophysiological 녹음 인간과 설치류 모델에서 신경 전도 측정 하는 중요 한 접근 방식을 제공 합니다. 쥐에 전도 대 한 기술적 가능성을 확대, 복합 근육 활동 전위 (Cmap) 바늘 전극을 사용 하 여 forelimb에 상 완 총 신경에서의 측정은 여기 설명 합니다. Hindlimbs에서 좌 골 신경 자극 후 CMAP 녹음 이전 설명 되었습니다. 새로 도입된 된 방법 여기 추가 사이트에서 신경 전도도의 평가 가능 하며 따라서 신경 근육 기능에 대 한 더 깊은 개요를 제공 합니다. 기술 기능 축 삭의 상대 번호와 myelination 수준 모두에 대 한 정보를 제공합니다. 따라서,이 방법은 axonal 질병 뿐만 아니라 demyelinating 조건 평가에 적용할 수 있습니다. 이 최소 침 습 방법 신경의 추출 필요 하지 않습니다 이며 따라서 같은 동물에 경도 후속에 대 한 반복된 측정에 적합. 비슷한 기록 방법의 변환 관련성을 강조 하기 위해 임상 설정에서 수행 됩니다.

Cmap 바늘 전극을 사용 하 여의 electrophysiological 측정 시간이 지남에 신경 근육 기능에 따라 최소한 침략 적 하 고 매우 민감한 방법입니다. 설명 하는 기술은 여기 쥐, forelimb 신경 전도의 평가 허용 하 고 따라서 신경의 기능에 대 한 통찰력을 제공 합니다.
CMAP 진폭 및 대기 시간 측정 뒷 다리와 앞 발에서 ALS, SOD1 G93A9 와 PrP-hFUS-WT310 (그림 3)의 두 개의 마우스 모델에서 CMT, C61 PMP2211,12의 마우스 모델에서 질병 과정 (그림 4). ALS 마우스 모델 ALS 관련 인간 유전자, 즉 중 돌연변이 SOD1 또는 야생 타입 FUS의 overexpression에 의해 창조 되었다. 두 모델 마우스 개발 ALS 마비에 지도 진보적인 모터 신경 퇴보를 닮은. 비-유전자 변형 littermate 컨트롤에서 뒷 다리-와 앞 발 CMAP 진폭 (그림 3A) 동안 변화 하지 않았다. 다른 한편으로는 hindlimb에서 좌 골 신경의 CMAP 진폭 극적으로 감소 했다 60 일의 나이 주위 증상 발병 전에 SOD1 G93A 쥐에 (반면 첫번째 모터 증 후는 일반적으로 3 개월의 나이에 관찰)13 . 진폭은 90 mV 유전자 변형 비 (비-tg) littermates에 그 나이에 반면 SOD1 G93A 쥐에 그것만 30 mV. 있었습니다만 최소한의 추가 하락 진폭에서 질병 진행 증상 단계 150 일의 나이에. CMAP 진폭에 있는 감소 및 따라서 축 삭의 퇴보는 hindlimbs에서 좌 골 신경에 비해 앞 발의 상 완 총 신경에 연기 되었다. 앞 발에 질병의 진행은 또한는 CMAP로 더 눈에 띄는 진폭 감소 70에서 30 mV mV이이 쥐에 모터 적자의 전후 측정 될 때.
ALS의 PrP-hFUS-WT3 마우스 모델에서 모터 적자의 발병 시작 약 28 일 세10, CMAP 진폭에 있는 감소의 개시와 일치 합니다. 이것은 더 가속된 질병 모델 생쥐 약 65 일의 나이에 말기 도달입니다. CMAP 진폭에 있는 감소 (그림 3D) hindlimbs에는 이전 axonal 변성을 나타내는 forelimb에 상 완 총 신경에 비해 hindlimb의 좌 골 신경에 더 급속 하 게 발생 했습니다. 이 관찰에서 hindlimbs 특히 이전 질병 과정의 후반 단계까지 기능적 남아 있는 앞 발 보다 마비 모두 이러한 마우스 모델에서 임상 관찰을 지원 합니다.
일반적으로, 활동 전위의 개시에 자극에서 대기 시간이 짧은 hindlimbs (그림 3B, E)에 비해 앞 발에 했다. 이것은 단순히는 자극 및 기록 전극 사이의 짧은 거리입니다. 대기 시간 축 삭의 myelination 레벨의 표시를 제공합니다. 우리의 관측은 ALS의 마우스 모델에서 질병의 진행 동안 CMAP 대기 시간 장기화는 ALS demyelinating 질병 아니다. 빨리 모터 축 삭을 실시,의 손실로 인해 가장 높습니다.
인간의 PMP22의 3-4 부 overexpressing C61 PMP22 마우스와 heterozygote 마우스는 아주 약한 CMT1A 질병 표현 형 가벼운 demyelination와 감소 Cmap, 하지만 아무 표시 형11,12정리. 세 C61 PMP22 쥐의 1.5-2 년에서 CMAP 진폭은 감소 하 고 대기 시간 연장 모두 hindlimbs에 앞 발 (그림 4). 저하 진폭 및 건강 한 주제에서 기록에 비해 지연 된 응답을 표시 하는 대표적인 녹음 그림 2CB, 각각 표시 됩니다. 앞 발에 CMAP 대기 시간으로 뒷 다리 사지에에서 적용 되지 않습니다. 이것은 더 자주 환자에 있는 심각한 감소 또는 탐지 Cmap 길이 종속 장애14CMT의 병 태 생리 특성상 낮은 사지로 CMT1A 환자와 일치. 또한, 질병 엄격의 정도 axonal 무결성14,15정도 연관 진폭으로 CMAP 진폭 보다는 대기 시간이 나 전도 속도와 상관 된다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드는 검색 demyelinating CMT1A에서 관찰 한 것과 같은 과정을 충분히 중요 한 결과 나타냅니다.
진폭 및 대기 시간에 변화 했다 유전자 변형 비 그룹에서 가장 낮은 (계수 변화 2-15%, 1-13%, 각각). 모든 유전자 변형 경우에 가장 가능성이 있는 동물 중 질병의 진행에 차이 의해 발생 (계수 변형 진폭 8-51% 및 대기 시간 1-21%), 측정에서 더 많은 유사가 했다. 모든 경우에, 변화는 뒷 다리와 앞 발에 유사 했다. 바늘과 표면 전극의 사용에 있는 변이 비슷한16수 보고 되었습니다.
필요한 자극 강도 아닌 유전자 변형 사이 크게 다양 하지 않았다 및 ALS 모델 (그림 3C, F). 마찬가지로, 이러한 경우 supramaximal 자극을 도달 필요한 자극 물 및 hindlimbs에 대 한 유사 했다와 5-12 mA 사이 다양 한. CMT에서 증가 자극 강도 대 한 요구 사항이 인식된17 되었으며 동일한 표현 형 C61 PMP22 생쥐 (그림 4C)에서 보였다. 현상은 hypertrophic endoneurial 변경17에서 증가 전기 임피던스에 의해 설명 되었다.
확인 하 고 앞 발에서 기록 하는 CMAP 진폭 신경 자극 및 하지 근육 자극 했다, 우리 5 개월 된 비-유전자 변형 C57BL/6Jax 마우스 (남성과 여성) ( 에서에서 상 완 총 신경에 일방적인 부분 axotomy를 수행 그림 5). Axotomy 90에서 CMAP 진폭 감소 20 mV 뮤직 비디오, 축 삭의 대부분 작업에서 분리 했다 나타내는. hindlimbs 또는 contralateral forelimb에 진폭에 아무런 변화가 없었다. 이 결과 강하게이 두 근 brachii에 검색 응답 신경 자극 때문 이었다 고 근육 자극에서 발생 하지 않은 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg"> 그림 3입니다. CMAP 진폭, 대기 시간 및 필요한 자극에 뒷 다리-질병 과정 및 ALS에 앞 발 마우스 모델. SOD1 G93AA-(C)와 PrP-hFUS-WT3 (D-F) 유전자 변형 (tg) 쥐와 유전자 변형 비 (비-tg) littermates 모터 증상에서 증상 단계에서 측정 되었다는 질병의 징후 늦은 단계 처리, SOD1 G93A와 PrP-hFUS-WT3 마우스, 29, 38, 및 53 일 또는 나가 57, 91, 147 일 (d)에서 각각. 블랙: 비-유전자 변형 hindlimb, 검은 점선: 비-유전자 변형 forelimb, 회색: 유전자 변형 hindlimb 회색 점선: 유전자 변형 forelimb. 결과 ± sd. 진폭을 의미 하는 대로 표시 됩니다 (A, D) 비-유전자 변형 동물 모두 뒷 다리와 앞 발에에서 시간이 지남에 안정 됐다. 유전자 변형 동물, 진폭은 질병 과정에서 감소. 대기 시간 (B, E)는 질병에 의해 덜 영향 되었고 주요 차이 유전자 형에 앞 발 및 뒷 다리-사이 관찰 했다. (C, F) 필요한 자극에 변화가 했다 모든 그룹에서 최소한의. SOD1 G93A N = tg 147 d, N 제외한 모든 그룹에서 4 = 3. PrP-hFUS-WT3 마우스 29, 38, 및 53 연령 그룹에서 N는 비-4, 5, 및 4, 안내에 대 한 안내 7, 5, 및 3, 각각. 기호 다음과 같이 그룹 간의 차이 나타냅니다: *: tg hindlimb, # 대 비 안내 hindlimb: tg forelimb 대 비 안내 forelimb ¤: 비 안내 forelimb, 회색 대 비 안내 hindlimb *: tg hindlimb tg forelimb 대. 양방향 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 테스트, *: p &lt; 0.05, * *: p &lt; 0.01, * * *: p &lt; 0.001, * * *: p &lt; 0.0001. #: p &lt; 0.05, # #: p &lt; 0.01, # # #: p &lt; 0.001, # # # : p &lt; 0.0001. ¤: p &lt; 0.05, ¤¤: p &lt; 0.01, ¤¤¤: p &lt; 0.001, ¤¤¤: p &lt; 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg"> 그림 4입니다. CMAP 진폭, 대기 시간, 그리고 뒷 다리-필요한 자극 CMT1A 쥐의 앞 발. C61 PMP22 유전자 변형 (tg) 쥐와 유전자 변형 비 (비-tg) littermates 1.5-2 세에서 측정 되었다. 진폭 (A)는 모두 뒷 다리 및 유전자 변형 쥐의 앞 발에 감소 했다. 대기 시간 (B) CMT 마우스에 모든 사지에서 연장 했다 그리고이 측정으로 앞 발에도 미묘한 변화가 감지 되었습니다. 자극 강도 (C)에 대 한 요구 사항은 CMT1A 환자에서 검출 된 표현 형을 닮는 C61 PMP22 생쥐에서 증가 되었다. 결과 ± SD, 의미 하는 대로 표시 됩니다 비 안내 N = 4 그리고 안내 N = 3. Sidak와 양방향 ANOVA의 여러 비교 테스트, * *: p &lt; 0.01, * * *: p &lt; 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg"> 그림 5입니다. Forelimb 활동 전위는 신경 자극에 의해 발생 됩니다. 관찰된 CMAP 응답 근육 자극 기인 했다 가능성을 제외 하려면 (부분) axotomy 상 완 총 신경에서 수행 되었다. CMAP 진폭 (A) 및 (B) 대기 (전) 전에 기록 된 성인 비 유전자 변형 생쥐에서 4 일 후 (게시) 상 완 신경 총의 axotomy. Axotomy는 CMAP 진폭 나타내는 반응은 신경 자극으로 인해 감소 됩니다. 블랙: hindlimb, 회색: contralateral forelimb 회색 점선: 동측 forelimb. 결과 평균 ± SD, N으로 표시 = 2. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

신경 유도의 측정 neurodegeneration의 마우스 모델을 평가 하는 유용한 도구 이지만 그것은 자주 hindlimbs에 좌 골 신경을 자극에 적용 됩니다. 여기, 복합 근육 활동 전위 (CMAP) vivo에서 상 완 신경 총에 의해 innervated 마우스 forelimb 근육에서 측정 하는 기술을 설명 합니다.

Vivo에서 모터 신경 퇴보의 마우스 모델에서 앞 발에서 복합 근육 활동 전위의 electrophysiological 측정

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

이 방법을 사용하면 축삭돌기의 퇴화뿐만 아니라 신경 퇴행의 마우스 모델의 말초 신경의 탈수초화를 추정할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 최소 침습 방법이 반복 측정에 적합하다는 것입니다: 동일한 동물의 여러 신경을 추적하지 않은 경우만 가능합니다. 이 방법의 민감도는 현저한 더 많은 결함이 기록되기 전에도 변조에서 축삭 손실을 조기에 감지할 수 있으므로 이러한 결함을 조기에 감지할 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 이소플루란 산소 흡입으로 마우스를 마취합니다. 뒷다리 보행 패드에 가벼운 압력을 가하여 적절한 마취를 확인하여 통증 금단 반사가 없는지 확인합니다. 그런 다음 마취를 유지하기 위해 동물의 얼굴에 노즈 콘을 놓습니다.콧방울이 기도를 막지 않고 동물이 꾸준히 숨을 쉬고 있는지 확인하십시오. 다음으로, 온도 조절 가열판을 사용하여 동물의 체온을 섭씨 37도로 유지합니다. 뒷다리에서 CMAP을 측정하려면 마우스를 엎드린 위치에 놓습니다.뒷다리를 뻗고 접착 테이프를 사용하여 작업 표면에 발을 부착합니다. 그런 다음 27 게이지 자극 전극 중 5mm를 좌골 결절의 양쪽에 피하로 놓고 전극 사이에 2cm를 두고 밑에 있는 근육을 뚫지 않습니다. 마찬가지로, 기록 전극을 비복근 위와 평행하게 피하하에 놓습니다.그런 다음 기준 전극을 아킬레스건 옆에 30도 각도로 피하 놓고 피부 아래에 2-5mm의 바늘을 남겨 둡니다. 자극 전극과 유사한 방식으로 마우스 측면에 접지 전극을 피하로 놓습니다. 앞다리의 CMAP을 측정하려면 누운 자세의 방향 패드에 마우스를 놓고 접착 테이프를 사용하여 몸 측면의 양쪽 앞다리를 확장합니다.다음으로, 앞다리 양쪽의 기저 근육을 뚫지 않고 자극 전극 5mm를 상완신경총 신경과 정렬하도록 피하주에 배치합니다. 그런 다음 기록 전극을 이두박근 상완근 위에 피하로 놓습니다. 그런 다음 기준 전극 3mm를 보행 패드에 30도 각도로 놓고 마우스 측면에 접지 전극을 피하로 삽입합니다.이 설정에서 전극은 서로 가까이 있습니다. 전극이 서로 닿지 않도록 하면 녹음이 왜곡됩니다. 0.1밀리초의 자극 지속 시간으로 초당 하나의 펄스를 사용하여 모든 축삭을 자극합니다.데이터를 수집하려면 컨트롤러 장치의 반복 자극 버튼을 눌러 자극을 시작하고 강도 컨트롤러 노브를 돌려 자극을 높입니다. 초최대 자극에 도달하려면 CMAP 응답의 진폭이 증가를 멈출 때까지 강도 컨트롤러 노브를 돌려 증가하는 자극을 가합니다. 거기에서 자극을 20% 더 증가시켜 CMAP 진폭이 최대 응답에 도달했는지 확인합니다.반복되는 자극 버튼을 다시 눌러 자극을 종료합니다. 마커 도구를 사용하여 기록에서 다음 지점을 표시합니다. 반응의 시작, 최대 양수 피크 및 최대 음수 피크.자극의 시작은 소프트웨어에 의해 자동으로 결정됩니다. 지연 시간을 자극의 시작부터 응답의 시작까지의 지연으로 결정합니다. 잠복기를 사용하여 축삭의 탈수초를 평가합니다.최대 음의 피크에서 최대 양의 피크까지 진폭을 측정하고 진폭의 크기를 사용하여 기능적 축삭의 수를 연관시킵니다. 전극의 정확한 배치는 기록의 결과 값에 영향을 미칠 수 있으므로 전극을 교체하고 초최대 자극을 사용하여 동일한 신경을 3회 측정하여 가장 큰 반응을 얻을 수 있도록 합니다. 녹음의 평균을 사용합니다.측정 후 모든 전극을 제거하고 마우스를 가열판 또는 적외선 아래에서 회복하도록 둡니다.amp 충분한 의식을 회복할 때까지 약 2-5분 동안 . 마우스가 마취에서 완전히 회복될 때까지 마우스를 방치하거나 다른 마우스와 함께 두지 마십시오. C61, PMP22 마우스는 인간 PMP22 및 이형접합 마우스의 3-4개 사본을 발현하여 경미한 탈수초 및 CMAP 감소를 동반한 매우 경미한 CMT1A 질병 표현형을 재현하지만 눈에 띄는 표현형은 없습니다.C61 PMP22 형질전환 마우스의 1년 반에서 2년 사이에서는 뒷다리와 앞다리 모두에서 CMAP 진폭이 감소하고 잠복기가 길어집니다. 형질전환 마우스에서 뒷다리와 앞다리 모두에서 진폭이 감소하였고, CMT 형질전환 마우스에서 모든 팔다리에서 잠복기가 연장되었으며, 이 측정으로 앞다리의 미묘한 변화도 검출되었습니다. 자극 강도에 대한 요구는 C61 PMP22 마우스에서 증가했으며, 이는 CMT1A 환자에서 검출된 표현형과 유사합니다.일단 마스터되면 CMAP 녹음은 적절하게 수행되면 15분 안에 뒷다리와 앞다리 모두에 대해 완료할 수 있습니다. 제시된 기술은 근위축성 광배근 경화증 및 Charcot-Marie-Tooth 병과 같은 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델을 특성화할 수 있는 새로운 가능성을 제공합니다. 신경 축삭돌기의 기능을 평가하면 신경근 장애의 진행에 대한 자세한 정보를 얻을 수 있습니다.임상 환경에서 유사한 녹음이 사용되어 이 방법의 번역 가능성을 강조합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 새로운 방법은 하나의 성인 마우스 motoneuron과 근육 섬유에 의해 생성 된 힘의 측정의 동시 세포 녹음을 할 수 있습니다. 정상과 유전자 변형 동물의 모터 장치의 전기 및 기계적 성질의 결합 조사 신경 근육 시스템의 연구를위한 돌파구이다.

성인 마우스에서의 모터 단위 제작 룸버 Motoneuron과 포스의 동시 세포 녹화<em&gt; 생체에</em

이 비디오는 마우스의 CMAP(Compound Muscle Action Potential)를 측정하기 위한 생체 내 기술을 보여줍니다. 전극을 설정하고, 근육 섬유에 신경을 공급하는 앞다리 뉴런을 자극하고, 근육 반응을 기록하는 단계를 간략하게 설명합니다. 이 기술은 신경 세포 탈수초화 및 기능적 뉴런 손실을 평가합니다.

Measuring Compound Muscle Action Potentials in Mouse Forelimb Muscles In Vivo(생체 내 마우스 앞근육의 복합 근육 활동 전위 측정)

이 비디오는 척골 신경에 전기 자극을 가하고, 최적의 신호를 위해 전극을 조정하고, 신경 기능을 평가하기 위해 자극을 증가시켜 쥐의 복합 근육 활동 전위(CMAP)를 기록하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 장애에서 말초 신경 기능에 대한 생체 내 조사를 할 수 있습니다.

쥐의 복합 근육 활동 전위의 생체 내 측정

생체 내에서 신경의 전도 특성의 측정은 신경 근육 질환의 다양한 동물 모델을 특성화 할 수있는 강력한 도구를 예시. 여기서, 우리는 마취 된 쥐의 좌골 신경의 전기 생리 분석이 수행 될 수있는 간단하고 신뢰성있는 프로토콜을 제시한다.

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우리는 마우스의 모터 유닛의 기능의 생체 모니터링 허용 정제 프로토콜을 제시한다. 기술 좌골 신경에서 신경 지배 마우스 뒷다리 근육의 복합 근 활동 전위 (CMAP)와 모터 유닛 번호 추정 (무네)을 측정하는 것이 설명된다.

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