Name: 유전 Transthyretin Ala97Ser의 유전 분석 관련 Amyloidosis (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 학습하세요 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증의 Ala97Ser 돌연변이를 PCR 및 DNA 시퀀싱으로 확인하는 임상 진단 프로토콜을. 조기 진단과 환자 예후 개선에 필수적인 유전 분석 방법론입니다.

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우리가 실험에서 그녀의 도움에 대 한 미스 신 재미 우 감사 하고자 합니다. 이 연구는 장 공 의학 연구 프로그램 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373)와 IRB 100-4470A3, 104-2462A3, 대만에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

임상 실험실 개선 개정 (CLIA) 1988 년의 기관 검토 위원회의 장 궁 메모 리얼 병원에서 승인 하는 규정 요구 사항에 따라 실시 되었다 테스트 실험실에서 수행 하 고 대학 (라이센스 번호 100-4470A3 및 104-2462A3). 동의 모든 환자에서 얻은 했다.
1. 혈액 표본 수집
<ol><li>상업적으로 사용할 수 있는 치료를 EDTA 튜브로 전체 혈액을 수집 합니다. 부드럽게 혼합 하 고 처리까지 4 ° C에서 혈액 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>2. 말 초 혈액에서 DNA 추출
DNA 추출 키트를 사용 하 여 게놈 DNA 추출 ( 재료의 표참조).
<ol><li>4.0 mL 혈액 샘플을 솔루션 1의 10 mL를 추가 합니다. 10 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 제거 하 고 상쾌한을 신중 하 게 삭제. 솔루션 1의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>다시 4 ° C에서 5 분 동안 2000 x g에서 샘플을 원심 하 고 상쾌한 삭제. 솔루션 2의 3 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>100 µ g/mL의 최종 농도 고 잘 섞어 나 재고 솔루션 (225 mg/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>10 분 추가 0.8 mL 솔루션 3의 샘플에 대 한 얼음에 튜브를 진정 하 고 반전 3-5 번. 5 분 동안 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>4 ° c.에 15 분 동안 3000 x g에서 샘플을 원심 조심 스럽게 15 mL 원뿔 메 마른 분리기 관에는 상쾌한 전송.</li>
	<li>20 µ g/mL의 최종 농도를 RNase 재고 솔루션 (10 mg/mL)의 6 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>부드럽게 여러 번 DNA를 침전을 반전 하 여 이소프로필 알코올과 혼합의 2.5 mL를 철저 하 게 추가 하는 방법 (흰색, 부드러운 재질의 가닥 형성). 큰 구멍 피펫으로 사용 하 여 새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브 DNA 비례적 전송.</li>
	<li>4 ° c.에 3 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 상쾌한 신중 하 게 삭제 합니다. 씻어 DNA 펠 릿의 70% 에탄올 500 µ L을 추가 하 여.</li>
	<li>1 분 동안 12000 x g에서 centrifuge 고 상쾌한 삭제. 공기 건조 실 온에서 DNA 펠 릿. DdH2O의 100 µ L을 추가 하 고 65 ° C 15 분 DNA resuspend에서 품 어.</li>
</ol>3. 게놈 DNA 정량화
분 광 광도 계를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 게놈 DNA의 품질과 수량을 감지 하.
<ol><li>분 광 광도 계 컴퓨터에 연결 된 컴퓨터에 로그인 합니다. 소프트웨어를 엽니다.</li>
	<li>분 광 광도 계 기계 초기화:<ol>
<li>분 광 광도 계 소프트웨어에 "핵 산"을 클릭 합니다.</li>
		<li>일회용 종이 지우기와 순화 된 물 받침대를 청소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분 광 광도 계 빈:<ol>
<li>주 춧 대에 순화 된 물의 2 µ L을 로드 합니다.</li>
		<li>분 광 광도 계의 윗부분을 낮출 하 고 "빈" 보정을 클릭 합니다.</li>
		<li>완료 되 면 위 팔을 들어올린 닦기와 받침대를 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>측정 샘플:<ol>
<li>샘플 종류에 "DNA 50"을 클릭 합니다.</li>
		<li>주 춧 대에 DNA 샘플의 2 µ L을 로드 합니다.</li>
		<li>낮은 팔 위쪽을 A260/A280 비율과 샘플의 농도 측정 하기 위해 "측정"을 클릭 합니다.</li>
		<li>지우기와 순화 된 물으로 각 실행 사이 받침대를 청소.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Print Screen" 데이터 수집을 클릭 합니다.</li>
</ol>4. 유전자 돌연변이 분석
PCR4대상 DNA를 증폭. 25 µ L 반응에서 PCR을 수행 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 혼합 키트 ( 재료의 표참조). 표 1 에서 intronic 뇌관 TTR 유전자를 보여준다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>유전자</td>
			<td>뇌관 순서</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. TTR 유전자 intronic 뇌관. (NCBI 참고 순서: NC_000018.10)
<ol><li>0.2 mL PCR 튜브를 표 2 에 시 약을 추가 합니다.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨 (µ L)</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x 버퍼</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1.5 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC 증강</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 DNA 중 합 효소</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2 U/반응</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP 믹스 (각 25 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 F (10 µ M)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 R (10 µ M)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 Μ M</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-등급 물</td>
			<td>13.8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>총 볼륨</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. PCR 반응 조건입니다.
<ol start="2"><li>부드럽게 혼합 하 고 짧게 튜브의 하단에 모든 구성 요소를 수집 하는 벤치탑 원심 분리기에 원심. 튜브는 thermocycler 장소.</li>
	<li>30 사이클에 대 한 PCR을 수행 합니다. 각 주기 30 변성 단계 이루어져 94 ° C, 30에 대 한 단련 하는 뇌관에서 s 58 ° C, 및 45에 대 한 중 합 효소 확장에서 s s 72 ° C에서 ( 표 3참조).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>온도 (° C)</td>
			<td>시간</td>
			<td>사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>초기 변성</td>
			<td>95</td>
			<td>5 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA 변성 단계</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>뇌관 어 닐 링의 단계</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>중 합 효소 확장 단계</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 사이클</td>
		</tr>
<tr>
<td>포스트 신장 단계</td>
			<td>72</td>
			<td>10 분</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR의 끝 자전거</td>
			<td>4</td>
			<td>무기한</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 3입니다. 사이클링 증폭 PCR 제품을 위한 조건.
<ol start="4"><li>젤 전기 이동 법으로 시각화 하 여 PCR 제품을 확인:<ol>
<li>1.2 %agarose 젤 준비:<ol>
<li>0.5의 100 mL의 agarose 분말 1.2 g 혼합 microwavable 플라스 크에 x TBE. 전자 레인지는 agarose는 완전히 용 해 될 때까지 2 분. 55 ° c agarose 혼합물을 진정</li>
			<li>Ethidium 평범한 사람 해결책 (10mg/mL)의 2 µ L agarose 혼합물에 추가 하 고 부드럽게 혼합. 약 5-7 m m 젤 트레이에 agarose 혼합물을 부 어 다음 장소에는 comb(s)를 추가 합니다. (적어도 30 분)을 공고히 하 고 comb(s)를 조심 스럽게 제거를 하실 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플을 로드 하 고 실행 하는 agarose 젤:<ol>
<li>트레이 젤 전기 이동 법 셀에 놓습니다. 0.5 전기 셀 채우기 x TBE 젤 커버까지.</li>
			<li>신중 하 게 로드 2 µ L 100 bp DNA의 분자 크기 표식으로 젤의 한 차선에 ( 재료의 표참조) 사다리. 부하 염료/샘플 혼합 (5 µ L PCR 제품 믹스의 로드 염료 x 1 µ L 6와) 추가 차선에.</li>
			<li>전원 공급 장치를 켭니다. 100 V에서 25 분 젤을 실행 합니다.</li>
			<li>젤 전기 이동 법 셀에서 제거 합니다. 자외선 이미징 시스템에서에서 DNA 파편을 시각화.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. DNA 시퀀싱
<ol><li>상업 키트를 사용 하 여 PCR 제품을 정화 하 고 상업적으로 또는 자동 시퀀서는 시퀀싱 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>뉴클레오티드 시퀀스 뉴클레오티드 데이터베이스10뉴클레오티드 쿼리를 비교 하는 NCBI 폭발 서버에 제출 합니다. 결과 표시 후 시퀀스 정렬을 수행 하 고 예상된 돌연변이 식별 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜 내에서 두 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 백혈구 세포의 충분 한 수를 위해, hemodiluted 견본 피할된11이어야 한다. 둘째, 적절 한 PCR 뇌관의 사용이 이다 신뢰할 수 있는 결과12를 기본. 디자인 뇌관4,13; 뇌관 폭발 웹 도구를 사용 하는 우리 4 개의 TTR exons의 각 측에 40의 기본적인 쌍의 최소 처리 되어야 합니다. 우리는 또한 뇌관의 특이성을 확인 하는 NCBI에 폭발을 실행 합니다.
일부 수정 DNA 추출 단계에서 만들어집니다. 첫째, 사용 하는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 수 있습니다. 이 수정 또한 충분 한 양의 DNA 생성 하 고 솔루션을 저장 합니다. 둘째, 소 프로 파 놀 또는 100% 에탄올 DNA...

Transthyretin (TTR) amyloidosis (ATTR) 조직의 유전 amyloidosis1, 가장 일반적인 형태 이며 transthyretin (TTR) 유전자2상 염색체 지배적 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있습니다. TTR 돌연변이 tetrameric 단백질 구조를 불안정 하 게 하 고 녹말 체 소2로 재어셈블합니다 단위체로 그것의 분리 이어질. 100 amyloidogenic TTR 변이 보고 전세계1되었습니다. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 확인 하 고 피하는 남쪽 오 점3에 비해 방사성 레이블이 프로브의 처리를 포함 하는 장점이 있다. PCR은 현대 과학4에 수많은 분야에 적용 된, 쉽게, 저렴 한, 빠르고 신뢰할 수 있는 기술입니다.
이 진보 및 치명적인 질병의 조기 진단의 phenotypic이 주어진 도전 이다. 관심과 ATTR 신흥 치료5의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가, TTR 유전자 검사를 포함 한 적절 한 진단 연구는 따라서 비판적으로 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 또한, 다른 변이 특성의 다른 penetrance, 발병 연령, 진행, 질병의 심각도, 메디아 생존, 간 이식, 또는 TTR 안정기2,6, 효능의 패턴에 연관 된 고 가변도 신경학 적인 참여의 유전 상담7,,89에 대 한 큰 의미를가지고. 게다가, 매우 정확한 유전자 검사는 두 가지 유형의 속성을 구분 하는 유일한 도구: 유전 (돌연변이) 및 야생 유형 (비 돌연변이 형태, 치 조직의 amyloidosis, 특수)7. 그것은 치료2넓게 변화 하기 때문에, 속성의 종류를 확인 하는 것이 필수적입니다. 그러므로, TTR 유전자 검사의 stepwise 프로토콜을 설명 하는 증가 필요는 없다.
돌연변이 검출 하는 분자 접근 방식은 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 그림 것입니다. 수정 DNA 추출 단계에서 사용 되는 세 가지 솔루션의 양을 줄일 하 고 충분 한 양의 DNA 생성 합니다. 이 프로토콜에서 모든 4 개의 TTR exons 지역 5' 상류 3' 하류, 발기인, introns를 포함 하 여 동안, 분석 되었다 그리고 번역 되지 않은 영역 (UTR) 시퀀싱 하지 했다.

<table><tbody><tr><td>EDTA 처리된 튜브</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA 추출 키트</td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND2000 분광 광도계&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이퍼</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>TTR 유전자 인트로닉 프라이머&nbsp;</td><td>엑손1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>엑손4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR 시스템 9700</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 셀&nbsp;</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>DNA 사다리</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>염료</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>자동 시퀀서&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>3730xl DNA 분석기</td><td></td></tr></tbody></table>

유전 transthyretin ala97ser의 유전 분석 관련 amyloidosis

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

유전자 검사 이며 유전 transthyretin에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 테스트 관련 amyloidosis transthyretin amyloidosis (ATTR)의 대부분의 경우에서 수행 되어야 합니다. 속성은 유형이 다른 고기;와 희귀 하지만 치명적인 질병 따라서, 진단 때로는 지연 됩니다. 관심과 ATTR 신흥 치료의 초기 발현에 광범위 한 인식 증가 함께 transthyretin (TTR) 유전자를 포함 하 여 적절 한 진단 연구, 테스트, 종류를 확인 하 고 ATTR의 변종 따라서 예 후를 개선 하기 위해 근본적인. 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법으로 유전자 분석 TTR 점 돌연변이의 존재를 훨씬 더 신속 하 게 확인 하 고 남쪽 오 점 등 기존 방법 보다 안전. 여기, 우리가 ATTR Ala97Ser 돌연변이, 대만에서 가장 일반적인 발병 돌연변이의 유전자 확인을 보여 줍니다. 프로토콜 구성 4 가지 주요 단계: 수집 전 혈 견본, DNA 추출, PCR와 모든 4 개의 TTR exons의 유전자 분석 및 DNA 연속.

Agarose 젤 전기 이동 법 두 환자와 exon TTR 유전자 (그림 1)의 4에 대 한 454 bp의 PCR 제품을 포함 한 예상된 크기에의 한 건강 한 개별 계시 밴드.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> 그림 1 . 젤 전기 이동 법 묘사 PCR 증폭 TTR 유전자. 일반: 건강 한 개인입니다. 분자 크기 표식으로 레인 m: 100 bp DNA 사다리. 레인 1: 246 bp (exon 1) 레인 2: 292 bp (exon 2) 레인 3: 299 bp (exon 3) 레인 4: 454 bp (exon 4)...

여기, 우리는 예를 들어 Ala97Ser, 대만, 가장 일반적인 발병 변이 사용 하 여 유전 transthyretin amyloidosis의 진단에 대 한 점 돌연변이의 존재를 확인 하는 프로토콜 제시.

유전 Transthyretin Ala97Ser의 유전 분석 관련 Amyloidosis

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

트랜스티레틴 아밀로이드증의 조기 발현과 새로운 치료법에 대한 관심이 높아짐에 따라, 트랜스티레틴 아밀로이드증의 유형과 변이를 확인하기 위한 적절한 연구가 예후를 개선하기 위한 기초가 되었습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 이 테스트가 실현 가능하고 임상 실험실에서 쉽게 수행할 수 있다는 것입니다. 프로토콜을 시작하려면 DNA 추출 키트를 얻고 이전에 얻은 4.0ml 혈액 샘플에 10ml의 용액 1을 추가하고 샘플을 얼음에서 10분 동안 배양합니다.배양 후 2000G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리십시오. 용액 1의 3 밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.2000G에서 샘플을 다시 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 용액 2 3 밀리리터에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.다음으로, 10마이크로리터의 Pronase 원액을 첨가하여 밀리리터당 100마이크로그램의 최종 농도를 얻고 내용물을 잘 혼합합니다. DNA를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 튜브를 얼음에 10분 동안 식힌다.0.8ml의 용액 3을 샘플에 넣고 3-5회 뒤집습니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 3000G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 시료를 원심분리합니다.상등액을 15ml 멸균 원추형 원심분리기 튜브로 조심스럽게 옮기고 6마이크로리터의 RNase 원액을 추가하여 밀리리터당 20마이크로그램의 최종 농도를 얻습니다. 샘플을 배양하고 튜브에 2.5ml의 이소프로필 알코올을 첨가한 다음 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 흰색 응집제 가닥으로 나타나는 DNA를 침전시킵니다. 큰 구멍 피펫을 사용하여 침전물을 새로운 1.5 ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다.12, 000 G에 4 섭씨 온도에 3 분 동안 침전물을 원심 분리하십시오. 상등액은 조심스럽게 버리십시오. 그런 다음 500 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하여 DNA 펠릿을 세척하십시오.12, 000 G에 DNA를 1 분 동안 원심 분리하고 상등액을 버리십시오. DNA 펠릿을 실온에서 자연 건조시킵니다. 100마이크로리터의 DDH2O를 넣고 섭씨 65도에서 15분 동안 샘플을 배양하여 DNA를 다시 현탁시킵니다.DNA 중합효소 키트를 사용하여 25마이크로리터 반응 혼합물에서 PCR을 수행합니다. 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 시약을 추가합니다. 내용물을 부드럽게 섞고 벤치탑 원심분리기에서 간단히 원심분리합니다.튜브를 열 순환기에 넣습니다. 섭씨 94도에서 30초 동안 변성 단계로 30주기 동안 PCR을 수행하고, 섭씨 58도에서 30초 동안 프라이머를 활성화하고, 섭씨 72도에서 45초 동안 중합효소 확장을 수행합니다. 전자레인지용 플라스크에 아가로스 분말 1.2g과 0.5XTBE 100ml를 혼합하여 1.2% 아가로스 젤을 준비합니다.아가로스가 완전히 녹을 때까지 용액을 전자레인지에 2분 동안 돌립니다. 아가로스 혼합물을 섭씨 55도로 식힙니다. 아가로스 혼합물에 2마이크로리터의 브롬화 에티듐 용액을 넣고 부드럽게 섞습니다.혼합물을 젤 트레이에 약 5-7mm로 붓습니다. 그런 다음 빗을 삽입합니다. 젤이 최소 30분 동안 굳어지도록 합니다.젤이 굳은 후 빗을 조심스럽게 제거합니다. 겔과 트레이를 전기영동 셀에 넣습니다. 겔이 덮일 때까지 전기영동 셀을 0.5 XTBE로 채웁니다.100 염기쌍 DNA ladder 2마이크로리터를 분자 크기 마커로 겔의 한 레인에 조심스럽게 로드합니다. 염료와 샘플 혼합물을 추가 레인에 로드합니다. 전원 공급 장치를 켜고 100볼트에서 25분 동안 젤을 실행합니다.전기영동 셀에서 겔을 제거합니다. 마지막으로, 이미징 시스템에서 UV 광선 아래에서 DNA 단편을 시각화합니다. 환자 2명과 건강한 환자 1명의 아가로스 겔 전기영동은 TTR 유전자의 엑손 4에 대한 454 염기쌍 PCR 산물을 포함하여 예상되는 크기의 띠를 나타냅니다.염기서열 크로마토그램은 TTR 유전자의 엑손 4에서 G에 대한 뉴클레오티드 T 치환을 밝혀냈으며, 이는 미스센스 돌연변이를 초래하고 2명의 환자에서 아미노산 위치 97에서 알라닌을 세린으로 치환했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증 진단을 위해 점 돌연변이의 존재를 확인하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

바이오패닝 기술과 원자력 현미경을 사용하여 낮은 농도에서도 모든 생물학적 물질에 존재하는 질병 특이적 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 음성 및 양성 바이오패닝 시스템을 만들었습니다.  우리는 근위축성 측삭 경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)과 관련된 TDP-43 단백질 변이체에 대한 항체를 획득하는 데 성공했습니다.

루게릭 병에 TDP-43 변종 형태론 특정 시약의 분리에 대한 소설 원자 힘 현미경 기반 Biopanning

마우스를 모델 시스템으로 사용하여 인간 질병과 관련된 유전자군을 이해하기 위한 역유전학 접근 방식을 제시하고 후속 마우스 표현형 분석 일정을 설명합니다. 관심 유전자인 HtrA2에 결함이 있는 마우스가 파킨슨병 증상을 보였기 때문에 표현형 분석 요법은 신경학적 결함을 식별하는 데 중점을 둡니다.

노화의 인간의 질병에 관여 유전자를 연구에 사용 된 유전자 변형 마우스에 대한 표현형 요법

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

아 밀 로이드 증 착 다른 질병의 특징은 고 고생 많은 다른 기관. 이 문서에서는 발광 활용된 oligothiophene 형광 형광 현미경 검사 법 기술 함께에서 얼룩의 응용 프로그램을 설명 합니다. 이 얼룩 메서드 검색 및 임상과 과학적인 설정에 단백질의 탐사를 위한 강력한 도구를 나타냅니다.

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

타겟된 다음-세대 시퀀싱 질병 연구 및 임상 진단에서 점점 인기 끌고있다는 시간 및 비용 효율적인 접근 이다. 여기에 설명 된 프로토콜 시퀀싱에 필요한 복잡 한 워크플로 및 질병을 유전 이체를 식별 하는 데 사용 하는 생물 정보학 과정을 제공 합니다.

다음-세대 시퀀싱과 생물 정보학 파이프라인 헌법 질병의 유전 결정 요인 평가 대상

현재에 연구, 우리 C924T 유전자 형을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜 구성 3 단계: DNA 추출, 연쇄 반응 (PCR), 및 agarose 젤에 제한 조각의 길이 다형성 (RFLP)의 분석에 의해 증폭.

Thromboxane A2 수용 체 유전자의 C924T 다형성을 공부 하는 방법

아미노산 수준 신호-잡음 분석 주어진 인구의 유전 변이 배경으로 정규화는 주어진된 아미노산 위치에 유전 변이의 보급을 결정 합니다. 이 인구 (잡음)에 희소 한 이체의 주파수 이상으로 상승 하는 단백질 시퀀스 (신호) 내에서 변형 "핫스폿"의 확인에 대 한 수 있습니다.

유전 변이의 아미노산 수준 신호-잡음 분석을 사용 하 여 Variant Pathogenicity의 가능성 확인

신경 퇴행성 질환에 대한 혈액 기반 바이오 마커는 대규모 임상 연구를 구현하는 데 필수적입니다. 신뢰할 수 있고 검증된 혈액 검사는 작은 샘플 부피뿐만 아니라 덜 침습적 샘플링 방법, 저렴하고 재현성이 있어야 합니다. 이 논문은 고처리량 모세관 전기 영동 면역 분석이 잠재적인 바이오마커 개발을 위한 기준을 충족한다는 것을 보여줍니다.

인간 혈소판에서 근위축성 측삭 경화증의 잠재적인 바이오마커를 검색하기 위해 모세관 전기 영동 면역 분석사용

임상 연구에서 발견된 가족성 유전성 심근병증 계열을 기반으로 이 돌연변이를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 게놈 엔지니어링을 통해 마우스 MYH7 유전자좌에서 점 돌연변이(G823E)가 있는 C57BL/6N 마우스 모델을 만들었습니다.

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사

여기에서는 미국 환경 보호국 서열 정렬을 활용하여 종 감수성 (SeqAPASS) 도구를 예측하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 보존을 신속하게 분석하고 종 전반에 걸쳐 화학적 감수성에 대한 사용자 정의 가능하고 쉽게 해석 가능한 예측을 제공하는 온라인 도구의 적용을 보여줍니다.

단백질 보존의 신속한 평가를 위한 종 간 감수성 도구를 예측하기 위한 서열 정렬 입증

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

학습하세요 유전성 트랜스티레틴 아밀로이드증의 Ala97Ser 돌연변이를 PCR 및 DNA 시퀀싱으로 확인하는 임상 진단 프로토콜을. 조기 진단과 환자 예후 개선에 필수적인 유전 분석 방법론입니다.

유전 Transthyretin Ala97Ser의 유전 분석 관련 Amyloidosis

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