AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

이 방법은 금속 철 결합으로 인한 구조적 변화와 같은 내인성 장애 단백질의 구조론에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장비가 거의 필요하지 않고 결과를 매우 빠르게 얻을 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Matthias Stein입니다.

시작하려면 유리판에 유리 절단기를 사용하여 폴리아미드 외부 코팅과 내경 50미크론이 있는 순수 용융 실리카 모세관을 33cm 및 30cm 길이로 자릅니다. 펜을 사용하여 CGE 실험의 경우 모세관의 한쪽 끝에서 24.5cm, ACE 실험의 경우 모세관의 한쪽 끝에서 21.5cm 떨어진 곳에 1cm 너비의 감지 창 중앙을 표시합니다. 토치를 사용하여 각 표시 전후 0.5cm 전후에 폴리아미드 외부 코팅을 태웁니다.

마찬가지로, 토치를 사용하여 모세혈관 양쪽 끝에 있는 코팅을 1cm 제거합니다. 그런 다음 에탄올과 연조직을 사용하여 모세혈관 끝과 감지 창을 청소합니다. 배출구 근처에 감지 창이 있는 CE 시스템에 모세관을 설치합니다.

용액을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 250마이크로몰의 염화칼슘 용액을 사용하여 10ml 주사기를 채웁니다. 그런 다음 0.2미크론 PVDF 필터를 주사기에 부착하고 필터를 통해 용액 2ml를 밀어 넣어 버립니다. 주사기에 남아 있는 염화칼슘을 사용하여 최대 허용 부피까지 10개의 바이알을 채웁니다.

각 바이알에 250 마이크로몰 염화칼슘 용액 주입 바이알로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 염화칼슘 용액을 사용하여 10개의 바이알을 반쯤 채웁니다. 각각을 250마이크로몰 염화칼슘 용액 배출구 바이알로 표시합니다.

그런 다음 다른 금속염 함유 용액으로 유사한 방식으로 바이알을 채웁니다. 또한 각 주입구 및 배출구 바이알 쌍에 대해 30마이크로몰 Tris Buffer를 사용하여 유사한 주입구 및 배출구 바이알 세트를 준비합니다. 60마이크로몰 아세트아닐라이드 EOF 마커로 10개의 바이알을 채웁니다.

그런 다음 밀리리터당 1밀리그램 샘플 용액을 사용하여 바이알 하나를 채웁니다. 분석을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 CGE 실험을 위해 샘플 용액을 유체역학적으로 주입하고 주입구에서 4분 동안 0.1bar를 적용하여 분리를 실행합니다. 그런 다음 모세관 양쪽 끝에 음의 16.5 킬로볼트와 2.0 bar의 압력을 25 분 동안 가합니다.

리간드 없이 측정하기 위한 방법을 준비한 후, 먼저 0.1몰 EDTA 용액을 사용하여 2.5bar에서 1분 동안 모세관을 헹구어 리간드를 사용한 측정법을 준비합니다. 그런 다음 탈이온수를 사용하여 모세관을 헹굽니다. 다음으로, 리간드 용액을 사용하여 모세관을 평형을 이루고 2.5bar에서 1.5분 동안 헹굽니다.

그런 다음 아세트아닐라이드 용액을 0.05bar에서 6초 동안 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 완충액 바이알이 포함된 리간드로 변경합니다. 0.05bar를 2.4초 동안 도포하여 아세트아닐라이드 용액을 모세혈관 끝에서 더 밀어 넣습니다. 10.0kV를 6분 동안 적용하고 200나노미터의 파장에서 자산 아세트아닐라이드 피크를 검출합니다.

EDTA 탈이온수와 리간드 용액으로 모세관을 헹군 후 이전과 같이 단백질 샘플을 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 완충액 바이알이 포함된 새 리간드로 변경합니다. 또는 리간드를 사용하거나 사용하지 않고 측정을 반복합니다. 그런 다음 알칼리 토류 리간드 용액을 사용하여 방법을 반복합니다.

마지막으로 다음 솔루션을 사용하여 동일한 방법을 수행합니다. 그런 다음 다양한 단백질 금속 이온 상호 작용에 대한 전하 크기 비율의 변화를 계산합니다. 여기에 표시된 것은 CGE 실험 중에 얻은 AtHIRD11 샘플에 대한 전기 표상도입니다.

펩타이드 크기는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 피크 번호 4는 질량이 가장 크며 온전한 단백질을 나타냅니다. 더 작은 피크인 2와 3은 더 작은 불순물을 나타냅니다.

이 그림은 ACE 실험 중 아세트아닐라이드에 대한 전기표도를 나타냅니다. 아세트 아닐라이드 용액은 불순물이 없어야하기 때문에 하나의 높은 피크 만 보여줍니다. 피크 최대값에 대한 검출 시간은 전기삼투압 흐름의 이동 시간을 나타내며 상호 작용 계산에 사용됩니다.

ACE 실험 중 AtHIRD11 샘플의 이 전기표상은 SDS 및 금속 이온이 없는 상태에서 수행되었습니다. CGE 전기표상에서 나온 두 가지 불순물 외에도, 단백질 자체와 관련된 적어도 5개의 피크가 존재합니다. 피크 6에 대한 다양한 금속 이온의 존재 하에서 측정된 이동 시간 변화에 대한 그래픽 평가가 여기에 나와 있습니다.

계산된 값 Delta R over RF로 표시됩니다. 각 결과는 단백질 금속 이온 복합체를 담당하는 전반적인 변화로 표시된 값과 기호에 의해 얼마나 강한 변화가 발생했는지를 나타냅니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 CGE 상호 작용을 포함하여 8시간 내에 한 명의 상호 작용 파트너를 위해 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시간이 지남에 따라 분해 생성물이 증가할 수 있으므로 장시간 측정을 위해 단백질 용액을 변경하고 보다 정확한 결과를 얻기 위해 Tris Buffer 용액을 변경하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 모세관을 절단하고 청소하는 방법과 친화성 모세관 전기영동 방법을 설정하여 본질적으로 무질서한 단백질의 결합 거동을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.