Name: AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 모세관 젤 전기이동법과 친화성 모세관 전기이동법을 이용하여 본질적으로 무질서한 단백질의 금속 이온 결합 특성을 분석하는 방법을. 이 기법은 최소한의 장비로 빠른 결과를 얻을 수 있어 단백질-리간드 상호작용 연구에 유용합니다.

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우리 감사 감사 Masakuza 하 라 (녹색 과학 연구 및 기술, 시즈오카 대학, 일본) AtHIRD11 단백질 샘플 제공.

1입니다. 모 세관 전기 이동 법 장비의 준비
<ol><li>
모세를 준비
	<ol>
<li>유리 커터를 사용 하 여 잘라 베어-융합 된 실리 카 폴 외부 코팅 및 50 µ m의 내부 직경 모 세관 (CGE 실험)에 대 한 33 cm과 30 cm (에이스 실험)에 대 한 긴 모세 혈관. 유리 접시에 절단을 수행 합니다. 참고: 2 다른 실험 설정 2 가지 악기에 대 한 개발 되었다. 을 다른 악기에 그들을 사용 하려면 적절 한 방법을 전송 수행할 수 있다 고 모 세관 길이 악기의 허용된 길이를 조정할 수 있다.</li>
		<li>펜을 사용 하 여 ACE 실험 (효과적인 길이)에 대 한 세관의 한쪽 끝에서 21.5 cm에서 1 cm 넓은 탐지 창 CGE 실험에 대 한 세관의 한쪽 끝에서 24.5 cm의 거리에서의 중앙을 표시.</li>
		<li>횃불, 0.5 cm 마크 전후와 레코딩에 의해 모세 혈관에서 구체의 외부 코팅을 제거 합니다. 마찬가지로, 모세의 양 끝에서 코팅의 1 cm를 제거 하는 횃불을 사용 합니다. 참고: 효과적인 길이 달라질 수 있습니다 약간 이후 사용 하는 모 세관 전기 이동 법 악기에 의존.</li>
		<li>에탄올과 부드러운 조직 검색 창과 모 세관의 끝 청소. 참고: 비 코팅된 모세 혈관은 덜 유연 하 고 휴식을.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모 세관을 설치
	<ol>
<li>콘센트 근처 검색 창 CE 시스템에는 모 세관을 설치 합니다. 참고: 다양 한 CE 악기 모델은 모세 혈관에 대 한 다른 지주 시스템이 있다. 대 한 정확한 지침은 사용된 악기의 설명서를 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 된 솔루션
<ol><li>CGE 분석에 대 한 솔루션을 준비
	<ol>
<li>트리 스 (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) 준비-pH 8.0에서 SDS 버퍼 (100 mM/1% w/v).<ol>
<li>호흡 마스크와 부스를 사용 하 여 100 mL 비 커에 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS)의 1.00 g 무게에 대 한.</li>
			<li>100 mL 비 커에 트리 스의 1.21 g를 추가 하 고는 자력에 이온된 물 50 mL 및 자석 저 어 막대를 사용 하 여 해산.</li>
			<li>솔루션에 pH 전극을 넣고 8.0 1.0 M HCl을 사용 하 여 pH를 조정.</li>
			<li>100ml 부피 플라스 크에 솔루션을 이온된 수 표까지 추가. 어떤 거품 형성을 피하기 위해 부드럽게 그것을 흔들어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1 M NaOH 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100ml 부피 플라스 크에 NaOH의 4.0 g 무게. 표까지 1 M 주식을 이온된 수로 그것을 채우십시오.</li>
			<li>10 mL 전구 피 펫을 사용 하 여 다른 100 mL 부피 플라스 크에 10 mL이이 솔루션의 전송 하 고 이온을 제거 된 물으로 표까지 작성.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1 M HCl 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>10 M HCl의 10 mL를 100 mL 부피 플라스 크 10ml 부피 피 펫을 사용 하 여 투입 하 고 이온을 제거 된 물으로 표까지 작성. 0.1 M HCl을 얻기 위해이 단계를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>1 mL 튜브에 단백질의 0.5 밀리 그램 무게. micropipette 2.1.1 단계에서 트리 스-SDS 젤 버퍼의 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>어떤 거품 형성 및 단백질의 저하를 피하기 위해 부드럽게 흔들어 단백질 분해. 참고: 사용 ultrasonication 단백질 설명; 해산 될 수 없다 솔루션의 모든 난방을 하지 마십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>튜브에는 솔루션을 작성.<ol>
<li>0.22 μ m polyvinylidene 불 소 (PVDF) 유리병에 직접 적절 한 주사기를 사용 하 여 필터링을 통해 각 솔루션을 필터링 합니다. 참고: 젤 포함 된 솔루션에 대 한 역 압력 높을 수 있다 그것의 높은 점도 때문.</li>
			<li>총에서 15 병을 준비 하 고 어떤 에러를 피하기 위해 각각을 표시 합니다.<ol>
<li>3 튜브를 pH 8에서 상용 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 젤 버퍼에 채워 넣어 라. 참고: 상용 SDS 젤 버퍼를 사용 하 여 더 정확한 결과를 제공합니다.</li>
				<li>홍 조에 대 한 0.1 M NaOH와 0.1 M HCl과 1 유리병 1 유리병을 작성.</li>
				<li>샘플 솔루션 1 유리병을 채우십시오.</li>
				<li>이온된 수, 이온된 수 (튜브 찍기)의 0.1 mL와 4 튜브로 5 튜브를 채우십시오. 참고: 수영 튜브 각 실행 전에 모 세관의 홍 조 중 폐기물 튜브로 사용 됩니다. 모 세관 끝 물에 어떤 젤 잔류물을 씻어 위해 감소 됩니다.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>에이스 분석에 대 한 솔루션을 준비
	<ol>
<li>1 M NaOH 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>100ml 부피 플라스 크에 NaOH의 4.0 g 무게.</li>
			<li>표까지 1 M 주식을 이온된 수로 그것을 채우십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1 M NaOH 솔루션에서 0.1 M ethylendiaminetetraacetic 산 (EDTA)를 준비 합니다.<ol>
<li>10 mL 전구 피 펫을 사용 하 여 100 mL 부피 플라스 크에 0.1 M NaOH의 10 mL를 전송 합니다. 이온된 물으로 표까지 그것을 채우십시오.</li>
			<li>그리고 무게 보트에 EDTA의 2.42 g 무게 0.1 M NaOH의 100 mL에 고체 화합물을 분해.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tris 버퍼 (30mm) 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>500 mL 비 커에 트라이앵글, 3.63 g의 이온을 제거 된 물, 그리고 저 어 바 200 mL를 추가 합니다. 비 커를 저 어 접시에 놓고 스위치를 합니다.</li>
			<li>PH 미터 전극을 비 커에 넣고 pH 7.4 0.1 M HCl을 사용 하 여를 조정.</li>
			<li>이온된 물으로 1l 부피 플라스 크에 표까지 채우기 솔루션을 채우십시오. 참고:이 절차는 반복 또는 더 큰 부피 플라스 크 1l 이상이 전체 분석 필요 필요 하다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Acetanilide electroosmotic 교류 (EOF) 준비-마커 (60 µ M) 솔루션.<ol>
<li>100ml 부피 플라스 크에 6 mg acetanilide와 Tris 버퍼의 100 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>초음파 목욕에서 부피 플라스 크를 넣고 30 분 동안 그것을 전환.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플 (1 mg/mL) 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>정밀 균형에 0.5 mL microcentrifuge 튜브를 넣고 튜브에 동결된 AtHIRD11 분말의 0.3 mg을 추가.</li>
			<li>micropipette를 사용 하 여 30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4)의 0.3 mL 튜브에 추가. 단백질을 분해 하는 신중 하 게 튜브를 흔들어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligand 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>CaCl2 (5mm) 재고 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>무게 배, 분석 균형에 넣고 무게 CaCl236.76 mg * H2o.</li>
				<li>CaCl2플러시 micropipette를 사용 하 여 * H2O는 무게에서 이전 준비 Tris 버퍼 50ml 부피 플라스 크에 보트.</li>
				<li>부피 측정 플라스 크는 마크까지 Tris 버퍼 채우십시오.</li>
			</ol>
</li>
			<li>나머지 재고 솔루션 (5mm)를 준비 합니다.<ol>
<li>반복 단계 다른 금속을 사용 하 여 2.2.6.1 CaCl2대신 소금 * H2O [MgCl2: 23.80 mg, BaCl2: 26.02 mg, Sr (3)2: 52.91 mg, MnCl2: 31.46 mg, 엔지니어링4: 52.91 mg, CoCl 2* 2 H2소개할 41.47 mg, CuCl2* 2 H2소개할 42.62 mg, ZnCl2: 3.41 mg, 및 NiCl2* 6 H2소개할 59.43 mg]. 참고: ZnCl2 솔루션은 0.5 m m의 농도. 농도 10의 요인에 의해 감소 되었다 이온 및 모 세관 내벽 사이의 강한 상호 작용 관찰 했다, 이후4.</li>
			</ol>
</li>
			<li>500 µ M CaCl2 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>CaCl2 재고 솔루션의 10 mL를 100 mL 부피 플라스 크에 넣어.</li>
				<li>부피 측정 플라스 크 마크 Tris 버퍼를 플라스 크를 흔들어 있습니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>250 µ M CaCl2 솔루션을 준비 합니다.<ol>
<li>CaCl2 재고 솔루션의 5 mL를 100 mL 부피 플라스 크에 넣어.</li>
				<li>부피 측정 플라스 크 마크 Tris 버퍼를 플라스 크를 흔들어 있습니다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>다른 재고 솔루션 2.2.6.3-2.2.6.4 단계를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>튜브에서 솔루션을 작성 합니다. 참고: 모든 반복된 실행 입구 및 출구 튜브 집합이 필요합니다. 입구와 출구에서 신선한 ligand 솔루션의 사용 각 실행 후 마이그레이션 시간에 교대를 감소 시킨다.<ol>
<li>10 mL 주사기에 250 µ M CaCl2 솔루션을 작성 합니다.</li>
			<li>위에 0.22 μ m PVDF 필터 주사기와 푸시 솔루션의 2 mL 주사기를 사용 하 여이 필터링된 솔루션을 삭제 하는 필터를 통해.</li>
			<li>최대 허용된 볼륨까지 10 튜브 주사기의 나머지 250 µ M CaCl2 솔루션을 채우십시오. 250 µ M CaCl 2 솔루션 입구 유리병으로 각각 표시 합니다.</li>
			<li>될 때까지 250 µ M CaCl2 솔루션으로 반 가득 10 튜브를 입력 합니다. 250 µ M CaCl 2 솔루션 콘센트 유리병으로 각각 표시 합니다.</li>
			<li>솔루션에 대 한 다른 금속 포함 하는 소금 2.2.7.4 2.2.7.1-단계 반복 합니다.</li>
			<li>대신 30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 솔루션을 사용 하 여 입구와 출구 튜브의 모든 쌍에 대 한 단계를 반복 합니다. 참고: 30 mmol/L Tris 버퍼 pH 7.4 실행 사이 금속 이온의 부재에는 단백질에 대 한 마이그레이션 시간 데이터를 얻기 위해 사용 됩니다. EOF에 변화를 무시 하기 위해 필요 하다.</li>
			<li>한 유리병 대신 acetanilide EOF 표식 (60 µ M) 솔루션을 사용 하 여 위의 단계를 반복 합니다. 또한, 대신 샘플 (1 mg/mL) 솔루션을 사용 하 여 이러한 단계를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 모 세관 젤 전기 이동 별거
참고: 준비 Nachbar 외 에 의해 이전 작업에서 설명한 방법에 따라 분리 4.
<ol><li>
분석 준비
	<ol>
<li>
상태는 모 세관
		<ol>
<li>23 ° c 온도 설정</li>
			<li>0.1 M NaOH와 2.5 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
			<li>0.1 M HCl와 2.0 바에서 5 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
			<li>이온을 제거 된 물으로 2.0 바에서 2 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
SDS 젤 버퍼 채우기
		<ol>
<li>PH 8.0에 상용 SDS 젤 버퍼에 2.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 채우십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
각 분리 실행 전에 모 세관을 플러시
		<ol>
<li>0.1 M NaOH와 4.0 바에서 3 분 모 세관을 플러시.</li>
			<li>0.1 M HCl로 4.0 바에서 1 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
			<li>4.0 바 이온을 제거 된 물에서 1 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
			<li>SDS 젤 버퍼 4.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
분리를 실행
	<ol>
<li>Hydrodynamically 0.1 바 입구에 4 분을 적용 하 여 CGE 실험 (단계 2.1.4)에 대 한 샘플 솔루션을 주입.</li>
		<li>-16.5 적용 kV 및 25 분 모 세관의 양쪽 끝에 2.0 바의 압력.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 선호도 모 세관 전기 이동 분석
참고: 준비 Nachbar 외. 이전 작품에서 설명 하는 방법에 따라 분리 4 및 Alhazmi 외. 5.
<ol><li>
상태는 모 세관
	<ol>
<li>23 ° c 온도 설정 참고: 온도 게시 된 프로토콜에 따라 사용 되 고 다른 온도4,5로 변경할 수 있습니다. 그러나, 상호 작용 온도에 의존 하 고 그에 따라 변경 됩니다.</li>
		<li>40 분 0.1 M NaOH와 2.5 바에서 모 세관을 플러시.</li>
		<li>이온을 제거 된 물으로 1.0 바에서 10 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
		<li>30 mM Tris 버퍼 (pH 7.4) 1.0 바에서 30 분 동안 모 세관을 플러시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
에이스 방법에 대 한 준비
	<ol>
<li>Ligands 없이 측정을 위한 방법을 준비 합니다. 참고: Acetanilide 추가 되지 않았습니다 샘플 솔루션에 그것 위장 2 단백질 봉우리로.<ol>
<li>0.1 m M EDTA 솔루션 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.</li>
			<li>이온을 제거 된 물으로 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.</li>
			<li>평형에 대 한 트리 스 버퍼와 2.5 바에서 1.5 분 모 세관을 씻어.</li>
			<li>6 0.05 바와 변화는 입구에서 s 및 Tris 버퍼 튜브에 콘센트 튜브 acetanilide 솔루션을 주입.</li>
			<li>2.4 0.05 바 적용 s 모 세관 더 안쪽의 끝에서 acetanilide 솔루션을 밀기 위하여.</li>
			<li>10.0 적용 6 분 kV 200의 파장에서 acetanilide 피크 감지 nm.</li>
			<li>4.2.1.1 단계를 반복 합니다. -4.2.1.6. 단백질을 사용 하 여 샘플 acetanilide 솔루션 대신 고 모든 단백질 봉우리를 감지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligands와 측정에 대 한 메서드를 준비 합니다.<ol>
<li>0.1 m M EDTA 솔루션 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.</li>
			<li>이온을 제거 된 물으로 2.5 바에서 1 분 동안 모 세관을 씻어.</li>
			<li>평형에 대 한 리간드 솔루션 2.5 바에서 1.5 분 모 세관을 씻어.</li>
			<li>6 0.05 바와 변화는 입구에서 s와 리간드를 포함 하는 버퍼 튜브에 콘센트 튜브 acetanilide 솔루션을 주입.</li>
			<li>2.4 0.05 바 적용 s 모 세관 더 안쪽의 끝에서 acetanilide 솔루션을 밀기 위하여.</li>
			<li>10.0 적용 6 분 kV 200의 파장에서 acetanilide 피크 감지 nm.</li>
			<li>단계 4.2.2.1-4.2.2.6 acetanilide 솔루션 대신 단백질 견본을 사용 하 여 반복 하 고 모든 단백질 봉우리를 감지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>또는 다양 한 단백질-금속 이온 상호 작용 ( 대표 결과에서 설명)에 대 한 충전 크기 비율에 있는 변화를 계산 하려면 4.2.1 및 4.2.2 단계를 반복 합니다.<ol>
<li>모든 60 h 후 신선한 한 단백질 해결책을 변경 합니다. 참고:이 시점에서, 실험 수 일시 정지 됩니다. 이 절차는 적어도 반복된 10 x 피크 패턴 실행 실행에서 약간 다르므로 ligands의 각 농도 대 한. 솔루션 60 h 이상 사용 하는 경우 변이 너무 커질.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
메서드 실행
		<ol>
<li>단계 4.2.2, 알카라인 지구 ligand 솔루션 (CaCl2, MgCl2, BaCl2및 SrCl2 솔루션)을 사용 하 여 아래 설명 된 메서드를 실행 합니다.</li>
			<li>단계 4.2.2, 알카라인 지구 ligand 솔루션 대신 MnCl2, 엔지니어링4, CoCl2, CuCl2, ZnCl2및 NiCl2 솔루션을 사용 하 여 아래 설명 된 방법을 사용 하 여 계속 합니다. 참고: 후자의 전이 금속 염화는 모 세관으로 강한 상호 작용 그리고 완전히 제거할 수 없습니다. 이러한 상호 작용 결과에 마이그레이션 시간에서 실행을 이동합니다. 따라서, 그들은 다른 금속 이온 후 조사 되었다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

모든 CE 실험, 모 세관의 준비는 중요 한 단계 이다. 작은 직경을 가진 유리 튜브 때문에, 처리 되 고 때 코팅을 제거 하는 관광 명소에 쉽게 끊을 수 있다. 에 모 세관의 설치는 매우 신중 하 게 이루어져야 한다.
주로 에이스 메서드를 사용 하 여 중요 한 단계는 실험적인 체제에 관계 한다. 다른 중요 한 단계는 오른쪽 샘플 주입 매개 변수를 찾아내고 있다. 샘플의 주입된 양을 충분히 높은 봉우리를 수 있다. 그러나, 그것을 오버 중복 봉우리와 제대로 해결된 피크 패턴 발생할 것 이다. 때 삽입 된 볼륨 감소, 프로그램된 주입 압력을 도달 하는 악기에 대 한 시간이 좀 걸립니다 이후 주입 시간 대신 사출 압력 감소는 것이 좋습니다.
비정상적으로 넓은 봉우리는 다른 단백질 샘플에 대 한 찾을 수 있습니다. 이 패턴 전압을 증가 의해 영향을 받을 수 있습니다. 따라서, 봉우리 좁은 고 분리 시간이 줄어듭니다. 그럼에도 불구 하 ...

식물은 다른 많은 생명체 보다 자신의 환경에 더 의존. 때문에 식물은 다른 곳으로 이동할 수 없습니다, 그들은 변화 (예를 들면, 가뭄, 추위와 높은 소금 농도) 그들의 주위에 있다. 따라서, 더 높은 식물 dehydrins, 높은 염 분에 관련 된 세포 스트레스를 줄이기 위해 다양 한 작업을 수행 같은 전문된 스트레스 단백질을 개발 했다. 이 단백질 셀 안에 물과 이온 바인딩, 바인딩 Cu2 +로 산화 스트레스를 감소-이온, 인지질으로는 cytoskeletons와 상호 작용 하는 고. 또한, 바인딩 Zn2 +-이온이이 단백질 녹음 방송 요인의 역할을 수 있습니다. 그들의 능력을 바인딩할 캘리포니아2 +-이온 인 산화 또한 후 보고1.
이 단백질의 다기능 동작 소수 성 아미노산 잔류물의 부재와 관련이 있습니다. 따라서, 그들은 부족 펩 티 드 사슬 및 또한 제한 구조 내부의 소수 성 상호 작용. 그러나, 이러한 단백질 부족 제한적인 구조, 때문에 그들은 동일한 조건 하에서 다른 conformers 차지할 수 있습니다. 따라서, 그들은 설명할 수 있습니다 최고의 단일 구조 아니라 구조의 앙상블. 이러한 속성 가진 단백질 단백질 (IDPs) 본질적으로 무질서 하 고 스트레스 단백질 및 진 핵 세포2다른 통로 사이 누화에 대 한 널리 사용 되는 개념으로 알려져 있다.
이러한 스트레스 관련 IDPs 중 하나는 AtHIRD11입니다. 그것은 대부분 매우 가뭄 표현 IDPs 애기 thaliana중 하나입니다. 따라서, 다른 conformers 충전 비율, 그들의 효과적인 반경으로 분리 될 수 있다 그리고 모 세관 전기 이동 법 (세 륨) 추가 수사를 위해 사용 되었습니다. 이전 에이스 실험 AtHIRD11와 Cu2 +-, Zn2 +-, Co2 +및 Ni2 +같은 전이 금속 이온 간의 상호 작용을 시연-이온. 하 라 외 에 상세한 결과 찾을 수 있습니다. 3 그리고 Nachbar 외. 4.
에이스 메서드를 여기에서 사용 될 것입니다 우리의 이전 저서6을 기반으로 합니다. 그러나, 단백질 견본을 EOF 표식 acetanilide 추가 적합 하지 않습니다. AtHIRD11 넓은 피크 패턴을 표시 하 고 두 봉우리를 위장 것 샘플에 EOF 표식 추가. 따라서, 표시자는 별도 실행에 사용 됩니다. 바인딩 동작을 검사 하기 전에 그것에서 다른 conformers 이전 실험 중에 발견 하는 봉우리는 확인 된다. 따라서, CGE는 단백질 conformers 사이 구별 하는 데 사용 됩니다는 포스트 번역 상 수정 단백질, 및 그들의 다른 대 중에 의해 AtHIRD11의 조각 같은 불순물. 그 후, 다양 한 다른 금속 이온으로 특징이 AtHIRD11 샘플의 바인딩 동작 조사 이다.
이 문서의 목적은 다른 conformers의 바인딩 동작에 차이 평가 하기 위해 IDP와 샘플의 다른 구성 요소를 구분 하는 실험 설치를 설명 하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>AtHIRD11 샘플</td><td>시즈오카 대학(그룹 교수 M. Hara)</td><td>-</td><td>>Escherichia coliBarefused silica capillary에서 발현<> <emArabidopsis thaliana/em의 데하이드린 단백질</td></tr> <tr><td></td><td>Polymicro Technologies (Phoenix, USA)</td><td>106815-0017</td><td>TSP050375, 50 &mu; m 내경, 363 &mu; m 외경, 폴리이미드 코팅</td></tr><tr><td>Agilent 1600A</td><td>Agilent Technologies(독일 Waldbronn)</td><td>는 더 이상 사용할 수 없음</td><td>모세관 전기영동 기기; Agilent 7100 CE를 대신 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Agilent 7100 CE</td><td>Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)</td><td>G7100A</td><td>모세관 전기영동 기기</td></tr><tr><td>Injekt 2 mL</td><td>B. Braun (Melsungen, Germany)</td><td>4606051V</td><td>여과용 주사기</td></tr><tr><td>Rotilabo 주사기 필터</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)</td><td>KY62.1</td><td>PVDF 멤브레인 필터 용액 여과</td></tr><tr><td>용 멤브레인 필터Eppendorf Research 플러스 10 &mu; L</td><td>Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)</td><td>3121 000.023</td><td>시료 처리용 마이크로 피펫</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 10 &mu; L</td><td>Eppendorf (Wesseling-Berzdorf, Germany)</td><td>3121 000.120</td><td>리간드 용액 취급용 마이크로 피펫</td></tr><tr><td>Bulb pipette 10 mL</td><td>Duran Group GmbH(Mainz, Germany)</td><td>24 338 08</td><td>Preparing theNaOH</td></tr><tr><td>solution Bulb pipette 25 mL</td><td>Duran Group GmbH(Mainz, Germany)</td><td>24 338 14</td><td>Preparing the ligand solution</td></tr><tr><td>Duran glas volumetric flask 25 mL</td><td>Duran Group GmbH(Mainz, Germany)</td><td>24 671 1457</td><td>리간드 원액 준비</td></tr><tr><td>Duran glas 부피 플라스크 10 mL</td><td>Duran Group GmbH(Mainz, Germany)</td><td>24 671 1054</td><td>리간드 원액 준비</td></tr><tr><td>Proteome Lab SDS MW Gel Buffer</td><td>Beckman Coulter (Brea, USA)</td><td>comercially not available more</td><td>capillary gel 전기영동 중 분리 / 대체 SDS 완충액: Bio-Rad Laboratories의 CE-SDS 런 버퍼(M&uuml; nchen, Germany) 카탈로그 번호: 1485032&nbsp;</td></tr><tr><td>아세타닐라이드</td><td>시그마-알드리치(독일 스타인하임)</td><td>397229-5G</td><td>전기삼투압 흐름 마커</td></tr><tr><td>망간(II) 클로라이드</td><td>시그마-알드리치(독일 스타인하임)</td><td>13217</td><td>리간드</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치(독일 스타인하임)</td><td>431788-100G</td><td>헹굼 성분</td></tr><tr><td>염화바륨</td><td>시그마-알드리치(독일 스타인하임)</td><td>202738-5G</td><td>리간드</td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich (독일 스타인하임)</td><td>71729-100G</td><td>모세관 겔 전기영동용</td></tr><tr><td>용해 단백질 염화 니켈(II) 육수화물</td><td>Sigma-Aldrich(독일 스타인하임)</td><td>654507-5G</td><td>리간드</td></tr><tr><td>셀레늄(IV) 염화물</td><td>Sigma-Aldrich(독일 스타인하임)</td><td>323527-10G</td><td>리간드</td></tr><tr><td>2- 아미노 -2- 하이드 록시 - 메틸 프로판 -1.3- 디올 (트리스)</td> <td>시그마 알드리치 (독일 스타인 하임)</td> <td>252859-100G</td><td>완충 성분</td></tr><tr><td>아연 (II) 클로라이드</td><td>머크 밀리 포어 (독일 다름슈타트)</td> <td>1088160250</td><td>리간드</td></tr><tr><td>질산 스트론튬 질산</td><td>머크 밀리 포어 (독일 다름슈타트)</td> <td>1078720250</td><td>리간드</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>머크 밀리 포어 (독일 다름슈타트)</td><td>1371015000</td><td>리간드</td></tr><tr><td>37% 염산</td><td>Merck Millipore (독일 다름슈타트)</td><td>1003171000</td><td>pH</td></tr><tr><td>조정 구리(II) 염화물 이수화물</td><td>Riedel-de Ha&euml; n (Seelze, 독일)</td><td>31286</td><td>Ligand</td></tr><tr><td>Sonorex Longlife RK 1028 CH 45L</td><td>Allpax (Papenburg, Germany)</td><td>10000084; 0</td><td>초음파 수조</td></tr><tr><td>Agilent ChemStation Rev. 8.04.03-SP1</td><td>Agilent Technologies (Waldbronn, Germany)</td><td>G2070-91126</td><td>CE 기기 작동, 데이터 수집 및 평가를 위한 소프트웨어 패키지</td></tr></tbody></table>

athird11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

식물은 강하게 그들의 환경에 따라 달라 집니다. 스트레스 변화 (예:가뭄, 높은 염 분)을 조정 하기 위하여 더 높은 식물 진화 산화 및 삼투성 스트레스를 줄이기 위해 본질적으로 무질서 단백질 (IDPs)의 클래스. 이 문서는 애기 thaliana에서 IDP AtHIRD11의 다른 conformers의 바인딩 동작을 설명 하기 위해 모 세관 젤 전기 이동 법 (CGE)와 이동성 교대 선호도 전기 이동 법 (ACE)를 사용 합니다. CGE는 AtHIRD11의 순도 확인 하 고 복잡 한 피크 패턴에 대 한 이유로 서 조각, posttranslational 수정 및 기타 불순물을 제외 하는 데 사용 됩니다. 실험의이 부분에서 다른 샘플 구성 요소는 그들의 다른 대 중에 의해 모 세관 내부 점성 젤으로 구분 하 고 다이오드 배열 검출기 감지. 그 후, 다양 한 금속 이온으로 샘플의 바인딩 동작은 에이스에 의해 조사 하 고 있다. 이 경우에 ligand 버퍼 솔루션에 추가 되 고 마이그레이션 시간에 변화 여부 바인딩 이벤트 발생 여부를 결정 하기 위하여 측정 된다. CGE와 에이스의 조합 IDP의 바인딩 동작을 사용 하 여의 장점 중 하나는 젤 전기 이동 법 및 바인딩 분석 결과를 자동화 가능성입니다. 또한, CGE 고전 젤 전기 이동 법 보다 탐지의 하한값을 보여줍니다 이며 에이스 빠른 방법에 있는 ligand 바인딩 방식으로 확인할 수 있습니다. 또한, 에이스 금속 이온 보다 다른 청구 종에도 적용할 수 있습니다. 그러나, 실험 바인딩에 대 한이 메서드를 사용 하 여 바인딩 사이트 수를 결정 하는 기능에 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고, CGE와 에이스의 조합 다 충전된 ligands 향해 어떤 단백질 샘플의 바인딩 동작을 특성화에 대 한 적응 될 수 있다.

그림 1 에서는 CGE 실험 기간 동안 얻은 AtHIRD11 샘플에 대 한 electropherogram. 펩 티 드 크기 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 최대 수 4 큰 질량은 고 그대로 단백질을 나타냅니다. 작은 봉우리 2와 3는 작은 불순물을 (예, 저하 제품)를 나타냅니다. 첫 번째 피크와 전에 기준선의 불일치 또한 단백질 샘플 없이 재현 수 있습니다. 따라서, 그것은 관련이 SDS 자체 젤과 어떤 샘플 관련 불순물을 대표 하지 않는다.
그림 2 는 ACE 실험 동안 acetanilide에 대 한 electropherogram를 나타냅니다. 이후 아무 불순물 있어야 acetanilide 솔루션 1 높은 피크를 보여줍니다. 최대 피크에 ...

이 프로토콜 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 모 세관 젤 전기 이동 법 및 충전된 ligands에 대 한 빠른 바인딩 심사를 단백질 샘플의 특성을 결합합니다. 그것은 본질적으로 무질서 단백질 등 유연한 구조를 가진 단백질에 대 한 다른 conformers에 대 한 바인딩 차이 확인 하려면 권장.

AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

이 방법은 금속 철 결합으로 인한 구조적 변화와 같은 내인성 장애 단백질의 구조론에 관한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장비가 거의 필요하지 않고 결과를 매우 빠르게 얻을 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Matthias Stein입니다.시작하려면 유리판에 유리 절단기를 사용하여 폴리아미드 외부 코팅과 내경 50미크론이 있는 순수 용융 실리카 모세관을 33cm 및 30cm 길이로 자릅니다. 펜을 사용하여 CGE 실험의 경우 모세관의 한쪽 끝에서 24.5cm, ACE 실험의 경우 모세관의 한쪽 끝에서 21.5cm 떨어진 곳에 1cm 너비의 감지 창 중앙을 표시합니다. 토치를 사용하여 각 표시 전후 0.5cm 전후에 폴리아미드 외부 코팅을 태웁니다.마찬가지로, 토치를 사용하여 모세혈관 양쪽 끝에 있는 코팅을 1cm 제거합니다. 그런 다음 에탄올과 연조직을 사용하여 모세혈관 끝과 감지 창을 청소합니다. 배출구 근처에 감지 창이 있는 CE 시스템에 모세관을 설치합니다.용액을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 250마이크로몰의 염화칼슘 용액을 사용하여 10ml 주사기를 채웁니다. 그런 다음 0.2미크론 PVDF 필터를 주사기에 부착하고 필터를 통해 용액 2ml를 밀어 넣어 버립니다. 주사기에 남아 있는 염화칼슘을 사용하여 최대 허용 부피까지 10개의 바이알을 채웁니다.각 바이알에 250 마이크로몰 염화칼슘 용액 주입 바이알로 라벨을 붙입니다. 다음으로, 염화칼슘 용액을 사용하여 10개의 바이알을 반쯤 채웁니다. 각각을 250마이크로몰 염화칼슘 용액 배출구 바이알로 표시합니다.그런 다음 다른 금속염 함유 용액으로 유사한 방식으로 바이알을 채웁니다. 또한 각 주입구 및 배출구 바이알 쌍에 대해 30마이크로몰 Tris Buffer를 사용하여 유사한 주입구 및 배출구 바이알 세트를 준비합니다. 60마이크로몰 아세트아닐라이드 EOF 마커로 10개의 바이알을 채웁니다.그런 다음 밀리리터당 1밀리그램 샘플 용액을 사용하여 바이알 하나를 채웁니다. 분석을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 CGE 실험을 위해 샘플 용액을 유체역학적으로 주입하고 주입구에서 4분 동안 0.1bar를 적용하여 분리를 실행합니다. 그런 다음 모세관 양쪽 끝에 음의 16.5 킬로볼트와 2.0 bar의 압력을 25 분 동안 가합니다.리간드 없이 측정하기 위한 방법을 준비한 후, 먼저 0.1몰 EDTA 용액을 사용하여 2.5bar에서 1분 동안 모세관을 헹구어 리간드를 사용한 측정법을 준비합니다. 그런 다음 탈이온수를 사용하여 모세관을 헹굽니다. 다음으로, 리간드 용액을 사용하여 모세관을 평형을 이루고 2.5bar에서 1.5분 동안 헹굽니다.그런 다음 아세트아닐라이드 용액을 0.05bar에서 6초 동안 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 완충액 바이알이 포함된 리간드로 변경합니다. 0.05bar를 2.4초 동안 도포하여 아세트아닐라이드 용액을 모세혈관 끝에서 더 밀어 넣습니다. 10.0kV를 6분 동안 적용하고 200나노미터의 파장에서 자산 아세트아닐라이드 피크를 검출합니다.EDTA 탈이온수와 리간드 용액으로 모세관을 헹군 후 이전과 같이 단백질 샘플을 주입하고 주입구 및 배출구 바이알을 완충액 바이알이 포함된 새 리간드로 변경합니다. 또는 리간드를 사용하거나 사용하지 않고 측정을 반복합니다. 그런 다음 알칼리 토류 리간드 용액을 사용하여 방법을 반복합니다.마지막으로 다음 솔루션을 사용하여 동일한 방법을 수행합니다. 그런 다음 다양한 단백질 금속 이온 상호 작용에 대한 전하 크기 비율의 변화를 계산합니다. 여기에 표시된 것은 CGE 실험 중에 얻은 AtHIRD11 샘플에 대한 전기 표상도입니다.펩타이드 크기는 왼쪽에서 오른쪽으로 증가합니다. 피크 번호 4는 질량이 가장 크며 온전한 단백질을 나타냅니다. 더 작은 피크인 2와 3은 더 작은 불순물을 나타냅니다.이 그림은 ACE 실험 중 아세트아닐라이드에 대한 전기표도를 나타냅니다. 아세트 아닐라이드 용액은 불순물이 없어야하기 때문에 하나의 높은 피크 만 보여줍니다. 피크 최대값에 대한 검출 시간은 전기삼투압 흐름의 이동 시간을 나타내며 상호 작용 계산에 사용됩니다.ACE 실험 중 AtHIRD11 샘플의 이 전기표상은 SDS 및 금속 이온이 없는 상태에서 수행되었습니다. CGE 전기표상에서 나온 두 가지 불순물 외에도, 단백질 자체와 관련된 적어도 5개의 피크가 존재합니다. 피크 6에 대한 다양한 금속 이온의 존재 하에서 측정된 이동 시간 변화에 대한 그래픽 평가가 여기에 나와 있습니다.계산된 값 Delta R over RF로 표시됩니다. 각 결과는 단백질 금속 이온 복합체를 담당하는 전반적인 변화로 표시된 값과 기호에 의해 얼마나 강한 변화가 발생했는지를 나타냅니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 CGE 상호 작용을 포함하여 8시간 내에 한 명의 상호 작용 파트너를 위해 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시간이 지남에 따라 분해 생성물이 증가할 수 있으므로 장시간 측정을 위해 단백질 용액을 변경하고 보다 정확한 결과를 얻기 위해 Tris Buffer 용액을 변경하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.이 비디오를 시청한 후에는 모세관을 절단하고 청소하는 방법과 친화성 모세관 전기영동 방법을 설정하여 본질적으로 무질서한 단백질의 결합 거동을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

analysis-athird11-intrinsic-disorder-binding-towards-metal-ions

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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AtHIRD11 내장 장애 및 모 세관 젤 전기 이동 법 및 선호도 모 세관 전기 이동 법에 의해 금속 이온으로 바인딩 분석

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