Name: 치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 학습하세요 치과 임플란트용 티타늄과 지르코니아 재료에서 구강 바이오필름 형성을 평가하는 방법을. 고급 현미경 기술을 활용하여 박테리아 생존율과 형태학적 특성을 분석하고, 재료 선택이 미생물 부착 감소에 미치는 영향을 확인합니다.

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저자 감사 호세 아우 구 스토 Maulin 현미경 다중 사용자 실험실 (의 리 베이 라 오프 레 토 의학의 학교)에서 EDS와 sem의 그의 관대 한 지원에 대 한 분석 및 비디오 판에서 그의 관대 한 기술 지원에 대 한 브라 더 텍사스 마차.

이 연구는 리 베이 라 오프 레 토의 치과 학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 자원 봉사 참가자 서명 동의서 (2011.1.371.583 프로세스).
1. Biofilm 형성에서 제자리에
<ol><li>
참가자의 선택
	<ol>
<li>다음 포함 기준에 따라 환자 선택: 완전 한 치열과 구강 질환의 임상 표시 없이 건강 한 개인.</li>
		<li>다음 제외 기준에 따라 환자 제외: 임신, 수 유, 치과 카 리에 스, 치 주 질환 또는 지난 3 개월 동안, 흡연 자, 또는 치 주 상태에 영향을 미칠 수 있는 조직의 질환에 항생제 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Intraoral 장치 준비
	<ol>
<li>Alginate 인상을 통해 상 악 아치를 기록 합니다.</li>
		<li>유형 IV 돌 돌 가루 100 g을 물 19 mL을 추가 하 여 준비 합니다. 돌 상 악 아치의 모델을 만들 alginate 몰드에 붓으십시오.</li>
		<li>디자인과 테스트 표본 (티타늄과 세라믹 디스크)를 지원 하기 위해 아크릴 intraoral 장치 조작.<ol>
<li>NiCr 와이어 (0.7 m m에 직경) 교정 플라이어 # 139를 사용 하 여에서 못 벗어난 걸쇠를 조작 하 고 모델에 그들을 배치 합니다. 그들은 루프를 형성 하 위 구치 사이 클램프 위치, 각 와이어의 한쪽 끝을 구 부.<ol>
<li>치 간 시의 지역에서 루프를 적응. Occlusal에서 연락처의 포인트는 폐색과 방해를 하지 않도록 부드러운 곡률을 삽입 합니다. 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 접어 90 °를 확인 합니다.</li>
				<li>위 두 번째 어 금 니에 클램프를 맞게 적응 자 궁 경부 3에서 와이어의 곡률 (vestibular) 90 ° 아크릴에 보존에 대 한 클램프의 끝에 배를 (원심) 치아 윤곽. 참고: intraoral 장치에 적절 한 보존/안정성 제공, 보유 clasps 위 구치 원심 부분의 치과 아치의 양쪽에 두 번째 어 금 니 사이 배치 했다.</li>
			</ol>
</li>
			<li>제조업체의 지침에 따라 자체 경화 아크릴 수 지를 조작 하 고 3 m m 두꺼운 시트를 만들기 위해 플라스틱 단계 2 유리 접시 (interposed 두께 3mm 스페이서) 사이 아크릴 수 지를 누릅니다.</li>
			<li>소자의 디자인에 따라 모델의 경구개 지역에 아크릴 시트를 카 버, 중 합 전에 잉여 아크릴 수 지를 떨어져 트림.</li>
			<li>공고히 하는 매트릭스에 녹은 왁 스를 놓고 왁 스에 대 한 대기 금속 매트릭스 [10 밀리미터 직경, 2mm 두께 (78.5 m m2의 면적)]를 사용 하 여 왁 스 디스크 조작. 수동으로 아크릴 수 지, 그들의 2는 구치와 두 번째 어 금 니 옆 다른 2 사이 4 왁 스 디스크를 포함 합니다.</li>
			<li>20 분에 대 한 압축 공기의 미만 20 psi 압력 냄비에 유해 아크릴 수 지를 보자.</li>
			<li>전기 치과 실험실 핸드 피스와 커터 intraoral 장치를 완료 하 고 연마 고무 폴란드어.</li>
			<li>위에서 설명한 장비를 사용 하 여 입에 적당 한 적합을 위한 장치를 조정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
티타늄과 지 르 코니 아 표본의 준비 참고: 표본 (n = 14) 10 mm 직경에서 및 두께에서 2 m m 이며 78.5 m m2의 면적을가지고.<ol>
<li>감소 하는 abrasiveness의 수냉식된 sandpapers 표본 표면 폴란드어 (600, 1200, 2000 모래), 약 20 분. 참고:는 표본의 연마 0.2 µ m에서 표면 거칠기 표준화를 수행 했다.</li>
		<li>청소 하 고 소독 표본 및 액체 세제와 수돗물, intraoral 장치 다음 이소프로필 알코올 초음파 목욕을 사용 하는 15 분 흡수 성 종이 타 올 그들을 건조.</li>
		<li>비-독성 핫 멜 트 접착제 (그림 1)의 약 0.1 mL와는 표본 intraoral 구강 장치에 수정.</li>
		<li>구강에서 견본을 포함 하는 장치를 설치 합니다. 참고: 포함 하는 표본 intraoral 장치 48 h에 대 한 착용 한다. 장치 제거 하 고 환자는 먹고 구강 청소를 수행 하는 동안 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 저장 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 세균 생존 능력의 평가
참고: 샘플 크기 n = 10.
<ol><li>SYTO9의 3 µ L을 추가 하 여 염색 솔루션 준비 (녹색 형광 핵 산 염료)와 3 µ L propidium 요오드 화물 (빨간색 형광 핵 산 염색) 살 균의 1 mL의 증류수. 참고: 빛 으로부터 보호 하는 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>24-잘 접시에는 견본을 전송 하 고 모든 비 부착 한 세포를 제거 하는 PBS와 함께 그들을 씻어.</li>
	<li>Biofilm 포함 된 견본을 충당 하기 위해 형광 염료 솔루션의 적절 한 볼륨 (1 mL)을 추가 합니다. Disorganize는 biofilm를 하지 않도록 매우 신중 하 게 염료를 추가 합니다.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 하는 실 온에서 20-30 분에 대 한 견본 품 어.</li>
	<li>부드럽게 biofilm 샘플 어떤 과잉 염료를 제거 하는 멸 균 증류수로 씻는 다.</li>
	<li>유리 하단 접시에는 견본을 놓고 multiphoton 레이저 현미경 biofilm 분석에 대 한 검색을 수행 합니다. 참고: 세균성 세포 생존 능력 분석 multiphoton 현미경 시스템을 사용 하 여 실행 되었다. Propidium 요오드 화물의 형광 546/680의 여기/방출 파장 필터를 사용 하 여 검색 및 477/600 nm SYTO9에 대 한. 가져온 이미지의 크기는 5.16188 x 5.16188 m m, 각 표본 (78.5 m m2)의 전체 면적의 전체 면적의 33.94 %26.64 m m2 에 해당 했다. 이미지는 1024 x 1024 픽셀의 해상도 샘플의 가장 중앙 부분에서 만들어졌다. 빨강 채널 및 녹색 이미지는 별도로 피지 소프트웨어31를 사용 하 여 분석 되었다. 선택 도구를 사용 하 여 각 셀을 선택한 및 형광의 강도 빼서 이미지 배경 픽셀의 통합된 밀도 통해 측정 했다.</li>
</ol>3. 에너지 흩어지는 분광학 (EDS)에 의해 표본 화학 성분의 분석
참고: 샘플 크기 n = 3.
<ol><li>각 biofilm 무료 테스트 소재의 3 표본 선택 하 고 전자 빔 전압 10 kV32의 분산 에너지 분석기를 결합 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 각 시료의 2 가지 영역에서 화학 성분 평가.</li>
</ol>4. 전자 현미경 검사 법을 검사 하 여 세균성 Biofilm의 형태소 분석
참고: 샘플 크기 n = 1.
<ol><li>2.5%도 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼, pH 7.0-7.3, 24 h에에서 희석에 표본 immersing 하 여는 biofilm를 해결.</li>
	<li>PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).</li>
	<li>1 시간에 1% 오스뮴 tetroxide와 biofilm 접미사</li>
	<li>PBS 버퍼에 샘플을 세척 (pH 7.6 =).</li>
	<li>탈수 biofilm 샘플 신중 하 게, 에탄올 솔루션 (50%, 70%, 90%, 95%, 및 100%)의 농도 증가 그들을 유지. 참고: 100% 농도에서 에탄올의 3 교류를 수행 합니다. 총 탈수 단계 약 2 시간 걸립니다.</li>
	<li>임계점 건조 기에 견본을 전송 하 고 이산화탄소 (CO2)와 함께 여러 대체는 표본 건조 될 때까지.</li>
	<li>장치에서 말린된 견본을 제거 하 고 스캐닝 전자 현미경 소유자에 그들을 마운트.</li>
	<li>스퍼터-코트 120에 대 한 시료의 표면에 금 20 nm 층 s.</li>
	<li>스캐닝 전자 현미경 실에서 골드 코팅 된 디스크를 삽입 합니다. 각 표본, 가변 압력 하에서 20-30 kV와 650 X 배율12의 5 가지 다른 영역에서 이미지를 가져옵니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 세균성 세포 생존 능력 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 보 철 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 biofilm 형성을 평가 하기 위해 개발 되었다. 이 작업을 수행 하기 위해 biofilm 형성의 현장에 모델 intraoral 장치 시험 자료의 샘플 및 48 h에 대 한 동적 구강 환경에 노출 그들을 유지 하는 능력의 구성 설계 되었습니다. 장치는 편안 하 고 쉽게 삽입, 제거 및 청소 자원 봉사에 의해 고려 되었다. 그러나, 그것은 음성학과 미학에 거의 영향을 미치지는 간단 하 고 낮은-비용, 조작 하 고 표본 biofilm 구조의 중단 없이 쉽게 복구를 허용 보여주었다. 또한, 메서드는 세균 세포와 세포 외 매트릭스의 무결성의 보존 허용. 표본와 혀의 접촉 및 실험 기간 동안 디스크의 실수로 손실 제안 된 모델의 제한이 있습니다. 방법의 제한 최소화, intraoral 장치에 있는 디스크의 위치는 무작위로 배포; 또한, 디스크 비 독성 뜨거운...

박테리아 biofilms 복잡 한, 기능적 및 구조적으로 미생물 지역 사회 조직, 세포 외, 생물학적으로 활성 폴리머 매트릭스1,2합성 미생물 종의 다양성에 의해 특징. 생물 비 생물 적인 표면에 세균성 접착 침 glycoproteins1,,34주로 구성 된 인수 박막의 형성에 의해 앞에 있습니다. 미생물 및는 박막 사이의 약한 물리 화학 상호 작용 처음 설립 하 고 세균성 adhesins 인수 박막의 당단백질 수용 체 사이 강한 상호 작용에 의해 따라. 미생물 다양성 형성 multispecies 커뮤니티1,,34, , 이미 연결 된 박테리아의 수용 체에 보조 식민지 개척자의 coaggregation를 통해 점차 증가 5.
구두 microbiota 및 호스트와의 공생 관계의 항상성 구강 건강 유지에 중요 하다. 구두 biofilms 안에 dysbiosis 카 리에 스 그리고 치 주 질환2,5의 개발에 대 한 위험을 증가할 수 있습니다. 임상 연구는 치아 나 치아에 biofilm의 축적과 치은 염 또는 페리-임 플 란 트 mucositis6,7의 개발 원인-효과 관계를 보여 줍니다. 염증 과정의 진행 임 플 란 트8의 필연적인 손실과 peri implantitis 이끌어 낸다.
치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소는 세균성 식민 및 biofilm 형성9경향이 있습니다. 화학 성분 및 표면 지형 낮은 미생물 접착을 제공 하는 자료의 사용 정도와 요정 이식 질병9,10의 진행을 줄일 수 있습니다. 티타늄 임 플 란 트;에 대 한 보 철 abutments의 제조에 대 한 자료를 가장 많이 사용 되는 그러나, 세라믹 재료 최근에 도입 되었다 그리고 그들의 미적 속성 및 생체 적합성11,12티타늄 대신 인기를 얻고 있다. 또한 중요 한 것은, 세라믹 재료 미생물, 주로 그들의 표면 거칠기, 습윤, 및 표면 자유 에너지10,13때문에 살 일 걸 요 감소 잠재력 관련 되어 있다.
생체 외에서 연구 보 철 인접 표면9,14,15,,1617미생물 접착의 이해에 중요 한 발전에 기여 했다. 그러나, 구강, 전단 세력의 존재에 의해 뿐만 아니라 다양 한 온도 산도 및 양분 가용성 특징의 동적 환경이 이다 생체 외에서 실험 프로토콜18, 재현할 수 19. 이 문제를 해결 하려면 대신 advantageously 비보 전 분석10,20, 의 3 차원 구조를 유지 하는 biofilm 형성의 현장에 모델의 사용은 21 , 22 , 23 , 24.
구두 기판에 형성 된 biofilm의 복잡 한 구조의 분석 현미경 검사 법 기술 광학 밀도 문제25표시할 수 있는 사용을 해야 합니다. Multiphoton 레이저 스캔 현미경 biofilm 구조 분석26현대 옵션입니다. 그것은 적외선 파장, 펄스 femtoseconds27에 가까운 조명 소스와 비선형 광학의 사용에 의해 특징입니다. 이 메서드는 autofluorescence 자료 또는 자료 fluorophores, 비선형 광학 신호 제 2 고조파 발생으로 알려진 현상에서 파생 된에 의해 생성 된 이미지 외에 의해 표시의 이미지 수집에 대 한 표시 됩니다. Multiphoton 현미경의 장점 중27여기 빛 강도 의해 발생 하는 최소 세포 손상으로 얻은 좋은 이미지 깊이입니다.
Multiphoton 현미경에 의해 abiotic 표면에 biofilm의 생존 능력 분석, 형광 핵 산의 사용 다른 스펙트럼 특성을 가진 염료 그리고 세균성 세포에 침투 수 용량 필요28. 라이브 하 고 죽은 박테리아28,,2930사이의 시각적 차별화 Fluorophores SYTO9 (그린 형광) 및 propidium 요오드 화물 (레드 형광)를 사용할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물 SYTO9는 손상과 손상 된 막으로 세균 세포를 입력 하는 동안 손상 된 멤브레인과만 박테리아 침투. 두 염료 셀 안에 있는 경우, propidium 요오드 화물 핵 산에 대 한 큰 선호도 있으며 배 수량 SYTO9, 그것에 게 빨간28,30을 표시 합니다.
보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현.

<table><tbody><tr><td>Hydrogum 5</td><td>Zhermack 치과</td><td>C302070</td><td></td></tr><tr><td>Durone IV</td><td>Dentsply</td><td>17130500002</td><td></td></tr><tr><td>NiCr 와이어&nbsp;</td><td>Morelli</td><td>55.01.070</td><td></td></tr><tr><td>JET 자동 중합 아크릴</td><td>Cl&aacute; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>치과 왁스&nbsp;</td><td>클&아큐트; ssico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>압력 냄비&nbsp;</td><td>Essencedental</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sandpapers 600 그릿</td><td>NORTON</td><td>T216</td><td></td></tr><tr><td>사포 1200 그릿</td><td></td><td>NORTON T401</td><td></td></tr><tr><td>사포 2000 그릿</td><td>NORTON</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>금속 조직 연마기</td><td>Arotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소 프로필 알코올</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>핫멜트 접착제</td><td>TECSIL</td><td>PAH M20017</td><td></td></tr><tr><td>Filmtracer LIVE/DEAD 바이오필름 생존 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L10316</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 10 &마이크로; L</td><td>카스비</td><td>K8-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>파이펫 팁, 1,000 &micro; L</td><td>KASVI</td><td>K8-1000B&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트&nbsp;</td><td>KASVI</td><td>K12-024</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>AxioObserver 반전 현미경&nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon vision ii 레이저</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC</td><td>ZEISS</td><td>440452-9903-000</td><td></td></tr><tr><td>SDD 센서 - X-Max 20mm&sup2;</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타알데히드 용액</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>소듐 카코딜레이트 버퍼&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>97068&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</</td><td>>SIGMA-ALDRICH</td><td>S9638</td><td>인산염 완충 식염수 제조에 사용</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9791&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>1.06404</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>분석용 에탄올 절대 EMSURE</td><td>MERK</td><td>1.00983</td><td></td></tr><tr><td>CPD 030 임계점 건조기</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JSM-6610 시리즈 주사 전자 현미경</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD 050 스퍼터 코터</td><td>BAL-TEC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 biofilm 형성

Oral Biofilm Formation on Different Materials for Dental Implants

치과 임 플 란 트 및 보 철 그들의 구성 요소 세균성 식민 및 biofilm 형성 하는 경향이 있다. 제공 하는 낮은 미생물 접착 재료의 사용 정도와 요정 이식 질병의 진행을 줄일 수 있습니다. 보기는 구강 환경 복잡성과 구강 biofilm이, 치아와 치과 재료의 표면에의 한 biofilm 분석 수 있는 현미경 기술 필요. 이 문서에서는 일련의 프로토콜 비교 형태학 및 세포 수준에서 구두 biofilms 분석에 관련 된 방법으로 구두 biofilm 형성 티타늄 및 보 철 abutments에 대 한 세라믹 재료에 대 한 구현. 이 연구에 설명 된 대로 치과 족 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가를 제자리에 모델 방법론 타당성을 시연 함으로써 48 h biofilm의 만족 스러운 보존을 제공 합니다. Multiphoton 현미경 시험 자료에 형성 된 biofilm의 지역 담당자의 분석을 수 있습니다. 또한, fluorophores의 사용 및 multiphoton 현미경을 사용 하 여 이미지의 처리에는 세균 생존 능력의 분석을 미생물의 아주 이질적인 인구에 있습니다. 전자 현미경 검사 법 생물학 견본의 준비 biofilm, 좋은 해상도, 이미지 및 아무 유물의 구조 보존을 촉진합니다.

후 48 h 제자리에 성장의 biofilm의 식민 밀도 multiphoton 현미경 (시료의 총 스캔된 영역에 관하여 티타늄 및 지 르 코니 아 디스크에 식민지 지역의 비율에 의해이 연구에서 대표 되었다 26.64 mm2)입니다. 그림 2 3 시험된 재료의 표면에 세균성 식민 밀도를 나타냅니다. 캐스팅의 표면에 biofilm의 높은 밀도 관찰 되었다 가공된 티타늄 디스크 (0.0292 µ m2 와 0.0213 µ m2를 각각) 보다 지 르 코니 아 디스크 (0.0099 µ m2; p &lt; 0.05; Kruskal-Wallis 테스트, 뒤에 던의 테스트).
그림 ...

여기, 선물이 세균성 세포 생존 및 형태학 상 특성의 분석을 포함 하 여 치과 보 철물 abutments에 대 한 티타늄 및 지 르 코니 아 재료에 구두 biofilm 형성 평가 하는 프로토콜. 현장에서 모델 관련 강력한 현미경 검사 법 기술 된 구두 biofilm 분석에 사용 됩니다.

치과 임 플 란 트에 대 한 다른 자료에 구두 Biofilm 형성

Dental implants and their prosthetic components are prone to bacterial colonization and biofilm formation. The use of materials that provides low ...

치과 임플란트를 위한 다양한 재료에 구강 생물막 형성. 박테리아 생물막은 복잡하고 기능적으로, 구조적으로 조직된 미생물 군집으로, 세포 외, 생물학적으로 활성이 높은 고분자 기질을 합성하는 다양한 미생물 종을 특징으로 합니다. 치과 임플란트와 그 보철 구성 요소는 박테리아 집락화와 생물막 형성에 취약합니다.미생물 부착력이 낮은 화학적 조성 및 표면 지형을 가진 재료를 사용하면 임플란트 주위 질환의 유병률과 진행을 줄일 수 있습니다. 전반적인 환경의 복잡성과 구강 생물막 이질성을 고려할 때 치아 및 치과 재료 표면에서 생물막의 구조 분석을 가능하게 할 수 있는 현미경 기술이 필요합니다. 이 기사에서는 치과 임플란트를 위한 다양한 재료에서 구강 생물막 형성을 비교하기 위해 구현된 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.이 연구에서 생물막 형성의 사용과 관련된 단계는 다음과 같습니다 : 알긴산 인상을 사용하여 상악 아치를 기록하십시오. 알지네이트 인상에 Type IV 스톤을 부어 상악궁 모델을 제작합니다. 마이크로 크롬 와이어의 고정 클립을 제작하고 모델에서 찾습니다.제조업체의 지침에 따라 자가 경화 아크릴 수지를 조작하고 플라스틱 단계에서 두 개의 유리판 사이에 아크릴 수지를 눌러 3mm 두께의 시트를 만듭니다. 장치의 디자인에 따라 아크릴 시트를 모델의 구개 영역에 놓고 중합하기 전에 잉여 아크릴 수지를 잘라냅니다. 직경 10mm, 두께 2mm의 매트릭스를 사용하여 왁스 디스크를 제작합니다.아크릴 수지에 4개의 왁스 디스크를 삽입하고, 그 중 2개는 소구치 사이에, 다른 2개는 두 번째 어금니 옆에 삽입합니다. 아크릴 수지를 20파운드의 압축 공기 아래에서 압력 포트에서 20분 동안 중합시킵니다. 전기 핸드피스와 밀링 및 연마 지점을 사용하여 구강 내 장치를 마무리합니다.마모성이 감소하는 수냉식 사포로 시편의 표면을 연마합니다. 액체 세제와 수돗물, 이소프로필 알코올 초음파 수조로 표본을 15분 동안 세척합니다. 그런 다음 흡수성 종이 타월로 말리십시오.구강 내 장치의 표본을 무독성 핫멜트 접착제로 고정합니다. 구강에 표본이 들어있는 장치를 설치하십시오. 표본이 들어 있는 구강 내 장치는 48시간 동안 착용해야 합니다.3마이크로리터의 SYTO 9와 3마이크로리터의 프로피듐 요오드화물을 1ml의 멸균 증류수에 첨가하여 염색 용액을 준비합니다. 검체를 24웰 플레이트로 옮기고 PBS로 철저히 세척하여 비부착성 세포를 제거합니다. 생물막이 포함된 검체를 덮기 위해 적절한 양의 형광 염료 용액을 추가합니다.생물막이 엉망이 되지 않도록 염료를 매우 조심스럽게 첨가하십시오. 빛으로부터 보호된 실온에서 20-30분 동안 표본을 배양합니다. 멸균 증류수로 생물막 샘플을 부드럽게 세척하여 과도한 염료를 제거합니다.다광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 생물막 분석을 위해 표본을 유리 바닥 접시에 놓습니다. 얻어진 이미지의 크기는 5.16 x 5.16mm였으며, 이는 각 표본 전체 면적의 26.64제곱밀리미터 또는 전체 면적의 33.94%에 해당합니다. 이미지는 피지 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다.각 세포는 선택 도구를 사용하여 선택되었으며 형광 강도는 픽셀의 통합 밀도를 통해 측정되어 이미지 배경을 뺀 값으로 측정되었습니다. 각 테스트 재료의 3개 표본을 선택하고 분산 에너지 분광계에 연결된 주사 전자 현미경을 사용하여 각 표본의 두 가지 다른 영역에서 화학 조성을 평가합니다. 0.1M 카코딜산나트륨 완충액에 희석된 글루타르알데히드 2.5%에 표본을 24시간 동안 담가 생물막을 고정합니다.PBS 버퍼로 세척합니다. 1 % 오스뮴 테트 록사이드로 1 시간 동안 고정 후. PBS 버퍼로 세척합니다.생물막 샘플을 조심스럽게 탈수하여 증가하는 농도의 에탄올 용액에 담그십시오. 검체를 임계점 건조기로 옮기고 검체가 건조될 때까지 이산화탄소로 여러 번 대체하십시오. 장치에서 건조된 표본을 제거하고 주사 전자 현미경 홀더에 장착합니다.20나노미터의 금 층 코팅을 120초 동안 표본 표면에 분산시킵니다. 48시간의 제자리 성장 후 생물막의 집락화 밀도는 이 연구에서 다광자 현미경을 사용하여 표본의 총 스캔 면적과 관련하여 티타늄 및 지르코니아 디스크에 대한 집락화된 영역의 비율로 표현되었습니다. 그림은 테스트 재료의 표면에 부착된 박테리아를 보여줍니다.생물막의 더 높은 조밀도는 지르코니아 원판에서보다는 던지기 및 기계로 가공된 티타늄 원판의 표면에서 관찰되었습니다. 이 그림은 표본 표면에 부착된 살아있는 박테리아와 죽은 박테리아를 보여줍니다. 이 프로토콜에서 핵산으로 염색된 프로피듐 요오드화물은 막이 손상된 박테리아에만 침투하므로 죽은 세포와 관련된 적색 형광 신호를 방출합니다.SYTO 9는 막이 손상되지 않았거나 손상된 박테리아 세포에 침투하여 살아있는 미생물로부터 녹색 형광 신호를 방출합니다. 세포 박테리아 생존력은 모든 그룹에서 살아있는 미생물이 우세한 테스트 재료 간에 유사했습니다. 연마 및/또는 기계 가공 과정에서 생성된 균열, 홈 또는 마모 결함이 분석된 다양한 재료의 표면에 존재했습니다.지르코니아 디스크에서는 미생물이 없고 주로 구균과 간균 및 사상균으로 구성된 작은 다형성 미생물 응집체가 존재하는 넓은 영역이 관찰되었습니다. 구균과 간균의 존재는 가공된 티타늄 디스크의 표면에 흩어져 있었습니다. 주조 티타늄 표본은 표면에 생물막과 같은 모양을 가진 매트릭스에 관련된 미생물 군체를 제시했습니다.지르코니아 디스크의 표면에서 더 적은 매트릭스 재료가 기계로 가공된 티타늄 및 주조 티타늄 디스크와 비교하여 관찰되었습니다. EDS 분석은 지르코니아 디스크에서 지르코니아의 70.83 %를 밝혔습니다. 주조 티타늄 디스크에서는 95.16 %의 티타늄과 가공 된 티타늄 디스크에서 89.86 %의 티타늄이 있습니다.이 연구에서 기술된 프로토콜은 48시간 생물막의 만족스러운 보존을 제공하여 방법론적 타당성을 입증했습니다. 플루오로 소스의 사용과 다광자 현미경을 사용한 이미지 처리를 통해 세포 손상을 최소화하면서 이 표본의 대표 영역에서 매우 이질적인 미생물 집단의 박테리아 무결성을 분석할 수 있었습니다. 전자 현미경을 위한 생물학적 표본의 준비는 생물막의 구조적 보존을 촉진하여 해상도가 좋고 인공물이 없는 이미지를 얻었습니다.이를 통해 부착된 미생물의 시각화 및 형태학적 특성화를 수행할 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

치아 표면에 형성 Biofilms는 매우 복잡하고 그들의 아키텍처를 조절 상수 타고난 및 외인성 환경 문제, 생리 및 transcriptome에 노출되어 있습니다. 우리는 조성, 구조 조직 및 biofilm 연구의 다른 분야에 적용할 수 있습니다 경구 biofilms의 유전자 발현을 검사하는 도구 상자를 개발했습니다.

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우리는 함께 orthodontic 가전 제품에서 자연 구두 biofilm의 구조와 작곡 분석을 위해 프로토콜을...

형광에 원위치 하이브리드화 및 공촛점 레이저 스캐닝 현미경에 의해 맛이 좋은 확장기의 사정 Biofilm 분석

출처: Schlafer, S, Frost Kristensen, M. 교차 생물막에서 공초점 현미경을 이용한 세포외 pH 모니터링. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 구강 환경에서 Streptococcus mutans 와 Candida albicans 교차 생물막을 배양하여 박테리아-곰팡이 상호작용을 모델링하는 과정을 시연하며, 구강 병인에서 미생물 시너지, 글루칸 매개 부착, 산성 병원성 연구를 가능하게 합니다.

구강 병원 연구를 위한 박테리아-곰팡이 교차 생물막 구축

생물막 내 3개의 세포 및 세포 외 구성 요소를 동시에 정량화하고 비교하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법론에는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경, 생물막 구조 분석 및 시각화 소프트웨어, 통계 분석 소프트웨어의 사용이 포함됩니다.

생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

어린 시절 내내 구강 미생물에 변화는 성장 하는 관심사의 이다. 다른 미생물 연구의 비교는 표준화 된 샘플링 프로토콜의 부족을 보여준다. 제한 된 공간 샘플링 어려운 이들의 사운드 subgingival 고 랑을 만든다. 종이 포인트 샘플링은이 지역에 대 한 선택의 방법으로 자세히 여기 표시 됩니다.

건강 한 아이에서 미생물 분석을 위한 구두 Biofilm 샘플링

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본 시험 관 내 파일럿 연구는 영구 적색 잉크를 사용해 구강 바이오필름의 존재를 모방하여 세 가지 서로 다른 오염 제거 도구의 세척 효과와 처리 후 표면 변화 가능성을 평가하는 것을 목표로 했습니다.

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인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

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