Name: Stentor 에 중생의 연구 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 학습하세요 Stentor coeruleus를 이용한 단세포 수준 재생 연구 방법을. 세포 배양, 재생 유도 및 현미경 분석 기법을 통해 세포생물학의 핵심 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH R01 GM113602 (WFM) 보조금과 NSF 1144247 (알)에 의해 지원 되었다. 우리 인정 마크 Slabodnick 나탈리 커 클 랜드 이러한 프로토콜 중 일부의 초기 버전을 개발 하 고 유익한 토론 합니다. 우리는 원고의 중요 한 독서에 대 한 카 리 나 Perlaza 및 Greyson 루이스 감사합니다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

경작 Stentor 다양을 한 도전 선물 한다. 첫째, 세포의 많은 수를 필요로 하는 실험을 수행 하기 위해 하나 Stentor 농도 20 셀/mL을 초과 하면 건강에 해로운 될 문화로 Stentor 문화의 많은 수를 유지 해야 합니다. 둘째, 자주 Stentor 문화를 오염 수 생물 Stentor 보다 빠르게 분할 하 고 (일반적인 오염 물질은 rotifers) 문화를 압도. 따라서, 그것은 현미경으로 문화를 주기적으로 검사 하 고 오염 물질을 제거 하는 데 필요한입니다. 때때로, 새로운 문화는 오염 된 문화에서 수동으로 구출 하는 세포의 작은 숫자에서 시작 될 필요가 있다. 이 건강 한 Stentor 문화를 유지 하는 데 필요한 시간이 증가 합니다. 셋째, 단일 셀 400 mL 문화 확대 필요 합니다 적어도 한 달 Stentor 세포 주기는 3-5 일 때문에. 넷째, 다른 모델과 달리 ciliates Stentor 드물게 낭종에가 하 고 그들은 동결 수 없습니다 키를 누릅니다.
Stentor 경작의 중요 한 측면의 적절 한 음식 유 기체의 선택 이다. Stentor 경작을 위한 다양 한 방법은 설명 이전 했다. 그들 중 하나를 사용 하 여 탈지 우유 Stentor피드 박테리아 문화 제안 합니다. 이러한 기술은 Stentor; 경작에 효과적입니다. 그러나, 게놈 기술 응용 프로그램에서 정의 되지 않은 식품 생물 게놈 읽기에서 발생 하는 혼동을 피하기 위해 순수 샘플을 요구 한다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, Stentor 질량에서 성장 될 수 있다 고, 그들의 음식, Chlamydomonas, 시퀀싱 되었습니다 때문에 genomic 오염 식품 유기 체에서 존재 수 수 감지 제어. 알 수 없는 이유로 타르 타르 어디 그가 발견 하기 전에 Stentor 반환 하 여 그의 주식을 보충 했다. 현재 프로토콜 우리 Stentor 수년간 계속 할 수 있게 되었습니다.
Stentor 재생 실험은 일반적으로 간단 하지만 마음에 계속 몇 가지 중요 한 세부 사항. 섹션 2에 관한 Stentor 절단 절반 세포 분에 마스터 수 있습니다. 마스터링 Stentor 의 고급 미세 절차 연습 주가 필요할 수 있습니다. 동안 때 자당 치료 다음 수행 됩니다에 대 한 10-30에 의해 부 화 시간을 증가 (제 3), 영상 시작 되는 시점에 대부분 셀 아직도 있다면 그들의 membranellar 밴드 자당 또는 요소 처리를 수행. 3 분 보육 넘어 자당 치료의 시간 그것은 세포 죽음 귀 착될 것 이다 때문에 늘리지 마십시오.
Stentor 의 영상 재생 시간의 오랜 기간 동안 이미지 큰 셀에 방법을 필요 합니다. 섹션 4에 이미징 방법만 똑바로 현미경으로 사용할 수 있습니다. 거꾸로 현미경 대신 사용할 수 있는 경우, 셀 슬라이드 또는 작은 챔버에 coverslip에 배치할 수 있습니다. 한 가지 방법은 증발을 방지 하기 위해 다른 coverslip와 석유 젤리와 커버 챔버를 만드는 것입니다. 또는 개별 셀에 대 한 챔버 1 x 1 cm2 실리콘 스페이서의 평방에 원하는 크기의 구멍 펀치 구멍을 만들어 할 수 있다 (테이블의 재료)는 coverslip에는 스페이서를 배치, 셀 챔버 그리고 다른 coverslip와 챔버. 이미징, Stentor 중생의 각 단계의 특성을 관찰 하는 올바른 방향에 있지 않은 경우 때 셀 계약을 확고 하 게 접시를 누릅니다. 중생의 단계를 식별 하는 확장 셀 보고 (전체 확장 소요 약 45 s). 셀이 잘못 된 방향에 있는 아직도, 두드리는 반복 합니다. 그림 1 과 그림 6 에 표시 된 이미지는 스테레오 줌 현미경;로 찍은 그러나, 모든 실험 상세한 해 부 실체 현미경 X 5를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
경작 및 이미징 Stentor 외 또 다른 도전을 재생, 특히 단계를 식별 하는 데 필요한 시간의 양의 추적 이다. 완벽 하 게 명확 하 게 보이는 구두 primordium의 지역 중심 재생 셀 이면 무대의 몇 초 걸립니다. 그러나 가끔은,, Stentor 셀 재생 단계, 따라서 식별 하기 위해 더 많은 시간을 복용의 명확한 임무를 방지 하는 방향에서입니다. 상당한 양의 무대 개별 재생 셀 모든 재생 세포, 따라서 감소 하는 준비 하 고 기다려야 관찰자 요구의 시간 정밀도의 정량화를 지연 시킬 수 및 다시 후 셀 이동 이미지 하는 데 필요한 시간 새로운 방향입니다. 따라서,이 실험은 모두 시간과 노동 집약. 이러한 이유로, 그것은 매우 바람직한 Stentor 세포를 감지 하 고 비디오 현미경 데이터에는 중생의 단계 할당에 대 한 자동화 된 방법을 개발 하는 것입니다. 이들은 또한 더 재현 실험에 대 한 허용 샘플 크기와 인간의 편견의 제거에서 증가 한다.
매우 민감한 genomic와 proteomic 방법의 출현은 단일 세포의 연구 범위에 넣어 하기 시작 했다. 이러한 단일 세포 분석 Stentor 셀의 거 대 한 크기 네요 개념 증명 실험에 대 한 바람직한 테스트 주제. 가능, 같은 실험에 대 한 기본적, 이다 Stentor 경작 하 고 그래서 여기에 설명 된 방법을 더 고급 단일 셀 기술의 추가 개발 역할을 담당할 해야.

세포의 효소, 하지만 그 구성 요소는 신중 하 게 정확한 크기로 조정 하 고 잘 정의 된 위치에서 배열 오히려 매우 복잡 한 기계 간단한 가방 않습니다. 개별 셀의 morphogenesis 셀과 발달 생물학, 핵심 프로세스를 나타내지만 그것의 분자 메커니즘은 알 수 없는1,2. 동안 일부 교양된 셀 모양을 닮은, 단 세포 유기 체 수는 매우 복잡 한 아키텍처, ciliates3,4복잡 한 대뇌 피 질의 패턴에 의해 exemplified.
아마도 가장 극단적인 예를 고도로 구조화 된 셀의 거 대 한 heterotrichous ciliate Tetrahymena Paramecium 하 먼 관련 Stentor coeruleus, 이다. Stentor 길이 1 m m 이며 속눈썹 microtubule 리본 전체 셀의 길이 실행 하는 병렬 스택 주최의 행으로 교체 하는 블루 안료의 이상의 100 세로 줄무늬를 덮여 있다. 셀은 트럼펫-모양 (그림 1), membranellar 밴드와 그것의 앞쪽 끝과 후부 끝 기판에 셀 연결 holdfast 구강 장치 (OA). 분명 이전 후부 극성 외 셀 또한 보여줍니다 독특한 랄 패턴화 속눈썹 행 사이의 간격 점차적으로 시계 방향으로 증가 되도록. 불연속 좁은 행 만나는 넓은 행 및 셀 표면에의이 지역에서에서이 결과 스트라이프 대비의 소재 시로 알려진, 앞쪽 끝 구조에 다른 셀5, 융합 때의 두 번째 세트의 형성을 일으킬 수 있다 공식적으로 Spemann의 조직자에 해당 하 고 있습니다. 따라서, 개발 생물학의 모든 주요 프로세스에 있는 그들의 아날로그 Stentor: axiation, 패턴 형성, 그리고 유도. 배아, Stentor다른 세포 사이 에서도 이러한 프로세스 운명 차이 의해 구동 됩니다, 그리고 그들은 운명 단일 셀 내의 다른 지역 간의 차이 의해 구동 되어야 합니다. 무슨 Stentor 내에서 지역 간의 차이점을 정의 신비 이다.
Stentor 의 일부 차단 하는 경우 셀의 푸는 시간에 정상적인 세포를 재생할 수 있습니다. 셀 경우 절반, 또는 훨씬 더 작은 조각으로 심지어 각 조각 정상 찾고 하지만 작은 셀으로 재구성 하 여 잘라내어 셀 부품6,7사이의 적절 한 비례를 복구. 심지어 작은 조각, 1/64번째 원래 셀의 크기는 작지만 일반적으로 잡힌 셀으로 다시 생성 하 고 다음 전체 크기6성장 수 있습니다. Stentor 따라서 세포 기관이 크기 스케일링 및 세포 성장 규제의 조직 또는 전체 유기 체 수준에 일반적으로 적용 되는 수술 방법을 사용 하 여 기계 장치를 공부 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
Stentor 수술 작업의 넓은 범위에서 재생성 하 수의 속성 중 하나는 단일 nodulated macronucleus (그림 1)8전체 게놈 약 50000 사본을 포함입니다. 셀 조각 macronuclear 노드를 하나 이상 포함, 그것은 완벽 하 게 다시 생성 하는 기능. Stentor의 재생 능력을 기본 또 다른 재산의 막대 한 상처 치유 능력 이다. 많은 세포 유형9그들의 상처 치유 할 수 있다, 비록 Stentor 물리적 섭의 특별 한 범위에서 복구할 수 있다. Stentor10 세포질 흐름을 시각화 하는 방법 함께 과감 한 섭 동에서 Stentor 복구의 예로 이전 보고 되었다. 이러한 메서드는 세포질의 물리적 상태 어떻게 부상 하 고 이후 재생 영향의 연구를 수 있습니다.
Stentor의 거 대 한 크기, 특별 한 재생 능력, 그리고 사실 (예: 조직, axiation, 및 패턴화) 다세포 배아에서 발달 현상의 많은 명단 매력 중 많은 발달 생물학 토머스 헌트 모건7을 포함 하 여 지난 세기의 켜십시오. 50 년대와 60 년대 동안 microsurgical 접근 입증이 단 세포 유기 체11에서 재생 및 전체적 프로세스의 놀라운 배열. 그러나, Stentor 개발 되었습니다 분자 생물학 모델 시스템으로 최근에. 지난 몇 년 동안 Stentor 의 게놈 시퀀싱은8, 조립 하 고 먹이로 RNAi를 사용 하 여 유전자 발현을 교란 하는 방법은 개발된12살.
Stentor 현대 분자 생물학만을 위한 모형 유기 체에 개발 되었다 이유 중 하나는 최근 성장 때문에 그것의 긴 세포 주기 (3 ~ 5 일) 큰 문화의 어려움 이었다. 그러나 현대 genomic와 proteomic 방법 그들은, 사용 하 고 단일 Stentor 셀의 볼륨은 단일의 분석을 위해 개발 된 磁 방법에의 지 없이 이러한 방법에 대 한 충분 한 보다 더 적은 물자를 요구 하는, 셀 Stentor보다 훨씬 작은. 프로토콜의 섹션 1 단일 Stentor 셀에서 큰 문화를 설정 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 동일한 접근 셀 절단에 의해 얻은 세포 조각에서 큰 문화 확립을 사용할 수 있습니다. 섹션 1은 또한 시간의 오랜 기간 동안 건강 한 Stentor 문화를 유지 하기 위한 지침을 제공 합니다. 프로토콜의 섹션 2 유리 바늘으로 셀을 수동으로 절단 하 여 세포 재생을 유도 대 한 방법론을 제공 합니다. 특정 셀 구조 (membranellar 밴드와 구강 장치)의 재생을 유도 하는 두 가지 방법에 전념 하는 프로토콜의 제 3: 다음 이러한 구조를 흘리기 이끌어 자당 또는 요소 셀 치료 그들의 재생입니다. 프로토콜의 제 4 시간의 오랜 기간 동안 개별 재생 세포의 영상에 대 한 방법을 자세히 설명합니다. 제 4 단계의 중생과 중생 역학의 분석에 대 한 도움말의 설명으로 끝납니다.

<table><tbody><tr><td>Stentor coeruleus 살아있는 배양</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii 한천에</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>저온 살균 스프링워터, 1쿼트 병</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>메틸 셀룰로오스, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>파이렉스 유리 스폿 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>나사 캡이 있는 입이 넓은 유리 용기, 60mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>유리 뚜껑이 있는 2컵 유리 용기</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell 실리콘 시트 재료</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP 성장 매체, 클라미도모나스 배양에 최적화됨</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 스페이서, CultureWell 실리콘 시트, 0.25mm 두께/13cm x 18cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>바셀린, 바셀린, 화이트</td><td>스펙트럼</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관 . OD: 1.2mm, ID: 0.9mm, 길이: 10cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>니들 풀러 P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 스테레오 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, 스테레오 줌 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stentor 에 중생의 연구 방법

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

셀은 외부 섭에서 회복 하기 위해 그들의 부분을 다시 생성할 수 있이 필요가 있다. 단 세포 ciliate Stentor coeruleus 는 상처 치유 공부에 우수한 모델 유기 체 및 후속 세포 재생입니다. Stentor 게놈 최근, RNAi 등 현대 분자 생물학 방법을 함께 제공 되었다. 이러한 도구는 단일 세포 재생 분자 수준에서 연구를 가능 하 게. 프로토콜의 첫 번째 섹션에서 단일 셀 또는 셀 조각 Stentor 문화를 유지 하는 것에 대 한 일반 지침과 함께 수립 Stentor 셀 문화를 다루고 있습니다. 생화학, 시퀀싱, 그리고 질량 분석 같은 유용한 도구를 사용 하 여 대량에서 Stentor 경작 할 수 있습니다. 프로토콜의 후속 섹션 커버 Stentor재생을 유도 하는 다른 접근 방식. 수동으로 유리 바늘으로 세포를 절단 셀의 앞쪽 끝에 있는 특정 구조의 재생을 공부 하 고 수 자당 또는 요소 셀 치료 큰 셀 부품의 재생을 공부 수 있습니다. 이미징 개별 재생 셀에 대 한 방법은 준비 하 고 중생의 역학 분석 표제와 함께 제공 됩니다. 중생의 전체 과정은 3 단계로 분할 된다. 시각화의 진행 단계를 통해 세포의 인구 역학, 여 재생 타이밍에이 증명 됩니다.

Stentor 문화를 안정적으로 설립 하 고 개별 셀 또는 셀 조각을 사용 하는 프로토콜의 섹션 1에서 유지 되었습니다 있다. 큰 건강 한 문화에 대 한 대표적인 예제 비디오 1에 표시 됩니다.
중생의 시간 과정 Stentor 시작 단계 3.1, 이미징 및 제 4 (그림 7)에서 설명 하는 분석 방법에서에서 설명 하는 재생에 대 한 자당 치료 방법을 사용 하 여 측정 했다. 이 음모는 어떤 특정 단계에 도달 하 셀의 인구에 의해 걸린 시간에서 한 시간 동안 확산 임을 나타냅니다. 이러한 유형의 분석 셀 회생의 인구에서 재생성 과정에서 시간적이의 연구를 수 있습니다.
다음은 지금까지 수십 자당 치료 (그림 4 및 그림 6) 후 관찰 되었습니다 재생 타이밍의 요약 이다. (이 단계는 자당 희미하게 직후 시작) 어떤 membranellar 밴드 없이 눈물 처럼 Stentor 셀 1 단계 때. 이 단계는 3-6 h. 단계 2는 membranellar 밴드 나타나고 (자당 치료 후 3-6 h) 성장 하는 때 지속 된다. 이 단계는 3-4 h. 3 단계 구강 primordium membranellar 밴드 (자당 치료 후 6-8 h), 후부 끝에 나타나고 두 구조는 셀의 앞쪽 끝으로 이동 하는 경우에 대 한 지속. 이 단계는 1-2 시간 지속 된다. Membranellar 밴드와 구강 장치 셀의 앞쪽 끝에 도달 하면,이 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 특성 Stentor 트럼펫 모양을 채택 했다. 셀 자당 치료 후 완전히 거듭난된 8-9 h를 했다.
<img alt="막 밴드, 구강 장치, 음식 액포, 대핵 라벨이 있는 Paramecium 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1입니다. 스냅숏 Stentor의. Membranellar 밴드와 구강 장치는 세포의 앞쪽 끝에 표시 됩니다. holdfast 셀의 후부 끝 이다. Stentor macronucleus nodulated입니다. 잘 먹이 Stentor 녹색 식품 그들 주로 Chlamydomonas를 포함 하는. 눈금 막대는 0.5 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="해부 현미경 설정; 생물학 연구에서 관찰하기 위한 Stentor 표본이 있는 유리 슬라이드." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2입니다. Stentor 절단 설정. 셀 절단 수동으로 상용 해 스테레오 현미경을 사용 하 여 셀을 보는 동안 유리 바늘을 조작 하 여 수행 됩니다. 티슈 페이퍼의 목적은 흰색 배경에 더 나은 셀 참조를 제공 하는 것입니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="유사분열 과정의 단계를 보여주는 A-F로 표시된 분열 세포의 현미경 시퀀스." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3입니다. 비디오 3 유리 바늘 Stentor 를 잘라 하는 방법을 보여주는 스냅샷. (A) A Stentor 직전 바늘 접촉 그것. (B) A Stentor 바늘과 유리 슬라이드 사이 부드럽게 압착. (C) A 계약 Stentor 바늘의 힘에 반응. (D) A Stentor 눌러 부드럽게 셀에 바늘의 측면으로 절단 되 고 (E) A Stentor 하지만 지금 두 잘라 분리 되지 않는다. (F) 두 개의 Stentor 파편. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="자당/요소 충격 단계, 원심분리기 튜브, 세포 스테이지가 있는 스텐터 재생 공정 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4입니다. 제 3과 제 4 프로토콜의 구조 시각화. 이것은 자당 또는 요소 치료 및 세포 재생의 관찰을 수행 하기 위한 그림된 프로토콜 이다. 하단 패널에 표시 된 시간 세척 1의 시작에서 측정 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="해부 현미경 설정, 9웰 스폿 플레이트, 미세 액적 반응 분석, 광학 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5입니다. 똑바로 현미경으로 중생의 이미징 및 직접 관찰에 대 한 설정. 각 4 µ L 드롭릿은 coverslip에서 매달려, 한 세포 재생을 겪고 있다. 유리 자리 접시의 우물에 물 방울의 증발을 제한합니다. 이 설정을 동시에 여러 세포의 재생에 따라 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="식물 세포 구조 분석; 현미경 이미지 A-E; 세포 형태 변화를 강조합니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6입니다. Membranellar 밴드와 구강 장치 재생의 각 단계에서 Stentor 의 스냅샷. 1 단계 (A) 눈물 모양의 셀 모양 및 membranellar 밴드의 부재에 의해 특징입니다. (B) 단계 2 속눈썹 기반 구조를 지속적으로 뛰는 membranellar 밴드의 외관 특징 이다. Membranellar 밴드 패널 B에에서 흰색 파선으로 표시 됩니다-디 (C, D) 3 단계 구강 primordium (화살표 표시)의 외관에 의해 특징입니다. 구두 primordium membranellar 밴드의 뒤 끝에는 invagination 처럼 보인다. 구두 primordium 됩니다 다음 구강 장치 될 셀의 앞쪽을 향해 이동 합니다. (E) 재생 셀 Stentor 트럼펫 모양, 특성을 채택 했다 하 고 구강 장치 (화살표 표시) 셀의 앞쪽 끝에서 확대가 완료 됩니다. 눈금 막대는 0.25 m m. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="세포 단계 분포 막대 차트, 자당 후 시간, 9시간 동안 4단계 표시." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7입니다. 스택 상자 플롯 표시 어떻게 자당 치료 후 재생의 모든 단계에서 세포의 비율 시간이 지남에 변경. 음모 재생 세포의 인구 내의 재생 단계의 타이밍에서이 보여 줍니다. "최종 등록" 중생의 완료를 나타냅니다. 셀 개수: 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="실험실 실험에서 광합성 연구를 위한 녹조류 배양 비커." src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 1"> 비디오 1입니다. 건강 한 Stentor 문화의 예. 일반적으로, 문화는 집중, 문화를 나누는 것이 좋습니다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="현미경으로 떨어뜨리십시오. 액체 표면 장력 연구; 현미경 방법; 교육 분석." src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 2"> 비디오 2입니다. 스와 Stentor 늦추고. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="얇은 와이어의 물방울 위치를 강조하는 미세유체 설정의 현미경 이미지." src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Movie 3"> 비디오 3입니다. 절단 Stentor. 개별 셀 수동으로 스테레오 현미경 셀 통해 유리 바늘을 눌러 해 부 아래 여러 조각으로 잘릴 수 있다. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문화에 대 한 문제</td>
			<td>가능한 치료</td>
			<td>가능한 예방</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 rotifers 또는 다른 큰 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>새로운 문화 접시에 가능한 많은 Stentor 를 제거 합니다. 다음 셀 세 번 세척.</td>
			<td>상용 공급 업체에서 구입 하는 경우에, 그들을 받을 때 Stentor 를 철저히 씻으십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 곰 팡이 또는 다른 작은 유기 체에 의해 압도 됩니다.</td>
			<td>식별 코너는 최소한 Stentor. 그 지역에서 많은 Stentor 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW에 추가 합니다. 섞어 부드럽게 하지만 완전히 distrubute에 침입 유기 체. 다음 먹이 생략 하 고 Stentor 그들을 먹을 것 이다.</td>
			<td>문화를 정기적으로 관찰 하 고 신선한 PSW에 대 한 미디어를 교환 하 여 작은 오염 물질을 제거.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 서로 위에 누워 있다.</td>
			<td>농도 20 셀/mL 문화를 분할.</td>
			<td>더 자주 문화를 분할.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor 셀 결합 됩니다.</td>
			<td>5 일 마다 대신 4 일 마다 피드.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>문화는 어두운 폐기물의 많은 있다.</td>
			<td>어두운 소재, 셀을 제거 하지 않고 가능한 Stentor 폐기물의 제거. Stentor 어두운 소재에 장착 하는 경우 위쪽 및 아래쪽으로 그들의 낭비에서 Stentor 세포를 다음 셀을 제거 하지 않고는 쓰레기와 함께 미디어를 제거 플라스틱. 또는, 그 Stentor 제거 하 고 그에 따라 피드 덜.</td>
			<td>피드 Stentor 음식 문화의 100 mL 당 적은 1 mL.</td>
		</tr>
<tr>
<td>유해한 수준의 vacuolated/비 대 한 (둥근) Stentor.
</td>
			<td>많은 Stentor 세포를 제거 하지 않고 최대한 많은 미디어를 제거 하 고 새로운 PSW를 추가 합니다.</td>
			<td>미디어를 정기적으로 교환 합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Stentor경작에 대 한 문제 해결 가이드입니다.

거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

Stentor 에 중생의 연구 방법

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Stentor를 성장시켜 단일 세포 수준에서 재생을 연구하기 위한 모델 유기체로 사용하는 것입니다. 이 방법은 세포가 개별 부분에서 구조를 구축하는 방법과 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 스텐터의 주요 장점은 재생이 가능한 단세포이고 수술을 할 수 있을 만큼 크다는 것이다.일반적으로 이 프로토콜의 어려운 부분은 사람들이 개인이 아닌 배양으로 세포를 다루는 데 익숙하다는 것입니다. 먼저 5X 배율의 경사광을 사용하여 실체 현미경으로 Stentor 샘플이 포함된 페트리 접시를 검색합니다. 스텐터 세포는 기질에 부착될 때 트럼펫 모양을 나타냅니다.붙어 있지 않은 동안, 헤엄치는 스텐터 세포는 외관상 덜 확장됩니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 개별 Stentor 세포를 시판되는 저온 살균 샘물 100마이크로리터 이상이 들어 있는 유리 스폿 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 스텐터 세포를 제거하지 않고 우물에 있는 물의 약 90%를 제거하고 500마이크로리터의 신선한 저온 살균 샘물을 우물에 세 번 첨가하여 세포를 씻습니다.세포에 영양을 공급하기 위해 먼저 Chlamydomonas 배양액에서 1ml의 분취액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 2, 095g에서 원심분리합니다. 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 1ml의 저온 살균 샘물에 재현탁시킨 다음 500마이크로리터의 저온 살균 샘물에 다시 현탁시킵니다. 클론 스텐터 배양이 필요한 경우, 배양당 500마이크로리터의 컨디셔닝 배지를 유리 스폿 플레이트의 개별 웰로 옮기고 하나의 스텐터 세포를 각 배지 웰로 옮깁니다.48시간마다 각 스텐토르 배양액에 5마이크로리터의 준비된 클라미도모나를 공급하고 배양물을 그늘진 곳에 보관합니다. 각 수유 전에 새로운 스텐터 세포의 수를 세고 그에 따라 전달된 클라미도모나의 양을 조정합니다. 96시간마다 배양 배지를 몇 차례 부드럽게 피펫팅하여 각 웰의 메니스커스에서 스텐터를 분리하고 1ml 피펫을 사용하여 세포를 제거하지 않고 웰에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다.그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 새로운 컨디셔닝 배지를 추가합니다. 적어도 하나의 우물에 있는 세포 수가 20개를 초과하면 고압 멸균 멸균 입이 넓은 유리 병에 저온 살균된 샘물 20ml를 넣고 시연된 바와 같이 각 우물의 바닥에서 스텐터 세포를 조심스럽게 분리합니다. 1밀리리터 피펫으로 모든 Stentor 세포를 수집하고 세포를 유리병에 부드럽게 옮깁니다.48시간마다 신선한 저온 살균 샘물을 병에 추가하여 스텐터 밀도를 밀리리터당 약 20 셀로 유지하고 스텐터 세포에 200-1, 000 마이크로리터의 준비된 클라미도모나를 공급합니다. 배양량이 용기 용량의 약 90%에 도달하면 용기의 전체 내용물을 2컵 유리 용기에 옮겨 대용량 스텐터 배양액에 100밀리리터당 2밀리리터의 준비된 클라미도모나를 공급하고 4-5일마다 저온 살균된 샘물을 배양액에 첨가하여 스텐터 밀도를 밀리리터당 약 20 세포로 유지합니다. 일주일에 한 번, 1ml 피펫을 사용하여 5X 해부 현미경으로 배양물을 검사하여 비정상적으로 모양이 잡히거나 무색의 스텐터 세포와 함께 오염된 미생물을 제거합니다.유리 용기가 약 90% 가득 찼을 때 배양물을 분할하고 25ml의 저온 살균된 샘물을 배양액에 첨가하고 50ml 피펫을 사용하여 유리에서 Stentor를 분리합니다. 그런 다음 배양의 약 50%를 새로운 2컵 유리 용기로 옮깁니다. 세포 단편화에 의한 재생을 유도하려면 먼저 바늘 풀러를 사용하여 모세혈관에서 여러 개의 바늘을 만듭니다.다음으로, 2마이크로리터 방울에 정의된 트럼펫 모양, 생생한 청록색, 큰 액포가 없는 건강한 스텐터 하나를 수집합니다. 슬라이드에 물방울을 놓고 4% 메틸 셀룰로오스 2마이크로리터로 스텐터의 움직임을 늦춥니다. 비말을 해부 현미경 아래에 놓고 바늘 파손을 방지하기 위해 유리 바늘을 절단면과 가능한 한 평행하게 유지합니다.수축된 스텐터를 바늘 옆으로 부드럽게 눌러 세포의 앞쪽 끝과 세포의 뒤쪽 끝을 분리합니다. 두 단편에 하나 이상의 거대핵 노드가 있는지 확인하고 단편을 유리 스폿 플레이트의 개별 웰로 이동합니다. 멤브레인 밴드 및 구강 장치 재생을 유도하려면 1ml의 배양 배지에 있는 30-60개의 Stentor 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 125마이크로리터의 단일 부피 추출로 튜브에서 모든 세포를 수집합니다.갓 준비한 25% 자당 500마이크로리터가 들어 있는 튜브에 세포를 분배하고 스톱워치를 시작합니다. 랙의 튜브에 있는 세포를 1분 동안 튕긴 후 200마이크로리터 추출로 모든 세포를 수집하고 스톱워치에 2분의 자당 처리가 표시될 때까지 피펫 팁에 세포를 유지합니다. 그런 다음 Stentor를 저온 살균된 샘물 1ml가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 꺼내 세 번 스핀 세척합니다.재생을 이미지화하려면 100마이크로리터의 저온 살균된 샘물을 유리 스폿 플레이트의 한 웰에 추가하고 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 4마이크로리터의 배양 배지에 1개의 Stentor 셀을 수집합니다. 22 x 22제곱밀리미터 커버슬립 중간에 물방울을 넣고 이전 물방울 주위에 4개의 물방울을 더 놓습니다. 커버슬립을 뒤집어 저온 살균된 샘물이 담긴 우물 위에 부드럽게 놓습니다.그런 다음 적절한 시간 해상도로 광학 현미경으로 재생 세포를 이미지화합니다. 자당 세척 직후에 발생하는 재생의 첫 번째 단계에서 스텐터 세포는 멤브레인 밴드가 없는 눈물방울처럼 보입니다. 3-6시간 후에 멤브레인 밴드가 나타납니다.이 단계, 즉 두 번째 단계는 3-4시간 더 지속됩니다. 3단계는 구강 원시(oral primordium)가 막밴드(membranellar band)의 뒤쪽 끝에 나타나고 두 구조 모두 세포의 앞쪽 끝을 향해 움직이기 시작할 때 발생합니다. 이 단계는 1-2시간 동안 지속됩니다.막띠와 구강 기관이 모두 세포의 앞쪽 끝에 도달하면 재생이 완료되고 세포는 특징적인 스텐터 트럼펫과 같은 모양을 채택하게 됩니다. 각 시점에서 각 재생 단계의 세포 백분율을 누적 상자 그림에 표시합니다. 세포 절단 및 자당 처리 후 재생 시간을 측정하면 세포 집단이 특정 단계에 도달하는 데 걸리는 시간이 한 시간 동안 분포되어 있으며, 이는 주어진 재생 세포 집단 내에서 재생 과정의 시간적 이질성을 보여줍니다.이 비디오를 시청한 후에는 Stentor를 배양하고 재생을 시작하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 인내심을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 스텐토르는 배양을 나누는 데 3일에서 5일이 걸리며, 스텐토르 재생 단계를 식별하는 연습이 필요합니다.이 기술은 세포 생물학 연구자들이 Stentor에서 재생을 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다.

methods-for-the-study-of-regeneration-in-stentor

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

살아있는 동물 이내에 줄기 세포 차별을 공부에 대한 매력적인 모델은 planarian의 flatworm입니다. 재생 쉽게 기본적인 실험실에서 수행하는 간단한 절단 실험에서 공부하고 약리 및 유전...

약리 및 기능성 유전자 Assays은 Planarian의 재생을 조작하는<em자포니카> Dugesia</em

planaria 사이에 정의하고 일관성있는 크기의 조직을 접목을위한 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 또한 이식에 사용되는 고정 기법이 살아있는 동물의 부분 조사를위한 리드 방패와 함께, 적응하는 방법에 대한 설명이 포함되어 있습니다.

Planarian의 부동화, 부분 조사 및 조직 이식

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재 협착의 연구에 대한 경동맥 스텐트 시술의 쥐과 모형

거대 섬모충인 Stentor coeruleus는 단일 세포의 재생과 상처 치유를 연구하는 고전적인 시스템입니다. 저배율과 고배율에서 Stentor 세포를 동시에 이미징함으로써 상처 전, 상처 중, 상처 후의 세포질 흐름을 측정할 수 있습니다.

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학습하세요 Stentor coeruleus를 이용한 단세포 수준 재생 연구 방법을. 세포 배양, 재생 유도 및 현미경 분석 기법을 통해 세포생물학의 핵심 메커니즘을 탐구할 수 있습니다.

Stentor 에 중생의 연구 방법

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