Stentor 에 중생의 연구 방법

이 프로토콜의 전반적인 목표는 Stentor를 성장시켜 단일 세포 수준에서 재생을 연구하기 위한 모델 유기체로 사용하는 것입니다. 이 방법은 세포가 개별 부분에서 구조를 구축하는 방법과 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 스텐터의 주요 장점은 재생이 가능한 단세포이고 수술을 할 수 있을 만큼 크다는 것이다.

일반적으로 이 프로토콜의 어려운 부분은 사람들이 개인이 아닌 배양으로 세포를 다루는 데 익숙하다는 것입니다. 먼저 5X 배율의 경사광을 사용하여 실체 현미경으로 Stentor 샘플이 포함된 페트리 접시를 검색합니다. 스텐터 세포는 기질에 부착될 때 트럼펫 모양을 나타냅니다.

붙어 있지 않은 동안, 헤엄치는 스텐터 세포는 외관상 덜 확장됩니다. 1밀리리터 피펫을 사용하여 개별 Stentor 세포를 시판되는 저온 살균 샘물 100마이크로리터 이상이 들어 있는 유리 스폿 플레이트의 웰로 옮깁니다. 그런 다음 스텐터 세포를 제거하지 않고 우물에 있는 물의 약 90%를 제거하고 500마이크로리터의 신선한 저온 살균 샘물을 우물에 세 번 첨가하여 세포를 씻습니다.

세포에 영양을 공급하기 위해 먼저 Chlamydomonas 배양액에서 1ml의 분취액을 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 3분 동안 2, 095g에서 원심분리합니다. 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 1ml의 저온 살균 샘물에 재현탁시킨 다음 500마이크로리터의 저온 살균 샘물에 다시 현탁시킵니다. 클론 스텐터 배양이 필요한 경우, 배양당 500마이크로리터의 컨디셔닝 배지를 유리 스폿 플레이트의 개별 웰로 옮기고 하나의 스텐터 세포를 각 배지 웰로 옮깁니다.

48시간마다 각 스텐토르 배양액에 5마이크로리터의 준비된 클라미도모나를 공급하고 배양물을 그늘진 곳에 보관합니다. 각 수유 전에 새로운 스텐터 세포의 수를 세고 그에 따라 전달된 클라미도모나의 양을 조정합니다. 96시간마다 배양 배지를 몇 차례 부드럽게 피펫팅하여 각 웰의 메니스커스에서 스텐터를 분리하고 1ml 피펫을 사용하여 세포를 제거하지 않고 웰에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다.

그런 다음 각 웰에 500마이크로리터의 새로운 컨디셔닝 배지를 추가합니다. 적어도 하나의 우물에 있는 세포 수가 20개를 초과하면 고압 멸균 멸균 입이 넓은 유리 병에 저온 살균된 샘물 20ml를 넣고 시연된 바와 같이 각 우물의 바닥에서 스텐터 세포를 조심스럽게 분리합니다. 1밀리리터 피펫으로 모든 Stentor 세포를 수집하고 세포를 유리병에 부드럽게 옮깁니다.

48시간마다 신선한 저온 살균 샘물을 병에 추가하여 스텐터 밀도를 밀리리터당 약 20 셀로 유지하고 스텐터 세포에 200-1, 000 마이크로리터의 준비된 클라미도모나를 공급합니다. 배양량이 용기 용량의 약 90%에 도달하면 용기의 전체 내용물을 2컵 유리 용기에 옮겨 대용량 스텐터 배양액에 100밀리리터당 2밀리리터의 준비된 클라미도모나를 공급하고 4-5일마다 저온 살균된 샘물을 배양액에 첨가하여 스텐터 밀도를 밀리리터당 약 20 세포로 유지합니다. 일주일에 한 번, 1ml 피펫을 사용하여 5X 해부 현미경으로 배양물을 검사하여 비정상적으로 모양이 잡히거나 무색의 스텐터 세포와 함께 오염된 미생물을 제거합니다.

유리 용기가 약 90% 가득 찼을 때 배양물을 분할하고 25ml의 저온 살균된 샘물을 배양액에 첨가하고 50ml 피펫을 사용하여 유리에서 Stentor를 분리합니다. 그런 다음 배양의 약 50%를 새로운 2컵 유리 용기로 옮깁니다. 세포 단편화에 의한 재생을 유도하려면 먼저 바늘 풀러를 사용하여 모세혈관에서 여러 개의 바늘을 만듭니다.

다음으로, 2마이크로리터 방울에 정의된 트럼펫 모양, 생생한 청록색, 큰 액포가 없는 건강한 스텐터 하나를 수집합니다. 슬라이드에 물방울을 놓고 4% 메틸 셀룰로오스 2마이크로리터로 스텐터의 움직임을 늦춥니다. 비말을 해부 현미경 아래에 놓고 바늘 파손을 방지하기 위해 유리 바늘을 절단면과 가능한 한 평행하게 유지합니다.

수축된 스텐터를 바늘 옆으로 부드럽게 눌러 세포의 앞쪽 끝과 세포의 뒤쪽 끝을 분리합니다. 두 단편에 하나 이상의 거대핵 노드가 있는지 확인하고 단편을 유리 스폿 플레이트의 개별 웰로 이동합니다. 멤브레인 밴드 및 구강 장치 재생을 유도하려면 1ml의 배양 배지에 있는 30-60개의 Stentor 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 125마이크로리터의 단일 부피 추출로 튜브에서 모든 세포를 수집합니다.

갓 준비한 25% 자당 500마이크로리터가 들어 있는 튜브에 세포를 분배하고 스톱워치를 시작합니다. 랙의 튜브에 있는 세포를 1분 동안 튕긴 후 200마이크로리터 추출로 모든 세포를 수집하고 스톱워치에 2분의 자당 처리가 표시될 때까지 피펫 팁에 세포를 유지합니다. 그런 다음 Stentor를 저온 살균된 샘물 1ml가 들어 있는 미세 원심분리기 튜브로 꺼내 세 번 스핀 세척합니다.

재생을 이미지화하려면 100마이크로리터의 저온 살균된 샘물을 유리 스폿 플레이트의 한 웰에 추가하고 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 4마이크로리터의 배양 배지에 1개의 Stentor 셀을 수집합니다. 22 x 22제곱밀리미터 커버슬립 중간에 물방울을 넣고 이전 물방울 주위에 4개의 물방울을 더 놓습니다. 커버슬립을 뒤집어 저온 살균된 샘물이 담긴 우물 위에 부드럽게 놓습니다.

그런 다음 적절한 시간 해상도로 광학 현미경으로 재생 세포를 이미지화합니다. 자당 세척 직후에 발생하는 재생의 첫 번째 단계에서 스텐터 세포는 멤브레인 밴드가 없는 눈물방울처럼 보입니다. 3-6시간 후에 멤브레인 밴드가 나타납니다.

이 단계, 즉 두 번째 단계는 3-4시간 더 지속됩니다. 3단계는 구강 원시(oral primordium)가 막밴드(membranellar band)의 뒤쪽 끝에 나타나고 두 구조 모두 세포의 앞쪽 끝을 향해 움직이기 시작할 때 발생합니다. 이 단계는 1-2시간 동안 지속됩니다.

막띠와 구강 기관이 모두 세포의 앞쪽 끝에 도달하면 재생이 완료되고 세포는 특징적인 스텐터 트럼펫과 같은 모양을 채택하게 됩니다. 각 시점에서 각 재생 단계의 세포 백분율을 누적 상자 그림에 표시합니다. 세포 절단 및 자당 처리 후 재생 시간을 측정하면 세포 집단이 특정 단계에 도달하는 데 걸리는 시간이 한 시간 동안 분포되어 있으며, 이는 주어진 재생 세포 집단 내에서 재생 과정의 시간적 이질성을 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 Stentor를 배양하고 재생을 시작하고 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 인내심을 가져야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 스텐토르는 배양을 나누는 데 3일에서 5일이 걸리며, 스텐토르 재생 단계를 식별하는 연습이 필요합니다.

이 기술은 세포 생물학 연구자들이 Stentor에서 재생을 탐구할 수 있는 길을 열 것입니다.