Name: 단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 배우세요 단세포 접합조류의 클론 배양법을 자연 환경에서 수집한 시료로부터 단일 세포를 분리하여 배양하는 방법입니다. 이 기술은 미생물학 및 조류 연구에 필수적인 순수 균주 확립에 활용됩니다.

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우리 감사 히사요 노자 키 (도쿄 대학), 오 나카 다 (게이오 대학), 유카 Marukawa 하시 모토 (일본 여자 대학교), 히로유키 Sekimoto (일본 여자의 대학). 그들의 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 길. 이 연구는 과학의 승진, 일본, 일본 사회에서 과학 연구 (No. 26440223 및 15 H 04413)에 대 한 특정 고 유키 Tsuchikane에 새로운 기술 개발 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

1. 해 조류를 포함 하는 물 샘플의 수집
참고: 단 세포 conjugatophytes 호수, 늪, 논 등 정체 민물 지역에서 성장 한다. 조류-포함 된 물 샘플은 문화 긴장을 생산 하기 위해 이러한 환경 중 하나에서 수집 됩니다. 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 플랑크톤 넷, 일회용 피 펫, 그리고 병 또는 50 mL 튜브 물 샘플을 수집.
<ol><li>플랑크톤 호수 환경에서 인터넷을 사용 하 여 물에서 조류를 수집. 사용 목적에 따라 적절 한 net. 참고: 그물의 상부는 물 침투성. 그물에 의해 조류 그물 플랑크톤의 하단 컨테이너에 집중 된다. 굵고 메쉬 작은 조류를를 통해 전달할 수 있습니다. 좋은 메쉬 쉽게 막힌 가져옵니다.</li>
	<li>50 mL 튜브 또는 100 mL 플라스틱 병에 물 (약 50ml)을 전송 합니다. 실험실에 집중된 물 샘플을가지고.</li>
	<li>단 세포 conjugatophytes는 또한 늪 이나 논에서 성장 한다. 이 얕은 물 지역에서 조류를 포함 하는 물 샘플 직접 스포이드와 함께 샘플링 될 수 있습니다. 그런 다음, 전송 (30-50 mL) 물 50 mL 튜브 또는 50 mL 플라스틱 병. 참고: 물은 신중 하 게 샘플링 토양 표면 위의 샘플 어떤 토양을 포함 하지 않습니다.</li>
</ol>2입니다. 조류의 확인
참고: 다음 항목은 필요 시는 루 페 또는 휴대용 현미경 및 60 m m 관찰에 대 한 접시.
<ol><li>일회용 피 펫에는 샘플에 조류의 존재를 확인, 샘플을 직접 관찰 하는 루 페를 사용 합니다. 참고: 약의 더 큰 셀 400-1000 µ m 길이 (예를 들어, Closterium ehrenbergii)에 쉽게 수 있습니다이 방법을 사용 하 여 관찰.</li>
	<li>휴대용 현미경 조류를 확인 하려면 플라스틱 실험실 접시에 물 샘플을 붓는 다.<ol>
<li>윗부분의 안쪽 부분에 샘플 (약 3 mL)을 넣어 (뚜껑) 60 mm 페 트리 접시의 위에 뚜껑의 안쪽 부분을 직면 하 고 그것의 바닥 부분과 아래쪽 절반 장소. 참고:이 메서드는 이동에서 샘플을 유지 하 고 관찰을 쉽게.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 격리 한 유리 모 세관 피 펫 파스퇴르 피 펫에서의 준비
참고: 프로세스를 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 살 균 파스퇴르 펫, 파스퇴르 펫, 장갑, 고무 전구, 정신 램프, 유리, 쓰레기통, 집게, 라이터, 정신 램프에 대 한 메탄올에 대 한 랙 및 클린 룸 또는 층 류 흐름 후드 (필요한 경우)입니다.
<ol><li>알콜 버너 점화.<ol>
<li>격리에 대 한 정밀한 유리 모 세관 피펫은 생산, 불꽃은 경 경 하지 있는지 확인 합니다. 불꽃을 날카롭게 하 고 파스퇴르 피 펫의 끝을 녹여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>지원 되는 고무 전구 측면에 손으로 및 팁 사이드에 집게를 사용 하 여 불꽃에 파스퇴르 피 펫 멸 균 유리 열.</li>
	<li>불꽃에서 파스퇴르 피 펫을가지고 고 그것을 스트레칭.<ol>
<li>유리 용 해, 신속 하 게 불꽃에서 파스퇴르 피 펫을 제거 하 고 키를 누릅니다. 참고:이 실험에서 파스퇴르 피펫으로 확장 되었다에 의해 15-20 cm. 확인 확실을 피펫으로 불꽃을 당기는 동안.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적절 한 길이를 유리 모 세관 피 펫의 끝을 휴식. 때문에 굴복 부분은 최고의 팁에 이상적입니다. 참고:이 연구에서 5-10 cm의 팁과 유리 모 세관 피펫은 준비 되었다.<ol>
<li>그것을 용융 후 모 세관을 삭제 하 고 불꽃 나오는 것을 확인 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>거품 유리 모 세관 피 펫에서 발표 여 팁의 크기를 나타냅니다. 격리 되어야 하는 셀에 대 한 적절 한 크기를 선택 합니다. 약 1 m m 거품의 셀 폭이 10-20 µ m의 Closterium 종의 격리에 대 한 적절 한입니다.</li>
</ol>4. 단일 셀 격리 유리 모 세관 피 펫
참고: 시작 하기 전에 다음과 같은 항목이 필요: 거꾸로 가벼운 현미경, 시계 안경, 플라스틱 접시, 그리고 메 마른 스레드 시험관 CA 매체 (표 1)를 포함 하거나 CA 중간7조건.
<ol><li>몇 가지 시계 안경 (22 m m 직경에서 및 깊이 1 m m), 살 균 CA 매체의 각 포함 1 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>현장에서 수집 물 샘플에서 목표 셀을 격리 합니다.<ol>
<li>플라스틱 그릇에 대상 셀을 포함 하는 물 샘플 (약 30-40 mL)를 따르십시오.</li>
		<li>거꾸로 가벼운 현미경 플라스틱 접시에 샘플을 관찰 하는 동안 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 단일 셀을 선택 합니다.</li>
		<li>모 세관 작용에 의해 세포의 포부를 촉진 하기 위하여 셀 근처 유리 모 세관 피 펫을가지고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>살 균 CA 매체 (그림 1a)의 1 mL를 포함 하는 시계 유리에 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>다시 새로운 유리 모 세관 피펫은 멸 균 CA 매체에서를 사용 하 여 셀을 선택 하 고 메 마른 캘리포니아 매체 (그림 1b)를 포함 하는 두 번째 시계 유리에 그것을 전송. 참고:이 프로세스는 단일 셀 자리 플레이트 (그림 1c)에 격리 될 때까지 반복 됩니다.</li>
	<li>새로운 유리 모 세관 피펫은를 사용 하 여 단일 셀을 선택 하 고 마지막으로 CA 매체 또는 조건된 CA 매체 (그림 1의 d)의 14 mL를 포함 하는 테스트 튜브에 전송. 16 h 빛: 8에서 23 ° C에서 샘플을 품 어-어두운 h 2 주 주기. 참고: 주변 환경으로 성장 하는 세포에서 분 비 되는 세포 증식에 대 한 알 수 없는 factor(s)4세포 분열 촉진 하기 위하여 조절된 매체에 포함 됩니다. 클론 문화를 설립 하는 경우 배양4에서 바른된 CA 매체를 준비 합니다. 문화 성공 하면 녹색을 돌 것 이다.</li>
</ol>

<ol><li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li>
<li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li>
<li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071618300650011">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li>
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<li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li>
<li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1440-1835.2010.00602.x">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li>
<li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873(2017).</li>
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<li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02411384">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li>
<li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302724192">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li>
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<li>Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10008776057/">Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan</a>. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).</li>
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</ol>

현재 메서드를 사용 하 여 Closterium sp.의 9 클론 문화 긴장 15 셀 60%의 성공률을 나타내는 물 샘플 (Inba1)에서 고립에서 설립 되었다. 종 식별 밖으로 미래에 형태학 관찰 분자 계통 발생 분석8같은 DNA 분석에 의해 실행 될 것 이다.
현재의 방법에서 물 샘플의 신선도 성공률에 중요 하다. 필드 컬렉션 후 즉시 물 샘플에서 세포를 분리 하는 것이 낫다. Closterium 종 (예를 들어, C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale 복잡 한)의 세포는 4-8 ° C에서 그것을 저장 하 여 약 7 d 물 샘플에서 유지 될 수, 세포의 분리는 바람직한 컬렉션 또는 다음 날의 하루. 그것은 또한 세척 반복의 수를 증가 하는 그래서 대상 셀 이외의 어떤 오염 물질을 제거 하는 것이 중요 (즉, > 3 x) 미생물 토양과 셀에 의해 문화의 오염 되지 않을 수 있습니다.
이 기술은 한계 (CA 또는 CA 매체 조절된)이이 프로토콜에 사용 된 문화 미디어는 항상 모든 conjugating 조류에 대 한 적절 한입니다. 경우에 따라 그것은 다른 매체 뿐 아니라 다른 빛과 온도 조건을 사용 하 여 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 단일 셀에서 문화 성장 여부를 증명 하기 어려운, 그것은 테스트 튜브에 세포를 전송할 때 정확 하 게 1 셀을 선택 하는 데 필요한. 따라서, 전송 할 수 새로운 유리 모 세관 피 펫을 각 시간.
이 피 펫 세척 방법 클론 문화 수립 클래식/표준 방법 이며, 연구에 대 한 원하는 셀을 사용 하는 가장 신뢰할 수 있는 방법입니다. 많은 연구8,9,,1011 에 사용 되는 조류를 동산의 클론 문화는 현재 메서드를 사용 하 여 설치 되었다. 클론 문화 없이 변화 조류를 분석 하는 것이 어렵습니다. 또한, 최근 몇 년 동안, 드 노 보 전체 게놈 시퀀스를 (예를 들어, 미니 언 nanopore 시퀀서를 사용 하 여), 쉽게 되었고 클론 문화 구축 더 드 노 보 시퀀싱을 촉진 한다. 즉,이 메서드는 첫 번째 단계는 미래에 더 그들의 생물 다양성을 이해 하는 것이 조류의 연구.
안정적인 문화 긴장을 설정 하기 위해 그것은 정확 하 게는 프로토콜 내에서 특정 중요 한 단계를 수행 하는 데 필요한입니다. 가장 중요 한 단계는 단일 셀만의 통과 허용 하는 최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫의 준비 합니다. 유리 모 세관 피 펫의 조리개의 셀의 작은 축 길이 보다 약간 더 있어야 합니다. 최적의 유리 모 세관 피펫은 모 세관 작용에 의해 단일 셀을 발음 수 있습니다. 그러나, 조리개의 직경이 너무 크면, 모 세관 비 생활 오염 물질 또는 심지어 (는) 다른 organism(s), 목표 셀 외에 그릴 것입니다.
최적의 조리개와 유리 모 세관 피 펫을 얻기 위해 다음 사항을 주의 하는 중요 하다. 첫째, 불꽃의 기둥 유리 모 세관 피 펫을가 열 하는 때 좁은 수 있어야 합니다. 다음, 파스퇴르 피 펫, 당기는 불꽃;에서 제거 그렇지 않으면, 파스퇴르 피 펫의 조리개 붕괴 됩니다.
장비 및 컨테이너가이 프로토콜에 표시 된 기본은 하 고 수정할 수 있습니다. 예를 들어 사용 하 여 멀티 잘 플레이트 한 잘 시계 안경 대신, 셀 세척 할 수 있다 더 효율적. 또한, 기타 유사한 것 들에 대 한 컨테이너를 교체하실 수 있습니다. 마지막 단계에서 문화 매체에 단일 셀을 전송 하 여 클론 문화를 설정할 수 있습니다.
멸 균된 용기를 준비 하 고 후드에서 axenic (오염된) 긴장을 설정 합니다. 오염을 방지 하기 위해, 그것은 이상 3 x 신선한 aliquots와 세척 단계를 반복 해야 합니다. 가끔은, 박테리아는 또한 항생제15을 추가 하 여 멸 균.
이 방법에 초점을 맞춘 desmid (Zygnematales) 절연, 하지만 유리 모 세관 피펫은 조리개의 크기를 바꾸어 서, 그것은 다르게 크기의 플랑크톤의 고립에 적용할 수 있습니다.

동산 (의 주문 Zygnematales) 조류, 일컬어 conjugatophytes, 차지 토지 식물1,2의 즉시 조상의 가장 가까운 살아있는 친척으로 주요 계통 발생 위치. 설립된 클론 문화 조류의 분류학, 생리, 그리고 유전자 연구의 광범위 한 지난 몇 년간 끌고있다. 자연적인 분야에서 미생물의 절연 기술을 오랜 전통3,4있다. 최근 몇 년 동안, cytometry 사용 하는 기술도 있다 자동화 된 격리 설립5. 클론 문화의 설립에 대 한 단일 셀을 가져오는 데 사용 하는 가장 일반적인 방법이입니다 유리 모 세관 피펫은6을 사용 하 여 단일 셀 격리. 이 전통적인 방법 기술과 정확한 실험 프로토콜에 필요합니다.
이 문서에서 설명 해 조류의 샘플링 필드 샘플 및 Closterium 종 같은 단 세포의 변화 조류의 클론 문화의 설립에서 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 합니다. 식물 세포를 포함 하는 물 샘플 필드 사이트 (예를 들면, 호수, 연못, 또는 논)에서 수집 됩니다. 세포는 유리 모 세관 피 펫을 사용 하 여 물 샘플에서 격리 하 고 씻어. 셀 16 h 빛: 8에서 24 ° C에서 질소 보충 매체 (CA 중간)를 포함 하는 테스트 튜브에 교양-h 어두운 정권. 이 메서드는 또한 클론 문화 생성 하 다른 미세 분리에 적합.

<table><tbody><tr><td>Sampling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, 일본</td><td>N-NO380T</td><td>메쉬 크기: 32 & 마이크로; m</td></tr><tr><td>휴대용 현미경 (예 : Nature Scope FABRE)</td> <td>Nikon, Japan</td><td>JAN : 4960759 206725</td><td>배율 : 20 배;</td></tr><tr><td>확대경 (예: Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., 일본</td><td>1985-20</td><td>배율 : 20 배;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. 일본</td><td>멸균 spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브 (나사 캡이 있는 50 mL 원심분리기 튜브)</td><td>Labcon, 미국</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>병 (100 mL 폴리카보네이트 병)</td><td>AS ONE Corporation, 일본</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 접시</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&nbsp; 조류 관찰을 위해.&nbsp; 60mm/처리되지 않은 접시</td></tr><tr><td><강한>마이크로피펫 준비</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫(면 플러그 9") Pasteur Pipettes)</td><td>Fisher Scientific, 미국</td><td>13-678-8B</td><td>7 &times; 225 mm</td></tr><tr><td>고무 전구 (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 &times; 40 mm</td></tr><tr><td>스테인리스 펜치</td><td>AS ONE Corporation, 일본</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>Single-cell isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>시계 유리 (혈액 반응 보드)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030</td><td>은 격리 중에 세포를 헹굽니다. 지름 22mm, 깊이 1mm</td></tr><tr><td>나사식 시험관&nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &Oslash; &times; 170mm</td></tr><tr><td>도립 광 현미경</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>조류 분리용.</td></tr><tr><td>플라스틱 접시</td><td>Asahi glass Co. Ltd., 일본</td><td>SH90-15E&nbsp;</td><td>&nbsp; 90 &번; 15의 mm</td></tr></tbody></table>

단 세포 변화 조류의 클론 문화 설립

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

다양 한 주제, 생리학, 유전학, 분류학, 미생물학 등의 연구에 사용 하기 위해 미세 클론 문화 확립에 필수적 이다. 따라서, 매우 클론 문화를 구축 하는 기술을 개발 하는 것이 중요 하다. 이 문서에서는, conjugating 조류의 클론 문화의 설립을 설명합니다. 물 샘플은 현장에서 수집 됩니다. 그 후, 세포를 유리 모 세관 피 펫, 미디어에 배치 하 고 클론 문화 생성을 위해 적당 한 조건 하에서 재배를 사용 하 여 격리 됩니다.

50 mL의 물 샘플 (Inba1) 한 샘플링 지점 호수 바 numa에서에서 수집 (pH 8.1 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)에 사쿠라 시, 치 바, 일본, 6 월 25 일, 2016. 물 샘플은 4-8 ° c.에 저장 된 Closterium sp.의 표본 수집 후 다음날 식물 세포를 포함 하는 물 샘플에서 분리 했다. 동일한 형태학의 15 식물 세포 (Inba1-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, 및-15) 샘플에서 고립 되었고 다음 세척 방법 피 펫을 사용 하 여 세척. 15 고립 된 단일 셀 조건된 CA 매체의 15 mL를 포함 하는 독립적인 테스트 튜브에 교양 있었다. 2 주 후 부 화, 세포 증식 9 테스트 튜브에서 관찰 되었다 [Inba1-1,-3,-4,-5 (그림 2a),-6,-9,-10,-(그림 2b), 12와-13; 표 2]입니다. 9 클론 문화 Inba1 샘플 분리 (그림 3)에서 설립 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> 그림 1 : 단일 셀 격리의 흐름. 첫 번째 시계 유리에서 (은)는 살 균을 원래 물 샘플에서 단일 대상 조류 셀 전송 매체. (b, c) 씻어 다음 시계 유리 셀을 다시 전송 합니다. 없는 다른 셀/오염 매체; 대상 보다는 때까지이 절차를 반복 해야 합니다. 3 개의 시계 유리는 예를 들어 여기에 다이어그램에 표시 됩니다. (d) 마지막으로, 성장에 대 한 적절 한 매체의 테스트 튜브를 씻어 셀을 전송. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> 그림 2 : 식물 세포의 사진 Closterium sp. (한) Inba1-5와 (b) Inba1-12 여기에 표시 됩니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> 그림 3 : Inba1 샘플에서 클론 문화의 설립. 2 주 동안 배양 시험관 바닥에서 촬영 했다. 별표는 셀 확산을 나타냅니다. 눈금 막대 = 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>미디어의 이름</td>
			<td>참조</td>
			<td colspan="2">코멘트</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura와 와타나베12
</td>
			<td>캘리포니아 (3)2·4H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>알 것3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH43
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-나2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 B12</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>비타민 b 복합체</td>
			<td>0.01 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>티 아민 HCl</td>
			<td>1 μ g</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV 금속</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td>0.1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH 7.2 NaOH로 조정</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P 4 금속</td>
			<td rowspan="7">Provasoli 및 Pintner13
</td>
			<td>나2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4 H2O</td>
			<td>3.6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1.04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td>나2무4·2H2O</td>
			<td>0.25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (EDTA;로 1:1 어 금 니)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(이렇게4)2·6H2O,</td>
			<td>70.2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 밀리 그램</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">100 mL를 만들기 위해 물을 추가합니다</td>
		</tr>
<tr>
<td>바른된 CA 매체</td>
			<td>아베 외7
</td>
			<td colspan="2">14-20 일에 대 한 신선한 CA 매체에 세포를 품 어. 교양된 매체 여과 질적 필터 종이 사용 하 여 수집 하 고 압력가 마로 소독 (15 분 동안 121 ° C)에 의해 필터링 된 매체를 소독.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">*에 NIES 1.04 mg ZnCl2 2.2 mg ZnSO4·7H2o.에 의해 대체 됩니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:이 연구에 사용 된 미디어의 공식.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>물 샘플</td>
			<td>셀의 이름</td>
			<td>문화 후 상태</td>
			<td>스트레인 이름</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>세포 증식</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>변경 되지</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 2:에서 격리 시험 요약입니다.

이 문서에서는, 종의 단 세포 변화 조류 자연 필드 사이트에서 수집 된 클론 문화의 설립을 설명 합니다.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

우리는 조류, 특히 단세포 접합 식물의 문자열을 설정하는 방법을 소개 할 것입니다. 균주를 확립하기 위해서는 현장 조사를 통해 조류를 포함하는 물 샘플의 수집이 필요합니다. 물 샘플에는 조류 이외의 이물질이 포함되어 있습니다.이 샘플에서는 단일 세포만 분리됩니다. THIL은 깨끗한 매체로 옮겨지고 반복적으로 세척됩니다. 격리는 이 프로세스를 통해 수행됩니다.살균은 신중하게 수행하면 가능합니다. 마지막으로, 분리된 세포는 시험관으로 옮겨지고 배양을 통해 균주가 설정됩니다. 여기서 우리는 다양한 형태가 확인되는 단세포 접합 식물에 초점을 맞춥니다.단세포 접합 식물은 호수, 습지 및 논과 같은 정체된 담수 지역에서 자랍니다. 이러한 환경에서 물을 함유한 조류 샘플을 수집하여 배양 균주를 생성합니다. 호수 환경에서 물 샘플을 채취하는 방법을 소개합니다.플랑크톤 그물은 호수 환경에 사용됩니다. 상부 그물 부분은 물이 투과됩니다. 그물에 잡힌 조류는 바닥 용기에 집중됩니다.십자형 메쉬를 사용하면 작은 조류가 통과할 수 있습니다. 미세한 메쉬는 쉽게 막힙니다. 목적에 따라 적절한 그물을 사용해야 합니다.농축수 샘플을 실험실로 가져옵니다. 단세포 접합 식물은 또한 습지나 논에서 자랍니다. 얕은 수역에서는 스포이드로 직접 샘플링합니다.물은 토양을 담지 않기 위해 토양 표면에서 조심스럽게 샘플링됩니다. 물 샘플에 조류가 포함되어 있는지 확인하십시오. 약 400마이크로미터 이상의 조류는 루프를 통해 직접 관찰됩니다.작은 조류의 경우 휴대용 현미경이 사용됩니다. 물 샘플은 페트리 접시의 뚜껑에 장착되고 본체로 덮여 있습니다. 이 방법은 샘플이 움직이지 않도록 하고 관찰을 더 쉽게 만듭니다.이 물 샘플에서 조류의 분리가 수행됩니다. 물 샘플에서 단일 세포 조류를 분리하는 데 사용되는 피펫을 만드는 방법을 소개합니다. 격리를 위한 피펫을 만드는 방법.알코올 버너에 불을 붙입니다. 멸균 파스퇴르 피펫을 화염에 가열합니다. 피펫을 불에서 내리고 늘립니다.피펫의 끝을 적절한 길이로 자릅니다. 용융의 모세관은 반드시 버리십시오. 불꽃이 꺼졌는지 반드시 확인하십시오.격리를 위한 미세한 피펫을 생산하려면 불꽃이 깜박이지 않는지 확인해야 합니다. 불꽃을 날카롭게하고 끝에서 피펫을 녹입니다. 스트레칭을 할 때 피펫이 불에서 꺼졌는지 확인해야 합니다.보라, 휘어지는 부분이 가장 훌륭하니라. 팁에 이상적입니다. 피펫의 거품은 팁의 크기를 나타냅니다.격리할 셀에 적합한 크기를 선택합니다. 표시된 것은 10 - 20 마이크로미터의 셀 너비에 대한 것입니다. 요람에 필요한 충분한 수의 시계 안경이 준비되어 있습니다.매체를 시계 유리에 놓습니다. 현장에서 수집된 물 샘플에서 표적 세포를 분리합니다. 매우 미세한 유리관은 모세관 반응으로 인해 물을 흡수합니다.유리관을 세포 옆에 놓아 들어 올리십시오. 시계 유리의 매체에서 셀을 분리하고 새 시계 유리로 옮깁니다. 새 피펫을 사용하여 첫 번째 시계 유리에서 두 번째 시계 유리로 셀을 옮깁니다.그리고 세 번째에 또 다른 피펫. 마지막으로, 분리된 셀은 시험관으로 옮겨집니다. 이 시험관의 배양을 통해 세포 증식이 촉진되고 균주가 확립됩니다.성공할 경우 문화는 2주 안에 녹색으로 바뀔 수 있습니다. 이 연구에서는 일본 비와(Biwa)의 호수에서 채취한 물 샘플에서 15개의 세포를 분리했습니다. 2주 후, 빨간색 프레임으로 표시된 9개의 시험관에서 녹색 침전물이 관찰되었는데, 이는 조류의 세포 정제가 진행 중임을 나타냅니다.퇴적물은 분리된 세포에 대해서만 관찰되었으며, 이는 세포 분리가 성공적으로 이루어졌음을 보여주었습니다. 이것은 독특한 조류 배양 균주를 확립하는 우리의 방법입니다. 식품과 같은 허용된 조건에서 격리를 수행하는 경우 axenic culture 균주를 설정할 수 있습니다.

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

교미 및 tetrad 분리는 유전자 분석을 위해...

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

따개 비 (Amphibalanus) Balanus improvisus osmoregulation 및 antifouling 공부에 대 한 모델입니다. 그러나, 자연 계절 산란 cyprid 애벌레의 예측할 수 없는 공급을 생성합니다. 여기, B. improvisus 의 모든-1 년-라운드 경작에 대 한 프로토콜 설명, 애벌레의 생산을 포함 합니다. 유전자 표현 연구에 교양된 barnacles의 사용을 보여 줍니다.

해양 모델-따개 비 Balanus improvisus 경작 및 유전자 발현

여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.

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돌리올리다 게겐바우리종을 포함한 돌리올리드는 전 세계적으로 생산적인 아대륙 선반 시스템에서 발견되는 생태학적 중요성의 작은 젤라틴 해양 동물플랑크톤이다. 이 섬세한 유기체를 배양하는 어려움은 그들의 조사를 제한합니다. 본 연구에서는 돌리올리야게겐바우리(doliolid Dolioletta gegenbauri)를수집, 사육 및 유지하기 위한 재배 접근법을 설명합니다.

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펠라곤 코스모폴리탄 라르바천, 오이코플레우라 디오이카의 간소화된 샘플링 및 재배

천연 가스 발전소 연도 가스의 이산화탄소를 활용하여 열린 경마장 연못에서 미세 조류를 재배하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 연도 가스 주입은 pH 센서로 제어되며, 미세조류 성장은 광학 밀도의 실시간 측정으로 모니터링됩니다.

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산호 식민지에서 폴립 구제 금융을 유도하여 실험실 실험 사용을위한 개별화 된 미세 전파를 얻습니다.

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이 비디오는 새로운 문화, 병아리의 배아는 최대 24 시간까지 계란 이외의 양식하는가하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 초기 개발 (14 솜으로 원시적인 승리.) 마우스 E7 - 9에 해당하는 기간 동안 공부를 하나 있습니다. 이 기술의 응용은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry에 electroporation을 포함합니다.

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