신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

이 방법은 사구체의 기능적 및 구조적 표현형에 관한 사구체 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 신장 병리학의 기계론적 분석을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 사구체 질환의 모든 정격 모델에 적용할 수 있다는 것입니다. 소변 알부민 크레아티닌 비율을 평가하기 위해, 6-8주 된 수컷 쥐 한 마리를 조용한 방의 물과 강화 다이어트 식품이 들어 있는 대사 쥐 케이지에 넣습니다.

6시간 후, 마우스를 일반 수용소로 되돌리고 각 케이지에서 최소 50마이크로리터의 기준 소변 샘플을 채취하고 매주 한 번에서 한 달에 한 번으로 소변 채취를 반복합니다. 실험 종료점에서 각 동물의 복부에서 신장을 적출하고 얼음처럼 차가운 PBS로 장기를 세척합니다. 피질 사구체를 검사하려면 신장 피질의 한 극을 제거하고 1입방 밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다.

깊은 병치근 사구체를 검사하려면 수질의 작은 부분을 제거하고 1입방 밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다. 그런 다음 조직의 각 절편에서 나온 단편을 5밀리리터의 2.5% 글루타르알데히드 용액이 들어 있는 개별 전자 현미경 바이알에 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다. 피질 및 병치근 사구체의 조직학을 위해 신장의 위쪽 1/3을 제거하고 섭씨 4도에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 5ml로 고정합니다.

그런 다음 고정 조직을 파라핀에 삽입하기 전에 24시간 동안 70% 에탄올 5ml로 옮깁니다. 피질 및 수질 사구체의 면역불소화 화학 분석을 위해 신장의 1/3을 조직 주형에 넣고 조직을 최적의 절단 온도 화합물에 담그십시오. 그런 다음 화합물이 얼 때까지 드라이 아이스에 곰팡이를 놓고 절단될 때까지 섭씨 80도에서 샘플을 보관합니다.

단백질 분석을 위해 3 x 2 입방 밀리미터 조각의 신장 피질을 0.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 넣고 샘플을 액체 질소에 급속 동결하여 섭씨 80도에서 보관합니다. RNA 분석을 위한 장기 조직 보관의 경우, 방금 시연한 대로 3x2입방밀리미터 신장 조각을 스냅 동결한 후 섭씨 80도 보관을 위해 5부피의 RNase 안정화 용액을 추가합니다. 사구체 분리를 위해 남은 신장 조직을 잘라내고 조직 조각을 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 5ml의 포유류 링거 용액에 넣고 얼음 위에 올려 즉시 체질합니다.

사구체를 분리하려면 기공 크기가 오름차순으로 되는 체를 유리 비커에 쌓고 신장 조각을 상단 425미크론 기공 크기의 체에 놓습니다. 다음으로, 주사기 플런저와 1% BSA가 보충된 신선한 얼음처럼 차가운 포유류 링거 용액을 사용하여 첫 번째 체를 통해 신장 조직을 으깨십시오. 신장 조각이 통과할 때 상단 체를 제거하고 각 체를 통해 신장 조각을 차례로 계속 밀어 넣습니다.

100 및 70 미크론 체만 남았을 때, 마지막 두 개의 체에 의해 유지된 사구체 수확물을 얼음 위에 1% BSA가 보충된 10 밀리리터의 신선한 포유류 링거 용액이 있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 3ml의 사구체 현탁액을 2개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 사이에 분리하고 원심분리로 사구체를 펠릿화합니다. 상등액을 제거한 후 사구체를 액체 질소에 넣어 섭씨 80도에서 동결하여 나중에 단백질과 RNA를 추출할 수 있습니다.

그런 다음 남은 사구체 용액을 섭씨 37도의 수조에 넣어 광학 현미경 스테이지의 사구체 투과성 리그에 주입합니다. 온전한 개별 사구체를 포획하면 마이크로피펫으로 Bowman's 캡슐과 관형 조각을 제거하고 기록을 시작하고 1%BSA가 보충된 신선한 링거 용액으로 사구체를 관류합니다. 30초 후, 퍼퓨세이트를 농축된 8%BSA 링거 용액으로 전환합니다.

10초 동안 관류한 후 퍼퓨세이트를 다시 1%BSA 링거 용액으로 전환하고 기록을 중지합니다. 사구체 세포와 잔류 기질의 상세한 시각화를 위해 파라핀이 삽입된 고정된 신장 피질 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 건조시킨 다음 연속 자일렌 및 하강 에탄올 침지로 파라핀을 제거합니다. 샘플을 증류수에 5분 동안 재수화하고 흄 캐비닛의 주기적인 산성 용액에서 슬라이드를 배양합니다.

5분 후, 증류수 100ml에 5분간 3회 세척하여 슬라이드를 헹군 다음 Schiff의 시약에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 흐르는 수돗물로 슬라이드를 5분 동안 세척하고 3초 동안 헤마톡실린으로 얼룩을 제거한 후 15분 동안 흐르는 수돗물로 철저히 헹굽니다. 그런 다음 상승 에탄올 침지와 2회 연속 3분 자일렌 침지로 슬라이드를 탈수합니다.

공기 건조 후, 슬라이드는 400x 배율의 광학 현미경에서 사구체 구조를 평가하기 위해 크실렌 기반 장착 매체로 장착할 수 있습니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF-A) 녹아웃 마우스는 야생형 깔짚 짝 대조군에 비해 10주까지 진행성 알부민뇨가 발생하는 반면, VEGF165b가 과도하게 발현된 녹아웃 동물은 이 상태로부터 보호됩니다. VEGF-A 녹아웃 마우스는 야생형 대조군에 비해 사구체 투수성이 크게 증가했으며, 이는 VEGF-A165b 과발현에 의해 부분적으로 구제됩니다.

VEGF-A 녹아웃 마우스에서 신장 피질 절편의 주기적인 산 Schiff 염색은 광학 현미경 분석에 의해 사구체 구조적 이상을 나타내지 않습니다. 그러나 전자 현미경 분석에서 녹아웃 마우스는 사구체 기저막 폭 증가, 내피 페네스트라 수 감소, subpodocyte 공간 적용 범위 감소, 평균 podocyte 슬릿 폭 증가를 보여주었지만 평균 슬릿 수는 변하지 않았습니다. VEGF-A 녹아웃 동물에서 VEGF165b 과발현은 사구체 기저막과 슬릿 폭의 변화를 구제합니다.

그러나 VEGF165b 과발현은 변경된 fenestrae 수 또는 subpodocyte 공간 범위에 영향을 미치지 않습니다. 체질된 사구체로부터 추출된 RNA는 VEGF165b 과발현 녹아웃 마우스에서 인간 VEGF165b mRNA 발현을 확인하며, 이는 동물의 노크에서 VEGF165b 과발현에 의해 구출된 VEGF-A 녹아웃 마우스에서 VEGFR2의 감소된 발현과 상관관계가 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 알부민과 물에 대한 사구체 투과성 평가를 포함하여 사구체 질환의 쥐 모델 평가를 위해 전체 신장 정밀 검사를 완료하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.