Name: 신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 배우세요 콩팥 기능 및 구조적 표현형을 평가하는 포괄적인 콩팥 검사법을 마우스 사구체 질환 모델에 적용하는 방법을. 이 기법은 VEGF-A 녹아웃 마우스의 투과성 변화를 분석하여 신장 병리학의 기전 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 영국 심장 재단, 리처드 밝은 VEGF 연구, 믿음과 MRC에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Humtstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+structural+kidney+damage+in+spontaneously+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Development of structural kidney damage in spontaneously hypertensive rats.</a> Journal of Hypertension. 30 (6), 1087-1091 (2012).</li>
<li>Kitada, M., Ogura, Y., Koya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+diabetic+nephropathy%3A+their+utility+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology+and+Renovascular+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent models of diabetic nephropathy: their utility and limitations.</a> International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 14 (9), 279-290 (2016).</li>
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<li>Kujal, P., Vernerova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%2F6+nephrectomy+as+an+experimental+model+of+chronic+renal+failure+and+adaptation+to+reduced+nephron+number%5BTitle%5D)+AND+%22Ceskoslenska+Fysiologuie%22%5BJournal%5D)">5/6 nephrectomy as an experimental model of chronic renal failure and adaptation to reduced nephron number.</a> Ceskoslenska Fysiologuie. 57 (4), 104-109 (2008).</li>
<li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
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<li>Salmon, A. H., Neal, C. R., Bates, D. O., Harper, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+increases+the+ultrafiltration+coefficient+in+isolated+intact+Wistar+rat+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor increases the ultrafiltration coefficient in isolated intact Wistar rat glomeruli.</a> Journal of Physiology. 570 (Pt 1), 141-156 (2006).</li>
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<li>Oltean, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor-A165b+is+protective+and+restores+endothelial+glycocalyx+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor-A165b is protective and restores endothelial glycocalyx in diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 26 (8), 1889-1904 (2015).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 각 방법의 중요 한 단계 (uACR 및 플라즈마 크 측정), 전체적으로는 신장에의 침투성의 평가 포함 하 여 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석에 대 한 허용의 침투성 개별 glomeruli (사 LpA / V나), 구조 변경 (파, Trichrome 블루, 그리고 EM), 단백질 지 방화 (면), 그리고 사 유전자 발현 (RT-PCR 및 서쪽 blotting)의 검사. 이 메서드는 키 사 기능 신장 질병 마우스 모델에서의 전체 평가를.
GFB의 침투성을 평가할 때 효과적인 측정17,18로 기존의 uACR 또는 24 시간 알 부 민 배설 속도 사용 하 여 많은 연구 하셨습니다. 비록 이러한 기술을 허용 전체 GFB 침투성의 평가, 개별 사 침투성 평가 및 glomeruli 사이 유사에 대 한 허용 하지 않습니다. 이전 연구는 사 LpA의 측정 발견 / Vi GFB 침투성5,9에 변화의 더 민감한 측정 될. 사실,이 문서에서 설명 하는 대표적인 결과에서 14 주에 게시 VEGF-A 코의 유도, VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐 VEGF-A 코 쥐;에 비해 상당히 낮은 uACR 그러나,이 결과는 사 LpA에에서 반영 되지 않습니다 / V나 측정, VEGF A165b 크게 방지 하지 않았다 GFB 침투성 (그림 1 및 그림 2)5증가. 이 신장 침투성 및 개별 glomeruli의 침투성을 평가 하기 위해 여러 개의 분석 실험을 사용의 중요성을 보여줍니다. 또한, 사 LpA / V나 oncometric 분석 결과 제안 같은 신장에서 개별 glomeruli의 침투성 크게 다를 수 있습니다, 특히 질병 모델5,10, 19. 사 LpA를 측정 한 제한 / V나 그것만 실험 끝점;에서 수행할 수 있습니다 따라서, 일반 uACR 측정 실험 끝점의 표시를 제공 해야 합니다.
기능 형 평가, 이외에 현재 메서드는 또한 구조 및 ultrastructural 표현 형의 평가 권장 합니다. 이 행 해질 수 있다 파, trichrome, 같은 얼룩은 얼룩;의 선택을 사용 하 여 각 사 형태학의 다양 한 측면을 평가 하기 위해. 종종 마우스 모델의 경우는 사 병의 급성 모델에는 어떤 주요 구조적 이상이 있습니다 훈련된 신장 병리학이이 얼룩을 사용 하 여 감지 하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, EM 수행 평가 매개 GBM, 내 피 fenestrae 크기 및 수, 및 podocyte 특성의 정량적 측정을 허용 GFB의 열 대권 외 건의 된다. 이러한 측정 수행에 최소한의 교육 요구 및 셀-종류/구조는 질병 모델에 영향을 확인 하기 위해 조사를 수 있습니다. 예 대표 결과에 VEGF-A 코 마우스 발견 사 질병의 가벼운 모델로, 따라서, 아무 주요 구조적 이상이 파스 얼룩에 참석 했다. 그러나, podocyte 특정 VEGF-A 코 않았다 유도 GBM, podocytes, 및 내 피 세포에 대 한 변경 사항을 사 울트라 구조5를 조사 하면. 불행 하 게도, 현재의 방법에서 설명 하는 그들에 대 한 신장의 준비 또한 GFB19의 침투성에 중요 한 영향으로 알려져 내 피 glycocalyx의 감지를 사용 하지 않습니다. Glycocalyx 깊이 정확 하 게 측정 하기 위해서는 신장 해야 합니다 2.5%도 내 피 glycocalyx 라벨에 대 한 1 %Alcian 블루 perfuse-고정 Oltean 외19에 설명 된 대로.
기능과 구조 표현 형 평가 되어, 일단 다른 유전자 및 통로의 식/활성화 패턴은 glomeruli에서 특히 평가 다음 수 있습니다. 이전 초 구조 평가 관련 된, podocyte 또는 내 피-특정 유전자/경로 검사 해야 합니다 여부를 나타내는 형식/사 구조 셀에 대 한 몇 가지 정보를 줄 수 있습니다. 예를 들어 VEGF-A 코 쥐에서 대표적인 결과에서 내 피 fenestrae 수에 있는 감소 (그림 3D) 관찰 되었다; 따라서, VEGF A 통로에 관련 된 것으로 알려져 내 피 마커의 사 단백질 발현 조사 되었다; VEGFR-2 (그림 4B)5. glomeruli에 단백질의 표현 뿐만 아니라 그들의 지 방화 수 또한 구상 될 경우를 사용 하 여. 연구에서 장 외20, podocyte 특정 overexpression GLUT1의 공동 podocin와 증가 GLUT1 지역화 하는 경우 의해 podocytes에서 확인 됐다.
사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교 사 질병 마우스 모델에서 신장 기능을 평가 하기 위해이 문서에서 설명 하는 메서드를 사용 하 여 수에서 완전히 평가 하 사 형 여러 측면입니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 이 메서드는 질병 고기 및 잠재적인 치료제의 평가에 모두 사 기능으로 미래의 수사에 쉽게 적용할 수 있습니다.
결론적으로,이 일반 및 적응 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에 대 한 전체 신장 작업을 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 이러한 murine 모델 포함 자발적인 모델을 자연스럽 게 고혈압 쥐 (SHR)1, streptozotocin (STZ)-당뇨병 쥐와 쥐2, 유도 및 db/db 타입 II 당뇨병 쥐3와 같은 유전자 조작된 모델 기본 podocyte 특정 초점 단편 사 경화 증 (FSGS) 모델4, podocyte 특정 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF-A) 노크 아웃 (VEGF-A 코) 모델5, 그리고 Alport 증후군6, 모델 인수 5/6 신7 과8의 일방적인 ureteral 방해 (UUO) 모델 등 모델. 이러한 모델에서 사 기능의 다양 한 측면을 평가, 몇 가지 기술을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 종이의 목적은 완전히 평가 사 기능 신장 질환의 마우스 모델에서 수행 해야 하는 포괄적인 작업 최대 보여.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 근거는 그것 완전히 여러 측면에서 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 평가 사 침투성, 단백질, 물, 사 구조 이상, 그리고 식/mRNAs 및 단백질 정상 사 기능에 대 한 필수의 접합에 변화를 포함 한다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있다. 이것은 이러한 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요한은 질병의 메커니즘에 대 한 중요 한 정보 이다.입니다.
문학, 그것은 사 질병 표현 형의 소변에서 알 부 민 증가 수준에 의해 결정 됩니다의 마우스 모델을 제시 하는 일반적인 발생. 그러나, 증거가 제안 사 기능을 결정 하는 하나의 방법을 하지 항상 효과; 총 신장 기능, 그리고 개별 glomeruli의 정보를 제공 합니다만 요 알 부 민 배설 속도 또는 오 줌 알 부 민 크 비율 (uACR)를 측정. 이전 연구 침투성 다른 glomeruli 같은 신장5,,910에서에서 변화할 수 있다 설명 했다. 또한, 개별 glomeruli의 침투성의 평가 평가 사 기능;의 더 민감한 방법 개별 사 물 침투성 측정 기술 (LpA / V나) uACR9측정 보다 사 기능에서 변화에 더 민감한 것으로 나타났습니다. 이 분석 결과 저항 proteinuria c57BL/6 배경11등을 마우스 모델에서 유용 합니다. 현재 방법 종이의 장점은 그것은 알 부 민을 총 신장 침투성 뿐만 아니라 개별 사 침투성 물 검사.
사 구조적 이상이의 검사는 종종 얼룩 등 정기 산 Schiff (PA), trichrome, 그리고 실버 얼룩의 배터리에 의해 평가 됩니다. 이러한 점수 매기기 방법을 통해 신장 질병의 수준을 평가 하는 훈련된 신장 병리학 자 가능 모든 좋은 방법, 사 매크로 구조에 변화에 항상 나타나지 않으면 비록 급성 신장 손상 모델12. 이 메서드는 실행 위에서 설명한 신장 조직학 기술, 뿐만 아니라 사 울트라 구조 또한 평가 되어야 합니다 전자 현미경 (EM)를 통해 제시 한다. 얼룩진된 glomerulus 상대적으로 일반 조명 현미경; 정상 볼 수 있습니다. 그러나, EM, 작은 변화, 사 지하실 멤브레인 (GBM) 폭에서과 평가 시 podocyte 발 과정 겸, 내 피 fenestrations, 그리고 하위-podocyte 공간 범위 분석 이다. 따라서, 사 울트라-구조와 마이크로 구조 사 역의 메커니즘을 확인 평가 생명 이다.
평가 사 구조 이상, 뿐만 아니라 사 질병의 메커니즘을 더 명료 하 mRNA와 단백질 표정 및 접합로 단백질 활성화 (예를 들어, 인 산화), 변화를 시험 한다. 사 병을 볼 때 또는, 예를 들어, 코/오버-expressing 유전자는 podocyte 전용 VEGF-A 코 마우스5, 같이 사 셀에 특히 중요 하다 단백질 mRNA의 변화만 내 검사는 사 세포, 그리고 전체 신장 하지입니다. 이 프로토콜 있는 glomeruli 마우스 신장 피 질에서 격리 되며 다음 단백질/RNA 격리 하는 방법을 설명 합니다. 이 질병 모델의 glomeruli 단백질/mRNA dysregulation의 특정 분석을 수 있습니다.
이 프로토콜의 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하는 사 질병 마우스 모델에서 실행 되어야 하는 최대-전체 신장 작업에 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

<table><tbody><tr><td>대사 케이지</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris 완충 식염수(10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>마우스 알부민 ELISA 정량 세트</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA 기질 용액</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>황산</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 339741</td><td></td></tr>, <tr><td>SPECTRstar nano</td>, <td>BMG, Labtech</td>, <td>SPECTRstar nano 또는 동급의</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 솔루션</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr>, <tr><td>4-15% 프리캐스트 단백질 겔</td>, <td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr>, <tr><td>4x Laaemmli 샘플 버퍼</td>, <td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>미니 트랜스 블롯 셀</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris 러닝 버퍼</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>크레아티닌 컴패니언</td><td>엑소셀</td><td>1012 스트립 플레이트</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylate 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x 인산염 완충 식염수</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>아세트산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산</td><td>염 시그마-알드리치</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)포도</td>당 <td>시그마-알드리치</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 혈액 수집 튜브</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G 바늘</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 유리 바이알</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml 폴리프로필렌 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>일회용 조직 금형</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>마우스 수술 절개 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr>브리스톨 대학교에서 제작된<td>사구체 투과성 장비</td><td>- 상업적으로 사용할 수 없음</td><td>LpA 장비의 인용: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 체</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>PAS(Periodic Acid-Schiff) 염색 시스템</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>예: 957000H</td><td></td></tr><tr><td>소수성 펜</td>, <td>Abcam</td>, <td>ab2601</td><td></td></tr>, <tr><td>Nephrin(1243-1256), 항체</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr>, <tr><td>Anti-Podocin</td><td>, Sigma-Aldrich,</td><td>P0372-200UL,</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td>, <td>BD, Biosciences,</td><td></td> 550274 <td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor, 2차 항체</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 세포 용해 완충액</td>이 있는 Vectashield 장착 배지 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 중단 칵테일</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x 전달 완충액</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅</td><td>피셔</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>DNA I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV 역전사효소</td><td></td><td></td><td></td></tr>용 <tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr> ECF 기질 <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>랜덤 프라이머</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>리보뉴클레아제 억제제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 물</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>형광등 현미경</td><td>라이카 마이크로시스템즈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 분석 소프트웨어</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM 현미경</td><td>브리태니커</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

인간의 신장 질환을 모방 murine 모델의 사용은 점점 일반적 되고있다. 우리의 연구는 당뇨병 신 장병 및 podocyte 관련 VEGF A 녹아웃 쥐; 사 기능 평가에 초점을 맞춘합니다 따라서,이 프로토콜 설명 전체 신장 작업-최대 광대 한 양의 신장 및 단일 마우스에서 얻을 수 사 기능에 관한 정보를 사용 하면 사 병의 이러한 마우스 모델을 평가 하기 위해 우리의 실험실에 사용 합니다. 사 기능을 평가 하기 위해 문학에서 제시 하는 다른 방법, 비교이 문서에 설명 된 메서드를 사용 하 여 여러 측면에서 완전히 평가 하 사 형 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여 연구원 모델의 신장 형을 결정 하 고 표현 형을 개발 하는 왜에 관해서는 메커니즘을 평가할 수 있습니다. 질병의 기계 장치에 중요 한 정보는이 모델에 잠재적인 치료도 검토할 때 필요 합니다. 방법의 구조와 매우 구조 시험 뿐만 아니라 오 줌 알 부 민 크 비율 및 개별 사 물 침투성, 측정을 통해 사 여과 방 벽의 상세한 기능 평가 대 한 허용 정기 산 Schiff 얼룩이 및 전자 현미경을 사용 하 여. 또한, mRNA와 단백질 수준에 유전자 dysregulated의 분석을 사 기능의 기계적 분석을 수 있습니다. 이 프로토콜 사 질병의 모든 마우스 모델에 적용 될 수 있는 일반 하지만 적응할 수 있는 방법을 설명 합니다.

야생 타입 (WT), (VEGF-A 코), 밖으로 유도할 수 있는 podocyte 전용 VEGF A 노크와 VEGF-A 코 X Neph-VEGF165b 쥐 대사 케이지를 사용 하 여 소변 수집 (VEGF-A 코 쥐-인간의 VEGF A165b isoform에 podocytes에서 표현 하는 구성 방식)입니다. 측정 오 줌 알 부 민 크 비율의 주 0, 4, 10, 14에서 VEGF-A 코의 doxycycline 유도 후, 시 VEGF-A 코 쥐 10 주 WT littermate 컨트롤에 비해 진보적인 단백뇨를 개발. 그림 2A, 및 그림 2B에 각 마우스 값의 기준선에 정규화 된 절대 값을 볼 수 있습니다. 그러나,에서 단백뇨 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 생쥐 (그림 2)에서 관찰 되지 않는 그 VEGF A165b은 단백뇨5의 모델에서 보호입니다.
사 LpAV나 개별 glomeruli WT, VEGF-A 코, VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 신장에서 sieved에서 측정 했다. 어떻게는 glomerulus는 고 수축의 예로 그림 3A에서8 %BSA perifused 표시 하면 관찰. 이 수축 사 LpA를 결정 하는 데 사용은 / V나 각 glomerulus (그림 3B)에 대 한. VEGF A 코 쥐 했다는 크게 증가 사 LpA / V나 14 주에 WT 제어 glomeruli에 비해 VEGF 코 유도 포스트. 비록 낮은 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐, 증가 사 LpA / V나 14 주5에서 VEGF A165b-식으로 하지 못했습니다.
싶어 서 신장 피 질 부분의 VEGF-A 코의 유도 후 14 주 얼룩 VEGF-A 코 또는 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 생쥐 (그림 4A)에서 어떤 사 구조 이상 공개 하지 않았다. 그러나, 그들을 통해 사 울트라 구조 분석, 시 VEGF-A 코 쥐 했다 증가 GBM 폭을 개발, 내 피 fenestrae의 수를 감소, SPS 범위 감소 및 평균 podocyte 슬릿 폭을 증가 (그림 4C-4 층 ). 평균 podocyte 피트 폭 및 슬릿 변하지 않게 남아 있었다 (그림 3B 및 3 세대)의 수를 처리합니다. -표현의 VEGF-A 코 쥐에서 VEGF A165b는 GBM을 변화를 방해 하 고 슬릿 폭 (그림 4C 와 4 층). 그러나, A VEGF165b이 했다 변경 된 fenestrae 수와 SPS 범위 (그림 4D 및 4E)5에 영향을 주지 않습니다.
RT-PCR 체질된 glomeruli에서 추출한 RNA에 수행 이라고 밝혔다 인간의 VEGF A165b mRNA만 (그림 5A) VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에. VEGF A165b ( -식에 의해 방지 되었다 VEGF-A 코 생쥐에서 감소 VEGFR-2의 사 단백질 표정 발견 체질된 glomeruli 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 통해 단백질의 수준을 평가 하 고에서 단백질을 추출 하는 경우 그림 5B 와 5 C)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> 그림 1입니다. 사 침투성 (LpA) 장비의 도식 설정. (A)는 glomerulus 적발 (B) 흡입을 사용 하 여 홀더 내 micropipette에 안정성에 대 한 마운트에 고정 됩니다. (C) 사각형 microslide입니다. (D) 4 X 비디오 카메라와 현미경의 목적. (E) 37 ° c 1 %BSA 솔루션 따뜻하게 ((F)) 8 %BSA 솔루션 37 ° c 예 열 (G) 원격 탭 베어링 두 포함 하는 perifusate 라인 빠른 perifusate 교류를 허용 합니다. (H) 다음은 glomerulus 목욕 microslide로 perifusate의 경로입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> 그림 2입니다. 요 알 부 민 크 비율입니다. (A) uACR 값 0, 4, 10, 및 14 주 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐에서 VEGF-A 코의 유도 후에. (B) 같은 uACR 값을 기준 값 (주 0) 각 개별 마우스의 정규화. uACR 주 10와 14 WT littermate 컨트롤에 비해 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 방해 했다 VEGF-A 코 쥐에 크게 증가 (* p &lt; 0.05; 양방향 ANOVA, 쌍; 사이의 비교에 대 한 보정 n = 4-12 시간 포인트; 당 쥐 오차 막대: [SEM] 의미의 표준 오류). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> 그림 3입니다. 사 물 침투성의 측정입니다. (A) 는 glomerulus 흡입; 통해 micropipette에 잡힌 perifusate 1 %BSA (Ai)에서 8 %BSA (좋아), 전환 그리고 사 수 축을 관찰. (B) 측정 전후에 8 %BSA 스위치를 사용 하 결정 사 LpA / V나. (C) 마우스 VEGF-A 코 개발 한 증가 사 LpA / V나 14 주에 포스트 VEGF-A WT 컨트롤에 비해 코의 유도. 이것은 크게 막을 수 없습니다 VEGF-A X Neph VEGF-A-165b 쥐에 있는 (* p &lt; 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 4-9 마우스, 15-30 glomeruli; 오차 막대: sem의). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> 그림 4입니다. 사 구조 분석입니다. (A) 파 신장 피 얼룩 WT, VEGF-A 코와 VEGF-A X Neph-VEGF-165b 쥐 (Ai-iii)에서 glomeruli에 어떤 구조적 이상이 표시 하지 않았다. EM은 VEGF-A 코 glomeruli (Aiv-vi)에 매우 구조적 이상이 나타났다. (B) 평균 FPW 그룹 사이 변화 하지 않았다. (C)는 GBM 증가 VEGF-A 코 glomeruli는 VEGF A165b. fenestrae 수 VEGF-A 코 glomeruli, VEGF A165b. (E)는 SPS 보도 의해 불변에 남아 있었다 감소 되었다 (D) 에 의해 방지 되었다 이었다 VEGF-A 코 glomeruli, 또한 VEGF A165b. 슬릿 폭 평균 VEGF-A 코 glomeruli에 증가 되었다 (F) 불변에 남아 있었다에서 감소는 VEGF A165b. (G) 슬릿 수에 의해 방지 되었다 아니었다 변경 3 개 그룹 사이 (* p &lt; 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3 마우스, 9 glomeruli; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> 그림 5. 마커의 mRNA와 단백질 표정. (A) RT-PCR 인간의 VEGF A165b mRNA 표현 했다 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b 쥐에서 체질된 glomeruli 분명만 보였다. (B) 서 부 럽 표시는 VEGFR-2 단백질 표정 VEGF-A 코 glomeruli 아래로 통제 되는 VEGF-A 코 X Neph-VEGF-A165b glomeruli에서 방지 되었다 (* p &lt; 0.05; 한 가지 방법은 ANOVA, Bonferroni 보정 쌍; 사이의 비교에 대 한 n = 3-6 쥐; 오차 막대: sem의). 이 그림은 스티븐 스 외5에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에는 전체 신장 작업 업 사 질병 마우스 모델에서을 수행 하는 설명 합니다. 사 병의 모든 마우스 모델에 적용할 수 있는 사 기능의 자세한 기능, 구조, 및 기계적 분석 방법 허용.

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

이 방법은 사구체의 기능적 및 구조적 표현형에 관한 사구체 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며 신장 병리학의 기계론적 분석을 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 사구체 질환의 모든 정격 모델에 적용할 수 있다는 것입니다. 소변 알부민 크레아티닌 비율을 평가하기 위해, 6-8주 된 수컷 쥐 한 마리를 조용한 방의 물과 강화 다이어트 식품이 들어 있는 대사 쥐 케이지에 넣습니다.6시간 후, 마우스를 일반 수용소로 되돌리고 각 케이지에서 최소 50마이크로리터의 기준 소변 샘플을 채취하고 매주 한 번에서 한 달에 한 번으로 소변 채취를 반복합니다. 실험 종료점에서 각 동물의 복부에서 신장을 적출하고 얼음처럼 차가운 PBS로 장기를 세척합니다. 피질 사구체를 검사하려면 신장 피질의 한 극을 제거하고 1입방 밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다.깊은 병치근 사구체를 검사하려면 수질의 작은 부분을 제거하고 1입방 밀리미터 조각으로 깍둑썰기합니다. 그런 다음 조직의 각 절편에서 나온 단편을 5밀리리터의 2.5% 글루타르알데히드 용액이 들어 있는 개별 전자 현미경 바이알에 넣고 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다. 피질 및 병치근 사구체의 조직학을 위해 신장의 위쪽 1/3을 제거하고 섭씨 4도에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드 5ml로 고정합니다.그런 다음 고정 조직을 파라핀에 삽입하기 전에 24시간 동안 70% 에탄올 5ml로 옮깁니다. 피질 및 수질 사구체의 면역불소화 화학 분석을 위해 신장의 1/3을 조직 주형에 넣고 조직을 최적의 절단 온도 화합물에 담그십시오. 그런 다음 화합물이 얼 때까지 드라이 아이스에 곰팡이를 놓고 절단될 때까지 섭씨 80도에서 샘플을 보관합니다.단백질 분석을 위해 3 x 2 입방 밀리미터 조각의 신장 피질을 0.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 넣고 샘플을 액체 질소에 급속 동결하여 섭씨 80도에서 보관합니다. RNA 분석을 위한 장기 조직 보관의 경우, 방금 시연한 대로 3x2입방밀리미터 신장 조각을 스냅 동결한 후 섭씨 80도 보관을 위해 5부피의 RNase 안정화 용액을 추가합니다. 사구체 분리를 위해 남은 신장 조직을 잘라내고 조직 조각을 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 5ml의 포유류 링거 용액에 넣고 얼음 위에 올려 즉시 체질합니다.사구체를 분리하려면 기공 크기가 오름차순으로 되는 체를 유리 비커에 쌓고 신장 조각을 상단 425미크론 기공 크기의 체에 놓습니다. 다음으로, 주사기 플런저와 1% BSA가 보충된 신선한 얼음처럼 차가운 포유류 링거 용액을 사용하여 첫 번째 체를 통해 신장 조직을 으깨십시오. 신장 조각이 통과할 때 상단 체를 제거하고 각 체를 통해 신장 조각을 차례로 계속 밀어 넣습니다.100 및 70 미크론 체만 남았을 때, 마지막 두 개의 체에 의해 유지된 사구체 수확물을 얼음 위에 1% BSA가 보충된 10 밀리리터의 신선한 포유류 링거 용액이 있는 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 3ml의 사구체 현탁액을 2개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 사이에 분리하고 원심분리로 사구체를 펠릿화합니다. 상등액을 제거한 후 사구체를 액체 질소에 넣어 섭씨 80도에서 동결하여 나중에 단백질과 RNA를 추출할 수 있습니다.그런 다음 남은 사구체 용액을 섭씨 37도의 수조에 넣어 광학 현미경 스테이지의 사구체 투과성 리그에 주입합니다. 온전한 개별 사구체를 포획하면 마이크로피펫으로 Bowman's 캡슐과 관형 조각을 제거하고 기록을 시작하고 1%BSA가 보충된 신선한 링거 용액으로 사구체를 관류합니다. 30초 후, 퍼퓨세이트를 농축된 8%BSA 링거 용액으로 전환합니다.10초 동안 관류한 후 퍼퓨세이트를 다시 1%BSA 링거 용액으로 전환하고 기록을 중지합니다. 사구체 세포와 잔류 기질의 상세한 시각화를 위해 파라핀이 삽입된 고정된 신장 피질 샘플을 섭씨 37도에서 1시간 동안 건조시킨 다음 연속 자일렌 및 하강 에탄올 침지로 파라핀을 제거합니다. 샘플을 증류수에 5분 동안 재수화하고 흄 캐비닛의 주기적인 산성 용액에서 슬라이드를 배양합니다.5분 후, 증류수 100ml에 5분간 3회 세척하여 슬라이드를 헹군 다음 Schiff의 시약에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 흐르는 수돗물로 슬라이드를 5분 동안 세척하고 3초 동안 헤마톡실린으로 얼룩을 제거한 후 15분 동안 흐르는 수돗물로 철저히 헹굽니다. 그런 다음 상승 에탄올 침지와 2회 연속 3분 자일렌 침지로 슬라이드를 탈수합니다.공기 건조 후, 슬라이드는 400x 배율의 광학 현미경에서 사구체 구조를 평가하기 위해 크실렌 기반 장착 매체로 장착할 수 있습니다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF-A) 녹아웃 마우스는 야생형 깔짚 짝 대조군에 비해 10주까지 진행성 알부민뇨가 발생하는 반면, VEGF165b가 과도하게 발현된 녹아웃 동물은 이 상태로부터 보호됩니다. VEGF-A 녹아웃 마우스는 야생형 대조군에 비해 사구체 투수성이 크게 증가했으며, 이는 VEGF-A165b 과발현에 의해 부분적으로 구제됩니다.VEGF-A 녹아웃 마우스에서 신장 피질 절편의 주기적인 산 Schiff 염색은 광학 현미경 분석에 의해 사구체 구조적 이상을 나타내지 않습니다. 그러나 전자 현미경 분석에서 녹아웃 마우스는 사구체 기저막 폭 증가, 내피 페네스트라 수 감소, subpodocyte 공간 적용 범위 감소, 평균 podocyte 슬릿 폭 증가를 보여주었지만 평균 슬릿 수는 변하지 않았습니다. VEGF-A 녹아웃 동물에서 VEGF165b 과발현은 사구체 기저막과 슬릿 폭의 변화를 구제합니다.그러나 VEGF165b 과발현은 변경된 fenestrae 수 또는 subpodocyte 공간 범위에 영향을 미치지 않습니다. 체질된 사구체로부터 추출된 RNA는 VEGF165b 과발현 녹아웃 마우스에서 인간 VEGF165b mRNA 발현을 확인하며, 이는 동물의 노크에서 VEGF165b 과발현에 의해 구출된 VEGF-A 녹아웃 마우스에서 VEGFR2의 감소된 발현과 상관관계가 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 알부민과 물에 대한 사구체 투과성 평가를 포함하여 사구체 질환의 쥐 모델 평가를 위해 전체 신장 정밀 검사를 완료하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

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Medicine

의학

사구체 여과율 (GFR)의 측정은 신장 기능 평가를위한 황금 표준입니다. 여기서 우리는 두 단계 지수 붕괴 모델 플라즈마 GFR의 계산에 하나의 알약 주입, 형광 이소 티오 시아 네이트의 결정 (FITC) 이눌린을 사용하여 의식 쥐 GFR의 결정을 허용하는 높은 처리량 방법을 설명합니다.

의식 쥐의 사구체 여과율의 측정을위한 높은 처리량 방법

우리는 쥐를 받아야하는 중간 및 심한 허혈 - 재관류 신장 손상의 모델을 설명 일방적 신 경 각각 동시 또는 지연 반대측 신장 절제 뒤에 체결. 이러한 모델은 지속적으로 신장 기능 장애 및 사후 부상 섬유증을 야기하지만, 부상 정도와 생존율 마우스 배경, 나이, 수술 장비에 따라 달라집니다.

마우스의 급성 신장 손상 및 사후 상해 섬유증의 허혈 - 재관류 모델

여기에 설명된 신허혈증 재관류 손상의 마우스 모델은 급성 신장 손상을 초래하는 허혈증을 유도하기 위해 제어 조직을 제공하는 오른쪽 신장 절제술과 왼쪽 신장 척추를 고정하는 것으로 구성됩니다. 이 모델은 한 번의 절개를 통해 모든 단계를 수행하는 정중선 개복술 접근법을 사용합니다.

신장 허혈 재관류 상해 : 상해의 마우스 모델 및 재생

여기에서는 거부 반응의 면역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 수술 모델은 짧은 수술 시간과 간결한 기술을 보여주었습니다. 기증자-수용자 균주 조합에 따라 이식된 신장은 간질성 섬유증 및 세뇨관 위축으로 정의되는 급성 세포 거부 반응 또는 만성 동종이식 손상이 발생할 수 있습니다.

마우스 신장 이식 : 동종 이식 거부의 모델

사구체여과율(GFR) 측정은 전반적인 신장 기능을 평가하기 위한 황금 표준입니다. 그러나 이 매개변수를 측정하는 기존 절차는 번거롭고 많은 시간을 투자해야 합니다. 여기에서는 사구체여과(GFR)를 경피적으로 결정하기 위한 더 빠르고 최소 침습적인 방법에 대해 설명합니다.

의식 설치류에서 신장 기능의 경피 평가

여기 우리가 설명 의식에 사 여과 비율 (GFR)을 측정 하는 프로토콜 자유롭게 경 피 GFR 모니터를 사용 하 여 마우스를 이동.

쥐에서 사 여과 속도의 경 피 측정

이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

이 프로토콜은 쥐 총장골 동정맥루 생성의 수술 단계를 자세히 설명합니다. 우리는 혈액 투석 접근 관련 사지 병태생리학을 연구하기 위해 이 모델을 개발했습니다.

혈액 투석 접근 관련 손 기능 장애의 쥐 모델

이 연구는 CUBIC이 제거된 마우스 신장의 사구체를 표지하고 분석하기 위한 사용하기 쉽고 완전하며 간단한 방법 세트를 제시합니다. 사구체 수 및 부피와 같은 데이터는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란, 광시트 형광 현미경(LSFM) 또는 일반적인 컨포칼 현미경 및 Imaris와 같은 소프트웨어를 사용하여 쉽고 안정적으로 얻을 수 있습니다.

마우스 사구체를 표지하고 분석하기 위한 효율적이고 빠른 방법

본 글은 단측 신장 IRI를 이용한 허혈성 CKD 모델을 제시하고, 샘플 채취 하루 전에는 반대쪽 신장 절제술을 시행합니다; 이 프로토콜은 혈청 기반 기능 평가, 높은 생존율, 그리고 28일과 42일간의 CKD 병리 재현 가능성을 가능하게 하여, 기전 및 중재적 연구를 위한 다재다능한 플랫폼을 제공합니다.

신장 허혈/재관류 손상에 의해 유도된 급성 신장 질환에서 만성 신장 질환으로의 전환 마우스 모델

배우세요 콩팥 기능 및 구조적 표현형을 평가하는 포괄적인 콩팥 검사법을 마우스 사구체 질환 모델에 적용하는 방법을. 이 기법은 VEGF-A 녹아웃 마우스의 투과성 변화를 분석하여 신장 병리학의 기전 연구에 활용됩니다.

신장 기능 사 질병 마우스 모델에서의 평가

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