Name: 비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 배우세요 비브리오 콜레라 감염 주기를 연구하는 제브라피시 모델에서 세균 식민화 수준과 설사를 정량화하는 방법을. 이 기법은 장내 미생물군과의 상호작용 및 감염 역학을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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감사 합니다 멜로디 Neely, 존 앨런, 바젤 Abuaita, 그리고 zebrafish 모델을 개발 하는 데 그들의 노력에 대 한도 나 Runft. 여기에서 보고 된 연구는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 수상 번호 R21AI095520 및 R01AI127390 (제프리 H. Withey) 하에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 웨인 주립 대학에 의해 승인 되었습니다. 이 메서드는 Runft 외 에 처음 설명 했다 12
1입니다. 장 식민지 수준 결정
참고: 창 자 식민지는 zebrafish 모델에서 가장 유용한 통계 다양 한 V. cholerae 긴장의 상대적인 적합성 또는 돌연변이 또는 유전자 녹아웃의 효과 비교 하는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>침수로 zebrafish의 접종 참고:이 즉, 노출의 감염의 자연 과정을 유사합니다.<ol>
<li>V. cholerae의 준비
		<ol>
<li>격리 V. cholerae와 lysogeny 국물 (파운드)의 5 mL을 접종 한 파운드에서 식민지 접시 및 6-8 h (야간 문화)에 대 한 37 ° C (180 rpm)를 흔들어에서 품 어.</li>
			<li>위의 숙박 문화 50 µ L로 250 mL 원뿔 플라스 크에 신선한 압력가 파운드 매체의 25 mL 접종 16-18 h 37 ° C (150 rpm)를 떨고에 대 한 그것을 품 어.</li>
			<li>600에서 광학 밀도 읽고 mL 당 박테리아의 수를 추정 하는 야간 문화의 1/10 희석의 nm (OD600) (OD600 = 1 ~ 109 CFU/mL 이다.)</li>
			<li>피 펫과 미디어 10 분 제거에 대 한 6000 g에서 원심 분리 하 여 셀을 수확 하거나 살 균 제 솔루션으로 그것을 부 어. 1 x 1010 ml PBS의 1 x 107 사이 일반적으로 원하는 농도에 살 균 PBS에 셀 resuspend 참고: 여기, 우리가 압력가 역방향 삼 투 물 살 균 감염 물 60 mg/L 바다 소금 포함를 참조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
접종 및 배양
		<ol>
<li>살 균 감염 물 200 mL를 포함 하는 400 mL 비 커에 4 개 또는 5 개의 zebrafish를 놓습니다.</li>
			<li>감염 물 200 mL에 원하는 감염 농도 (일반적으로 5 x 104 5 x 107 CFU/mL)를 (에서 단계 1.1.1.4.) V. cholerae의 1 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>밖으로 점프에서 물고기를 방지 하기 위해 구멍이 뚫린된 뚜껑으로 비 커를 커버 200 µ L 팁 상자 상단의 이것을 위해 잘 작동합니다.</li>
			<li>각 비 커에 레이블을 고 그들 유리 전면 인큐베이터 28 ° C에 실험의 기간에 대 한 설정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
일시적인 노출에 대 한 절차 참고: inoculating 박테리아의 제거 다음 V. cholerae (일반적으로 6 h)에 일시적인 노출은 전송 공부 및 배설된 박테리아의 더 정확한 정량화에 대 한 유용 합니다.<ol>
<li>노출의 6 h 후 엄마 랑 물고기를 수집을 통해 비 커 물 밖으로 붓는 다. 표 백제는 V. cholerae죽 일 용기에 감염 된 물을 삭제 합니다.</li>
			<li>살 균 감염 물 200 mL의 비 커에 제거 된 물고기를 놓습니다. 물고기에서 표면 박테리아를 제거 하는 5 분이 깨끗 한 물에서 수영 하는 물고기를 허용 합니다.</li>
			<li>Net 절차 (1.2.2 단계)를 반복 하 고 200 살 균 감염 물의 새로운 비 커에 물고기를 놓습니다. 실험의 기간에 대 한이 비 커에서 물고기를 유지.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>안락사
	<ol>
<li>실험은의 원하는 끝점에 도달 하면 감염의 샘플에 물을 받아 (15 mL 보통 충분 한) 수 있도록 배설된 세균 수와 측정 (mucin 분석 결과, 단백질 콘텐츠, 마약 등), 설사의 경우 원하는 (2 절).</li>
		<li>엄마 랑 (물고기를 수집)를 통해 물의 나머지를 붓고 표 백제는 V. cholerae 물에서 죽 일.</li>
		<li>감염 물 플러스 에틸 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine)의 336 µ g/mL를 포함 하는 비 커에 생선을 놓고 실시간에 20 분이 tricaine 솔루션에 물고기를 품 어 참고:는 어망 10% 표 백제 솔루션으로 살 균 되었다.</li>
	</ol></li>
	<li>해 부
	<ol>
<li>물고기의 준비<ol>
<li>일회용 플라스틱 숟가락으로 tricaine 솔루션에서 물고기를 푸 고 해 표면에 놓습니다.</li>
			<li>위치와 그것의 복 부 측에 위쪽으로 직면 핀 물고기 핀의 무뚝뚝한 끝과 아래 턱을 통해 신체의 중심에서 각도입니다. 또 다른 핀 장소 그냥 시체에서 각도 또한 항문 후부.</li>
		</ol>
</li>
		<li>장로의 노출<ol>
<li>70% 에탄올에 보풀 지우기와 물고기의 복 부 표면 면봉.</li>
			<li>70% 에탄올에 담그고와 그들을 불타는 메스와 욕실이 위를 소독.</li>
			<li>비늘을 관통 하 고 메스를 사용 하 여 피부 바로 아래에 세로로 작은 절 개를 확인 합니다. 조심 하지 너무 깊게 잘라 창 자 피부 바로 아래 위치 하 고 있습니다.</li>
			<li>가 위를 사용 하 여 신중 하 게 몸, 피부 수준 보다 더 깊은 절단 및 항문 피하의 길이 따라 절 개를 확장 합니다.</li>
			<li>절 개 개방 수 있도록 생선의 머리 쪽으로 위 두 측면 컷을 확인 합니다.</li>
			<li>본문에서, 핀 낚시 해 표면에 측면 절 개의 각 측에 피부를 고정 합니다. 참고: 핀의 끝은 알코올로 그들을 불타는 의해 이전 멸 균.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
창 자 제거 참고: 창 자는 다른 기관 위에 창백 하 고, 매우 얇은 튜브로 표시 되어야 합니다.<ol>
<li>화 염 소독 된 집게 하 고 전체 장로 (일반적으로 길이 12-15mm)를 제거 하려면 그들을 사용 하 여. 유리 구슬 (단계 1.4.1–1.4.2 참조) 및 PBS 또는 얼음에 파운드 x 1의 1 mL를 포함 하는 균질 관으로 소장을 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>균질
	<ol>
<li>준비 균질 튜브 사전에 따르는 ~1.5 g 1 m m 유리 구슬의 2 mL에 스크류 캡 튜브 (채우려는 약 절반 방법) 하 고 압력가 마로 소독 하 여 그들을 소독.</li>
		<li>살 균 파운드 또는 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>일단 제 브라 내장 추가 (단계 1.3.3.1) 관에, 나사 모자에 매우 긴밀 하 게, 그리고 소용돌이 균질 화기에 튜브 고정.</li>
		<li>1 분 최대 설정에 대 한 샘플을 균질 다음 멋진 ice 1-2 분에 사이클을 반복이 균질 한 번 더 완전 한 균질에 대 한. 참고: 균질에 대 한 여러 가지 대체 방법을 작동 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>장 식민지 수준 측정
	<ol>
<li>각 튜브를 파운드 또는 1 x PBS의 900 µ L을 추가 하 여 (작은 유리 시험관 또는 1.5 mL microcentrifuge 튜브) 튜브는 homogenate의 직렬 희석에 대 한 준비. 각 물고기에 대 한 5-6 튜브를 준비 하 고 첫 번째 튜브에 homogenate의 100 µ L을 추가 하 여 장 homogenate의 10 연속 희석 하 게 vortexing 혼합, 및 다음 두 번째 튜브를 첫 번째 관에서 100 µ L을 추가.</li>
		<li>이 절차를 반복 하 여 모든 희석 준비 되었습니다.</li>
		<li>100-200 µ L 파운드 한 천 배지 100 µ g/mL 스 (스 내성 변종을 사용) 하는 경우의 및 X-걸 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)의 40 µ g/mL에 각 희석의 접시 16-18 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
		<li>하룻밤 배양 후 플레이트, 자동된 식민지 카운터를 사용 하거나 수동으로 식민지; 계산에 식민지 V. cholerae 계산 마커 팁 계산된 식민지를 표시 하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>생선 내장 당 CFU 도금 했다 볼륨을 고려, 현 탁 액의 희석 비율 접시 수를 곱하여 결정 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2입니다. 물고기 설사의 측정
참고: 4 개의 서로 다른 통계 물고기 설사를 평가 하기 위해 사용 되었다: 물, 물, 물13물, 그리고는 V. cholerae CFU의 OD600 에서 전반적인 배설된 단백질 수준에서 mucin 수준. 설사는 일반적으로 시각적으로 분명 하 게 된다 V. cholerae 위에서 설명한 대로 하는 제 브라의 노출 후에 대략 6 h.
<ol><li>
Mucin 수준을 결정합니다 참고: Mucin 분 비 V. cholerae 식민 동안 유도 하 고 배설 수준, 특히 초기 감염13의 좋은 측정 이다. Mucin 분석 결과 결정 정기 산 Schiff 분석 결과19에 변형입니다.<ol>
<li>다음 재료 준비: 50% (w/v) 정기 산 재고 솔루션 및 0.1% 주기 산 작업 솔루션 (7% 아세트산 5 mL에 추가 50% 정기 산 주식의 10 µ L-후 즉시 사용), mucin 표준, 96-잘 결정 접시, Schiff의 시 약입니다.<ol>
<li>나트륨 아세테이트 버퍼 (100 m m 나트륨 아세테이트, 5 m m EDTA, pH 5.5와 빙 초 산)에서 (돼지 위 유형 III)에서 mucin의 다음과 같은 금액을 일시 중단 하 여 준비 하는 mucin 표준: 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL, 및 10 µ g/mL. 감염의 100 µ L을 추가 하 여 다음과 같이 분석 결과에 사용 될 각 우물에 물 접시를 준비: 1 x PBS; 공백 위에서 설명한 대로 mucin 표준 또는 물고기 감염에서 물 샘플. 3 중에서 각 샘플을 할.</li>
		</ol>
</li>
		<li>각 잘 멀티 채널 피 펫을 몇 번 위아래로 pipetting으로 혼합 신선한 0.1% 주기 산 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>플라스틱 포장에 접시를 단단히 포장 하 고 그것을 1-1.5 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>각 잘, 그리고 그것을 혼합 하는 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 Fuchsin 솔루션 (Schiff의 시 약)의 5-10 분 추가 100 µ L에 대 한 실 온으로 접시를 쿨.</li>
		<li>플라스틱 포장에 접시를 포장 하 고 색상을 개발 했다;까지 락 플랫폼에서 실내 온도에 그것을 품 어 색상은 일반적으로 20 분 560에서 흡 광도 읽고 내 개발 nm 플레이트 리더를 사용 하 여.</li>
		<li>플롯 mucin 표준 곡선 (OD560대 µ g/mL mucin 표준). 각 알 수 없의는 OD560 표준 곡선에 내리는 식별 하 고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도 읽고 여 신원 미상의 mucin 레벨을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단백질 수준을 결정합니다 참고: mucin, 외 물에 전체 단백질 수준은 설사 (흐림, 액체의 자)는 물고기에 의해 생산의 수준에 대 한 다른 프록시입니다. 이 절차 표준 Bradford 분석 실험을 사용 하 여 단백질 수준 추정. 단백질 레벨은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 곡선에 따라 견적 된다.<ol>
<li>혼합 (아래 참고 참조) BSA 기준 중 하나의 100 µ L 또는 감염 물 (감염 된 물고기를 포함 하는 비이 커에서 물) 100 µ L 브래드포드의 900 µ L 일회용 cuvette에 (이것을 위해 잘 작동 하는 피어스 단백질 분석 실험 시 약) 분석 실험 시 약. 2 분 동안 실 온에서 모든 샘플을 품 어. 참고: 다음 BSA 기준 사용 되었다: 1, 800 µ g/mL, 1000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL, 및 25 µ g/mL. BSA 기준 압력가 증류수에 희석 됐다.</li>
		<li>각 표준의 OD660 읽거나는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플.</li>
		<li>플롯 표준 BSA 곡선 (OD660대 µ g/mL). 신원 미상 식별 하 여 각 알 수 없의는 OD660 표준 BSA 곡선에 고 읽고 해당 값에 대 한 해당 mucin 농도의 단백질 수준을 결정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
측정 세600 참고: 여러 h 및 간단한 세600 결정이 척도를 사용할 수 있습니다 후 설사 (흐림, 액체의 자)의 존재 가시 분명 하다.<ol>
<li>균일 하 게 배포 내용을 여러 번 감염 물에 들어 있는 튜브를 반전. 일회용 cuvette을 물 샘플의 1 mL를 추가 합니다. 살 균 감염 물 1 mL를 사용 하 여 부정적인 제어로.</li>
		<li>"빈" 측정 600에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 수행 nm 부정적인 컨트롤 샘플을 사용 하 여. 600 nm 및 기록에서 각 물 샘플을 읽고 결과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
감염 후 V. cholerae CFU/mL을 배설 참고: 설사는 zebrafish에 의해 생산의 주요 구성 요소는 배설 cholerae 대. CFU/mL의 결정 생선 창 자에 박테리아 복제 전송 실험에서 감염 복용량의 예측 같은 목적을 위해 사용할 수 있습니다. 이 측정은 최고의 자리를 차지 하는 일시적인 감염 때 이루어집니다. 24 h 감염을 사용 하는이 분석 결과 결합된 inoculum 플러스는 배설 V. cholerae측정할 것 이다.<ol>
<li>원하는 시간 지점에서 물 샘플을 받아 그리고 연속적으로 앞에서 설명한 대로 희석.</li>
		<li>선택적인 매체 (파운드 천 스 또는 다른 적절 한 항생제 또는 DCL 포함)에 직렬 희석 접시 하 고 24 시간 30 ° C에서 그들을 품 어.</li>
		<li>식민지를 계산 합니다. 1.5 단계에서 설명한 대로 물의 mL 당 CFU를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Zebrafish는 V. cholerae 공부에 대 한 상대적으로 새로운 모델 이지만 cholerae 대 생물학과 병 인11,,1213 의 이전에 알려지지 않은 측면의 미래의 발견에 대 한 많은 약속을 보유 하 고 . 성인 zebrafish 모델은 모두 자연의 장점이 그대로, 성숙한 장 microbiota 및 환경 모델 포함 V. cholerae 호스트. 모델의 두 가지 주요 인간 독성 요인, 콜레라 독 소 및 독 소 coregulated pilus, zebrafish 식민지 또는 병 인12필요 하지 않습니다 있습니다. 그러나,이 수 또는 볼 수 소설 V. cholerae 식민의 식별 수 있도록 또 다른 장점으로 요소와 다른 V. cholerae</e...

비 브리 오 cholerae 산발적 설사1,2뿐만 아니라 인간의 질병 콜레라 발생 한 수생, 그램 음성 박테리아 이다. V. cholerae 종종 다른 해양 유기 체와 관련 된 전 세계의 많은 지역에서 환경에서 발견 된다. 이러한 연결 생물 등 플랑크톤, 곤충 계란 질량, 조개, 척 추가 있는 물고기 종3,,45,6,7. 여러 연구 V. cholerae 다른 지역7,8,,910에 물고기의 창 자 책자에서 고립 있다. V. cholerae의 물고기에 나타냅니다 물고기 환경 저수지로 작동할 수 있습니다. 물고기는 인 간에 게 질병을 전송 및 V. cholerae 긴장6의 지리적 확산에 연루 또한 수 있습니다.
어떻게 V. cholerae 물고기 상호 작용 이해, Danio rerio로 더 잘 알려진 zebrafish, 콜레라 대e11공부를 위한 모델 시스템으로 개발 되었습니다. Zebrafish는 남부 아시아, V. cholerae의초기 저수지 생각 된다 벵골만 지역 포함. 1817 년에 첫 콜레라 유행 성 시작, 이전 콜레라 무엇입니까 지금 인도 그리고 방글라데시 밖에 보고 되지 했다. 따라서, zebrafish, V. cholerae 거의 확실히 연관 서로 진화 시간의 척도에 그 zebrafish는 자연 환경12 V. cholerae 호스트 제안.
V. cholerae를 위한 zebrafish 모델 간단 실행 하 고 병원 성 전체를 공부 하는 데 사용 수 라이프 사이클 cholerae 대 . 물고기는 V. cholerae의알려진된 번호와 주사 된 물에 입욕 하 여 V. cholerae에 노출 됩니다. 몇 시간 장 식민지, 일어난다 뒤에 설사의 생산. 설사는 mucin, 단백질, 배설된 박테리아 및 다른 장 내용으로 이루어져 있다. 몇 가지 간단한 측정13를 사용 하 여 설사의 정도 측정할 수 있습니다. V. cholerae 감염 된 물고기에 의해 배설 되는 갈 수 있습니다 다음 순진한 물고기를 감염 감염 주기를 완료. 따라서, zebrafish 모델 cholerae 대 인간의 질병 과정12,14이.
V. cholerae 가장 자주 사용 되는 동물 모델 생쥐와 토끼14,15,16,,1718역사적으로 있다. 이러한 모델 V. cholerae pathogenesis의 우리의 지식에 추가 하는 수단이 되었습니다. 그러나, 쥐와 토끼 자연 V. cholerae 되지 않습니다 때문에 호스트, V. cholerae 라이프 사이클의 어떤 측면 공부 될 수 있는 제한이 있다. V. cholerae 식민 쥐와 토끼의 일반적으로 항생제 장 microbiota 손상 전처리 나를 장 microbiota를 필요 합니다. 두 모델 모두 gavage 소화를 박테리아를 소개 또는 직접 창 자 박테리아를 주입 하는 수술 조작 필요 합니다. 성인 물고기는 그대로 장 microbiota 쉽게 식민지 화와 감염 과정 조작 필요 없이 자연스럽 게, 발생 Zebrafish 이점을.
현재 작업 V. cholerae 감염에서 모델로 zebrafish의 사용률을 보여 줍니다. 감염, 해 부, 식민지 V. cholerae, 열거 및 V. cholerae 기인한 설사의 정량화 기술된12,13될 것입니다. 이 모델 V. cholerae 질병 프로세스와 cholerae 대 환경 생활에 관심 있는 과학자에 게 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>계량 기계</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>버너</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자동 콜로니 카운터</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml 유리 비커</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>천공 뚜껑</td> 팁 상자 <td></td><td></td>일회용 플라스틱 숟가락<td>의 구멍이 있는 마이크로팁 홀더</td></tr><tr><td></td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>어항 시스템</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO 정수기</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>어망</td><td>마리나</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생선 식품</td><td>테트라 지느러미</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소금물 새우</td><td>레드 정글 브랜드</td><td>O.S.I. 프로 80</td><td></td></tr><tr><td>스티로폼 보드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>파인 사이언티픽 도구, 포스터 시티, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>파인 사이언티픽 도구, 포스터 시티, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>파인 사이언티픽 도구, 포스터 시티, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2ml 나사 캡 튜브</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1mm 유리 구슬</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>퍼짐용 유리 구슬</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>페트리 플레이트</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 원심분리기 튜브</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원심분리기 튜브</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>시험관</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫</td><td>Sartorius Biohit, G&ouml; ttingen, 독일</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>팁</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered Saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s 시약</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>주기적 산</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>돼지 위의 뮤신</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm 단백질 분석 시약</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS 한천</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS 한천</td><td>시그마, 세인트루이스, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 zebrafish 모델에서 측정

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

비 브리 오 cholerae 는 최고의 인간 질병 콜레라를 일으키는 전염 성 대리인 으로입니다. 인간 숙주 밖에 V. cholerae 주로 존재 수생 환경, 높은 수생 종의 다양 한 상호 작용 하는 곳에. 척 추가 있는 물고기 환경 호스트에 알려져 있습니다 그리고 자연에서 잠재적인 cholerae 대 저수지. V. cholerae와 모두 zebrafish로 일반적으로 알려진 teleost 물고기 종 Danio rerio, 인도 아 대륙에서 발생 한 수생 환경에 오랜 상호 작용을 제안. Zebrafish는 공부 하는 생물학, 전염 성 질환 등의 여러 측면에 대 한 이상적인 모델 유기 체. Zebrafish 수 있을 쉽고 빠르게 식민지 V. cholerae로 물에 노출 후. V. cholerae 여 장 식민지 설사의 생산 및 복제 cholerae V.배설 이끌어 낸다. 이러한 박테리아 수를 배설 후 새로운 물고기 호스트를 식민지로 이동. 여기, V. cholerae평가 하는 방법을 보여 줍니다-장 식민지 zebrafish에 V. cholerae계량 하는 방법-zebrafish 설사 유발. 식민 모델은 관심사의 유전자 또는 환경 생존을 위한 호스트 식민지에 대 한 중요 한 있을 수 있습니다 여부를 공부 하는 연구원에 게 유용 해야 한다. Zebrafish 설사의 정량화 zebrafish 모델 시스템으로 탐험에 관심이 어떤 장 병원 체를 공부 하는 연구자에 유용 해야 한다.

V. cholerae zebrafish 장 책자의 식민
우리가 관찰 하는 전형적인 식민 레벨의 예를 제공 하려면 우리 5 x 106 CFU 유행 성 엘 토르 V. cholerae 긴장의 N16961 여러 zebrafish를 포함 하는 비 커에 물 200 mL에 접종. 감염의 6 h 후 생선 신선한 물에 씻 겨 되었고 프로토콜에 설명 된 대로 압력가 감염 물 200 mL의 비 커에 전송. 18 h 전송 (또는 1 차 감염 후 24 시간) 후 물고기 안락사 했다, 그리고 그들의 창 자를 식민지 레벨을 결정 하기 위해 찍은. 약 10 생선 내장 당 셀 V. cholerae 106 5 5 x 106 inoculum 크기와 장로 24 h 후 감염 (hp...

Zebrafish는 자연 비 브리 오 cholerae 호스트 하 고 정리 하 고 전송 식민지 로부터 전체 감염 주기를 연구 하는 데 사용 수 있습니다. 여기, V. cholerae 식민 수준을 평가 하 고 계량 zebrafish에 설사 하는 방법을 보여 줍니다.

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

이 방법은 비브리오 콜레라가 어떻게 콰이어트 코스트(Quiet Coast)에 군집화하고 장내 미생물군(intestinal microbiota)과 경쟁하여 틈새를 형성하는지와 같은 비브리오 콜레라 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 물고기가 자연적으로 비브리오 콜레라의 숙주이기 때문에 완전한 비브리오 콜레라의 생활사를 연구할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Dhrubajyoti Nag와 제 연구실의 박사 과정 학생인 Paul Breen이 절차를 시연할 것입니다.V.cholerae 배양을 준비한 후 제브라피쉬에 침지하여 접종합니다. 먼저 400ml 비커에 400ml의 멸균 감염수 200ml에 4-5마리의 제브라피시를 넣습니다. 그런 다음 원하는 감염 농도를 위해 V.cholerae 배양 1ml를 추가합니다.그런 다음 구멍이 뚫린 뚜껑으로 비커를 덮습니다. 모든 비커를 준비한 후 섭씨 28도로 설정된 유리 전면 인큐베이터로 옮기십시오 일시적인 노출의 경우 약 6시간 후에 물고기 그물을 통해 비커 물을 부어 물고기를 모으십시오. 감염된 물은 박테리아를 죽이기 위해 표백제와 함께 처리해야 합니다.그런 다음 물고기를 200ml의 멸균 감염수에 5분 동안 넣습니다. 5분 후 이 물을 그물에 통과시켜 표백제에 물을 버립니다. 이제 물고기는 200ml의 멸균 감염수가 들어 있는 새로운 깨끗한 비커에 들어갈 수 있습니다.실험이 원하는 종점에 도달하면, 진단 목적으로 감염수 15ml의 샘플을 채취합니다. 그런 다음 물고기를 모아 감염된 물을 적절하게 처리하십시오. 복부 쪽을 위로 향하게 하고 아래턱을 통해 핀으로 몸을 고정하고 항문 바로 뒤에 다른 핀을 꽂습니다.두 핀을 몸체에서 멀어지게 합니다. 다음으로 70% 에탄올로 물고기의 복부 표면을 닦아냅니다. 그런 다음 메스와 바나스 가위를 70% 에탄올과 불꽃을 사용하여 살균합니다.이제 메스를 사용하여 비늘을 관통하는 배를 세로로 작게 절개하되 피부 깊숙이만 자릅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 절개 부위를 몸의 길이를 따라 조심스럽게 펴고 피부 높이보다 깊지 않게 자릅니다. 항문을 자르지 마십시오.그런 다음 개구부를 확장하기 위해 머리를 향해 두 개의 측면 절단을 만듭니다. 그런 다음 측면 절개 부위의 양쪽에 있는 피부를 절개 표면에 고정하고 핀을 몸에서 멀어지도록 비스듬히 빚습니다. 이제 장관이 매우 얇고 창백한 관으로 보일 것입니다.이제 두 쌍의 화염 살균 겸자를 사용하여 매우 취약할 수 있는 전체 장관을 조심스럽게 제거하십시오. 조직을 유리 구슬과 1ml의 콜드 버퍼가 들어 있는 호민화 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직을 균질화하고 장 집락화 수준을 정량화합니다.다음으로, 장 균질산염과 완충액을 연속적으로 희석합니다. 각 물고기에 대해 1 밀리리터 볼륨으로 5 개 또는 6 개의 10 배 희석을 준비하십시오. 혼합을 위해 튜브를 소용돌이치십시오.그런 다음 스트렙토마이신과 X-gal을 함유한 LB 한천 플레이트에 각 희석액 100-200마이크로리터를 플레이트합니다. 섭씨 30도에서 16-18시간 동안 플레이트를 배양합니다. 하룻밤 배양 후 플레이트에 있는 V.cholerae 군체를 세십시오.이 박테리아는 일반적으로 X-gal이 있는 LB 배지에서 옅은 파란색 군체를 생성합니다. 여러 콜로니 형태가 관찰되면 서로 다른 형태의 몇 개의 콜로니를 다른 TCBS 플레이트에 패치합니다. TCBS에서 V.cholerae는 불투명한 중심과 반투명한 주변부를 가진 크고 약간 평평한 노란색 군체를 생성합니다.물고기 설사에서 뮤신 수치를 측정하려면 96웰 플레이트에서 분석을 수행합니다. 블랭크를 포함하여 각 테스트 조건에 대해 100마이크로리터의 감염수를 세 번씩 우물에 로드합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 신선한 0.1 %주기적 산성 용액을 각 테스트 웰에 혼합합니다.피펫팅을 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 접시를 비닐로 단단히 싸서 섭씨 37도에서 1시간에서 1시간 30분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후 플레이트를 실온으로 식히십시오.각 웰에 100마이크로리터의 푹신 용액을 넣고 피펫팅과 혼합합니다. 이제 접시를 다시 싸서 실온의 로커에 올려 놓습니다. 약 20분 후에 플레이트 리더를 사용하여 560나노미터의 플레이트를 읽습니다.용액 내 뮤신으로 인한 반응을 정량화합니다. 물고기 설사에서 단백질 수치를 측정하려면 Bradford 분석을 사용하십시오. 일회용 큐벳에 BSA 표준 중 하나의 66마이크로리터 또는 66마이크로리터의 감염수 1, 000마이크로리터의 Bradford 분석 시약을 혼합합니다.이제 실온에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 분광 광도계에서 660나노미터의 흡광도를 읽습니다. 설사의 양에 대한 간단한 지표는 600나노미터에서 측정된 물의 탁도입니다.물을 잘 섞고 일회용 큐벳에 1ml를 넣고 측정하십시오. 기준선, 빈 측정의 경우 깨끗한 감염수를 사용하십시오. 배설된 V.cholerae 박테리아도 측정할 수 있습니다.이것은 접종 후 깨끗한 물로 옮겨진 물고기로 수행할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 탱크 물의 aliquat를 연속적으로 희석하십시오. 그런 다음 선택적 매체에 희석액을 플레이트화하고 섭씨 30도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.나중에 앞에서 설명한 대로 콜로니를 세고 CFU를 결정합니다. 200밀리리터의 물에 사육된 제브라피시 그룹에게 500만 CFU의 전염성 콜레라를 접종했습니다. 박테리아가 들끓는 물에서 6시간을 보낸 후 물고기는 18시간 동안 깨끗한 물로 이동합니다.그런 다음 공기 내장을 수확했습니다. 각 물고기는 약 100,000개에서 1,000,000개의 V.cholerae 세포를 보유하고 있었다. 감염수는 다른 분석에 사용되었습니다.감염 선량이 높을 때 뮤신 수치가 더 높았습니다. 물의 OD600은 물고기가 V.cholerae에 감염되었을 때 훨씬 더 높았습니다. 마지막으로, 감염된 물고기 물의 총 단백질 수치는 감염되지 않은 물고기의 물에서 관찰된 것보다 거의 두 배였습니다.이 비디오를 시청한 후에는 성인 제브라피시를 비브리오 콜레라에 감염시키고 감염으로 인한 설사를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 이전에 감염된 물고기에 의한 미접촉 물고기의 감염을 평가하기 위해 전염 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

출처: Nag, D. 외 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 항생제 내성 콜레라균에 감염된 성체 제브라피시의 장내 세균 부하를 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 안락사 및 해부 후에는 장을 분리하고 유리 구슬로 균질화한 후 박테리아를 방출하기 위해 처리됩니다. 결과된 균질체는 선택적 배지에 플레이트되고, β-갈락토시다아제를 발현하는 파란색 콜로니를 세어 박테리아 부하를 추정합니다.

비브리오 콜레라에 감염된 제브라피시의 장내 세균 부하 정량화

출처: 나그, D., et.al. 성체 제브라피시 모델에서 비브리오 콜레라의 정화 및 설사. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 장내 정착과 질병 결과를 연구하기 위해 병원성 비브리오 콜레라 균주를 접종하는 성체 제브라피시를 시연합니다. 이 연구는 박테리아 독소가 장의 완전성을 방해하여 액체 누출, 점액 분비, 물성 설사를 유발하는 과정을 보여줍니다.

성체 제브라피시에서 비브리오 콜레라에 의한 장 내 정착 및 설사 유도

출처: Flores, E. 외 제브라피시 유충의 식중성 감염 매개체로 원생동물 파라메시움 카우다툼을 이용하기. J. Vis. 경험 (2019년).이 영상은 형광성 대장균에 감염된 파라미시아를 먹여 제브라피시 유충에서 식중성 박테리아 장 감염 모델을 구축하는 방법을 시연합니다.

식중성 박테리아를 이용한 제브라피시 유충의 장 감염 모델링

이 비디오는 제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 곰팡이 포자는 유충 후뇌실에 미세 주입되고 유충은 감염이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 감염된 유충은 정의된 간격으로 수확되며, 군집 형성 단위를 열거하여 감염 진행 상황을 평가합니다.

제브라피시 유충의 곰팡이 감염을 정량화하는 기술

여기, 우리는 성인 zebrafish의 자연 병원 체 진 균 marinum를 사용 하 여에 프로토콜 모델 인간의 결핵을 제시. 추출 된 DNA와 RNA 감염 된 zebrafish의 내부 장기에서 총 mycobacterial를 물고기와 정량으로 호스트의 면역 반응에 로드 공개를 사용할 수 있습니다.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

생물 학적;와 intubating 성인 zebrafish를 프로토콜에 설명 합니다. 그리고 해 부 cytometry, confocal 현미경 검사 법 및 정량에 대 한 소장을 준비 합니다. 이 메서드는 관리를 장의 글귀와 로컬 면역 자극을 갖는 생리 활성 화합물의 수 있습니다. 그것은 구두 prophylactics의 장 역학 테스트 관련이 있습니다.

성인 Zebrafish의 구강 삽 관 법: 생리 활성 화합물의 장의 이해를 평가 하기 위한 모델

여기 우리 성인 zebrafish (Danio rerio) DNA 기반 백신의 예방 접종에 대 한 프로토콜 설명 및 성공적인 예방 접종 이벤트의 유효성 검사를 보여 줍니다. 이 메서드는 다양 한 감염 모델 백신 후보자의 전 임상 검사에 적합 합니다.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

Zebrafish (Danio rerio) 널리 사용 된 척추 동물 모델 미생물 식민과 병에 대 한 되 고 있다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레에 식품을 매개로 감염에 대 한 차량으로 Paramecium caudatum protozoan의 사용을 설명합니다. P. caudatum 쉽게 박테리아를 유입 하 고 애벌레 zebrafish 자연 먹이 행동에 의해 촬영 얻을.

Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.

클로스트리디오이드 디피실을 위한 애벌레 제브라피쉬 감염 모델 개발

이 프로토콜은 무균(GF) 어류 배아를 얻고 유충에서 유년기까지 유지하기 위한 주요 단계를 간략하게 설명하며, 여기에는 불임 상태 샘플링 및 감지가 포함됩니다. 감염과 함께 GF 모델을 사용하는 것은 숙주 건강에서 미생물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.

유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

배우세요 비브리오 콜레라 감염 주기를 연구하는 제브라피시 모델에서 세균 식민화 수준과 설사를 정량화하는 방법을. 이 기법은 장내 미생물군과의 상호작용 및 감염 역학을 이해하는 데 도움을 줍니다.

비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

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