비 브리 오 cholerae 식민과 설사 성인 Zebrafish 모델에서 측정

이 방법은 비브리오 콜레라가 어떻게 콰이어트 코스트(Quiet Coast)에 군집화하고 장내 미생물군(intestinal microbiota)과 경쟁하여 틈새를 형성하는지와 같은 비브리오 콜레라 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 물고기가 자연적으로 비브리오 콜레라의 숙주이기 때문에 완전한 비브리오 콜레라의 생활사를 연구할 수 있다는 것입니다. 제 연구실의 박사후 연구원인 Dhrubajyoti Nag와 제 연구실의 박사 과정 학생인 Paul Breen이 절차를 시연할 것입니다.

V.cholerae 배양을 준비한 후 제브라피쉬에 침지하여 접종합니다. 먼저 400ml 비커에 400ml의 멸균 감염수 200ml에 4-5마리의 제브라피시를 넣습니다. 그런 다음 원하는 감염 농도를 위해 V.cholerae 배양 1ml를 추가합니다.

그런 다음 구멍이 뚫린 뚜껑으로 비커를 덮습니다. 모든 비커를 준비한 후 섭씨 28도로 설정된 유리 전면 인큐베이터로 옮기십시오 일시적인 노출의 경우 약 6시간 후에 물고기 그물을 통해 비커 물을 부어 물고기를 모으십시오. 감염된 물은 박테리아를 죽이기 위해 표백제와 함께 처리해야 합니다.

그런 다음 물고기를 200ml의 멸균 감염수에 5분 동안 넣습니다. 5분 후 이 물을 그물에 통과시켜 표백제에 물을 버립니다. 이제 물고기는 200ml의 멸균 감염수가 들어 있는 새로운 깨끗한 비커에 들어갈 수 있습니다.

실험이 원하는 종점에 도달하면, 진단 목적으로 감염수 15ml의 샘플을 채취합니다. 그런 다음 물고기를 모아 감염된 물을 적절하게 처리하십시오. 복부 쪽을 위로 향하게 하고 아래턱을 통해 핀으로 몸을 고정하고 항문 바로 뒤에 다른 핀

두 핀을 몸체에서 멀어지게 합니다. 다음으로 70% 에탄올로 물고기의 복부 표면을 닦아냅니다. 그런 다음 메스와 바나스 가위를 70% 에탄올과 불꽃을 사용하여 살균합니다.

이제 메스를 사용하여 비늘을 관통하는 배를 세로로 작게 절개하되 피부 깊숙이만 자릅니다. 그런 다음 가위를 사용하여 절개 부위를 몸의 길이를 따라 조심스럽게 펴고 피부 높이보다 깊지 않게 자릅니다. 항문을 자르지 마십시오.

그런 다음 개구부를 확장하기 위해 머리를 향해 두 개의 측면 절단을 만듭니다. 그런 다음 측면 절개 부위의 양쪽에 있는 피부를 절개 표면에 고정하고 핀을 몸에서 멀어지도록 비스듬히 빚습니다. 이제 장관이 매우 얇고 창백한 관으로 보일 것입니다.

이제 두 쌍의 화염 살균 겸자를 사용하여 매우 취약할 수 있는 전체 장관을 조심스럽게 제거하십시오. 조직을 유리 구슬과 1ml의 콜드 버퍼가 들어 있는 호민화 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 조직을 균질화하고 장 집락화 수준을 정량화합니다.

다음으로, 장 균질산염과 완충액을 연속적으로 희석합니다. 각 물고기에 대해 1 밀리리터 볼륨으로 5 개 또는 6 개의 10 배 희석을 준비하십시오. 혼합을 위해 튜브를 소용돌이

그런 다음 스트렙토마이신과 X-gal을 함유한 LB 한천 플레이트에 각 희석액 100-200마이크로리터를 플레이트합니다. 섭씨 30도에서 16-18시간 동안 플레이트를 배양합니다. 하룻밤 배양 후 플레이트에 있는 V.cholerae 군체를 세십시오.

이 박테리아는 일반적으로 X-gal이 있는 LB 배지에서 옅은 파란색 군체를 생성합니다. 여러 콜로니 형태가 관찰되면 서로 다른 형태의 몇 개의 콜로니를 다른 TCBS 플레이트에 패치합니다. TCBS에서 V.cholerae는 불투명한 중심과 반투명한 주변부를 가진 크고 약간 평평한 노란색 군체를 생성합니다.

물고기 설사에서 뮤신 수치를 측정하려면 96웰 플레이트에서 분석을 수행합니다. 블랭크를 포함하여 각 테스트 조건에 대해 100마이크로리터의 감염수를 세 번씩 우물에 로드합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 신선한 0.1 %주기적 산성 용액을 각 테스트 웰에 혼합합니다.

피펫팅을 사용하여 혼합합니다. 그런 다음 접시를 비닐로 단단히 싸서 섭씨 37도에서 1시간에서 1시간 30분 동안 접시를 배양합니다. 배양 후 플레이트를 실온으로 식히십시오.

각 웰에 100마이크로리터의 푹신 용액을 넣고 피펫팅과 혼합합니다. 이제 접시를 다시 싸서 실온의 로커에 올려 놓습니다. 약 20분 후에 플레이트 리더를 사용하여 560나노미터의 플레이트를 읽습니다.

용액 내 뮤신으로 인한 반응을 정량화합니다. 물고기 설사에서 단백질 수치를 측정하려면 Bradford 분석을 사용하십시오. 일회용 큐벳에 BSA 표준 중 하나의 66마이크로리터 또는 66마이크로리터의 감염수 1, 000마이크로리터의 Bradford 분석 시약을 혼합합니다.

이제 실온에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 분광 광도계에서 660나노미터의 흡광도를 읽습니다. 설사의 양에 대한 간단한 지표는 600나노미터에서 측정된 물의 탁도입니다.

물을 잘 섞고 일회용 큐벳에 1ml를 넣고 측정하십시오. 기준선, 빈 측정의 경우 깨끗한 감염수를 사용하십시오. 배설된 V.cholerae 박테리아도 측정할 수 있습니다.

이것은 접종 후 깨끗한 물로 옮겨진 물고기로 수행할 수 있습니다. 앞서 설명한 대로 탱크 물의 aliquat를 연속적으로 희석하십시오. 그런 다음 선택적 매체에 희석액을 플레이트화하고 섭씨 30도에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.

나중에 앞에서 설명한 대로 콜로니를 세고 CFU를 결정합니다. 200밀리리터의 물에 사육된 제브라피시 그룹에게 500만 CFU의 전염성 콜레라를 접종했습니다. 박테리아가 들끓는 물에서 6시간을 보낸 후 물고기는 18시간 동안 깨끗한 물로 이동합니다.

그런 다음 공기 내장을 수확했습니다. 각 물고기는 약 100,000개에서 1,000,000개의 V.cholerae 세포를 보유하고 있었다. 감염수는 다른 분석에 사용되었습니다.

감염 선량이 높을 때 뮤신 수치가 더 높았습니다. 물의 OD600은 물고기가 V.cholerae에 감염되었을 때 훨씬 더 높았습니다. 마지막으로, 감염된 물고기 물의 총 단백질 수치는 감염되지 않은 물고기의 물에서 관찰된 것보다 거의 두 배였습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 성인 제브라피시를 비브리오 콜레라에 감염시키고 감염으로 인한 설사를 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 이전에 감염된 물고기에 의한 미접촉 물고기의 감염을 평가하기 위해 전염 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.