Name: Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 쥐 심장 연구를 위한 양측 조명 빛-시트 형광 현미경법을 광학 투명화와 함께 사용하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 후 구조 변화를 신속하게 관찰하여 심장 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 마우스 샘플 이미지를 제공 하기 위한 UCLA에서 타오 구 엔과 아츠 시 나카노에 게 감사를 표현 하 고 싶습니다. 이 연구는 NIH (Tzung K. Hsiai)에 HL118650, HL083015 (Tzung K. Hsiai)를, (N. C. 치 및 Tzung K. Hsiai)에 HD069305, HL111437 (Tzung K. Hsiai N. C. 치)를, (에 Tzung K. Hsiai), HL129727 및 텍사스 대학교 시스템 교부 받음 (지주에 자금에 의해 지원 되었다 리)입니다.

동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아에서 기관 검토 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 영상 시스템 설치
주: 그림 1 과 그림 2를 참조 하십시오.
<ol><li>3 파장 연속파 (CW) 레이저 검색: 405 nm, 473 nm와 532 nm. 장소 2 거울 (M1 및 M2) 150 mm 떨어져와 45 ° 광속에 그들의 거울 비행기와 그들을 맞춥니다. 참고:이 단계는 양면 조명 설치에서 레이저를 수행 됩니다. 결과 빔 초기 광속과 같은 방향에 있을 것입니다.</li>
	<li>0-광학 밀도 범위는 25 m m 직경 홍 채 격 막/핀 홀 (PH), 직경 50 mm 중립 밀도 필터 (NDF)을 통해 서 광선 통과 4.0, 빔 익 스팬 더 (BE)의 폭 30 mm 슬릿 (S) ~ 0-6 m m, 그리고 거울 (M3) 모두 서로에서 150 m m 위치. 45 ° 광속의 거울 평면 거울을 놓습니다.</li>
	<li>150 m m m 3에서 배치 하는 50: 50 빔 스플리터를 통해 광속을 전달 합니다. 거울 (M6) 빔 스플리터에서 150mm 놓고 그것의 대칭 면은 앞으로 방향에서 방출 되는 광속을 45 °에 정렬 합니다. 반사 광선을 사용 하 여 듀얼-조명 빛 시트의 1 개의 측을 형성.</li>
	<li>거울 (M4) 빔 스플리터에서 150mm 놓고 그것의 대칭 면은 45 ° 빔 스플리터에서 90 ° 각도로 방출 되는 광속에 정렬 합니다. 두 번째 미러 (M5) 150 m m m 4에서 배치 하 고 그것의 대칭 면은 M6에서 반영 광속에 45 °에 맞춥니다. M5에서 방출 하는 광속을 사용 하 여 듀얼-조명 빛 시트의 두 번째 측면을 형성.</li>
	<li>대칭 방식에서 양면 조명 시스템 설정 ( 그림 1참조). 한 원통형 렌즈 (CL1) 장소 [지름 (d) = 1; 초점 거리 (f) = 50mm] 한쪽과 다른 동일한 원통형 렌즈 (CL2) 듀얼-조명 setu의 반대편에 M6에서 방출 하는 빔 라인 150 m m M5에서 방출 하는 빔 라인 150 m m p. 90 ° 광선을 반영 하기 위해 50 m m의 거리에서 2 거울 (M7 및 M8) 각 원통형 렌즈 라인을 놓습니다.</li>
	<li>렌즈의 쌍에서 무색 남자 용 상의 형성 합니다. 첫 번째 렌즈, L1 배치 (d = 1; f = 100 m m), M7, 그리고 두 번째 렌즈, L2에서 100 m m (d = 1; f = 60 m m), l 1에서 160 m m. 이 동일한 렌즈 (L3, L4) 듀얼-조명의 반대편에 m 8에서 동일한 거리 배치를 반복 합니다.</li>
	<li>장소 거울, M9, M10, 60mm 렌즈 l 2와 L4, 각각, 그리고 빔 라인. 조명 목표, OL1 및 OL2 배치 (d = 2; f = 150 m m), M9, M10 및 빔 라인 150 m m. 목표에서 방출 하는 광선 빛 시트 샘플 이미지를 형성 한다.</li>
	<li>3 차원 프린터를 사용 하 여 샘플 홀더 아크릴로 니트 릴 부 타 디 엔 스 티 렌 (ABS)에서 인쇄. 커버 유리의 조각을 포함 [굴절률 (RI) = 1.4745] 챔버, 수직 굴절률 일치를 최소화 하기 위해 조명 광속의 각 측에. 균등 하 게 대물 렌즈에서 방출 된 광선 사이 챔버 장소.</li>
	<li>설치는 스테레오 현미경 확대 객관적이 고 과학적인 보완 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라 조명에 수직인 X 1 비행기 ( 그림 2참조).</li>
</ol>2. 이미징 시스템 교정
<ol><li>형광 성 폴리스 티 렌 구슬 0.53 μ m 직경에 있는 검색 합니다.</li>
	<li>1:150, 000에 1% 낮은 용융 포인팅 agarose와 굴절률 매칭 솔루션 (테두리)에 구슬 솔루션을 diluting 하 여 형광 구슬 샘플을 준비 합니다. 30 m m의 길이에 내경 12 m m와 18 mm의 외부 직경 붕 규 산 유리 배관의 조각을 잘라. 참고: 붕 규 산 유리 배관 굴절률 (1.47)에 맞게 사용 됩니다.</li>
	<li>1 %agarose 희석된 비드 샘플 혼합 하 고 구슬/agarose 솔루션 붕 튜브에 플라스틱. 실 온 (23 ° C)에서 공고히 agarose를 허용 합니다.</li>
	<li>99.5% 글리세롤 솔루션 (1.7 단계)에서 ABS 챔버를 채우십시오. 챔버 내부에 구슬 포함 하는 붕 규 산 유리 튜브를 놓습니다. 이중 조명 시스템에 의해 만들어진 가우스 광속의 센터에 되도록 이미징 시스템에 ABS 챔버를 놓습니다.</li>
	<li>3 차원 동력된 변환 단계 운동 및 ABS 챔버 내 샘플의 방향을 제어 하 붕 규 산 유리 튜브를 연결 ( 추가 그림 1참조).</li>
	<li>(Fps) 초당 30 프레임의 속도로 sCMOS 카메라를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 모터 컨트롤러를 사용 하 여 샘플 1 m m 옆 방향으로 이동 하 고 sCMOS 카메라를 사용 하 여 각 1 m m 증가에서 이미지. 전체 샘플 이미지가 포함 된 때까지 계속 합니다.</li>
	<li>시각화 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 스택 ( 재료의 표참조). 이 구슬 이미지를 사용 하 여 시스템의 확산 기능 (PSF)를 측정 합니다. 이 PSF deconvolution 이미지 나중 단계에서 처리 하는 동안 사용 합니다.</li>
</ol>3. 샘플 준비
<ol><li>마음 야생 유형 P1 마우스와 Rosa26 YFP 유전자 이중 heterozygous sarcolipin-Cre knockin 마우스 해 부 (SlnCre / +; R26YFP 기자 / +) P7에. 참고: 안락사 pentobarbital로 빈스 외. 에 의해 설명 하는 기법을 사용 하 여 수행 10. 해 부 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (NHLBI)10,11에서 설명 하는 기술에 따라 수행 되었다.</li>
	<li>케빈 성 외 에 설명 된 대로 murine 마음의 청소 화학 수행 12. 참고: 다음 단계 이후 사용 되 고 화학 물질 독성 증기 두건에서 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 3 x 1에 마음 씻어 10 분 x. Rinsing 후, 4 %paraformaldehyde 솔루션에 마음을 놓고 하룻밤 4 ° C에서이 샘플을 품 어.</li>
		<li>0.5 %w / v 2, 2'-Azobis dihydrochloride의를 포함 하는 4% 아크릴 솔루션에는 샘플을 놓습니다. 샘플 하룻밤 4 ° C에서 알을 품을 수 있습니다. 밤새 부 화 후 샘플을 제거 하 고 2-3 h 37 ° C에서 그들을 품 어.</li>
		<li>PBS와 샘플을 헹 구 고 8 %w / v 나트륨 라우릴 황산 염 및 1.25 %w / v 붕 소의 산 성 솔루션에 그들을 배치. 그들은 분명 때까지 37 ° C에서 샘플을 품 어. 이 샘플의 두께 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 개간, 후 샘플을 제거 하 고 1 일 인산 염 버퍼 염 분 x 1에 배치 합니다.</li>
		<li>일치 하는 비 밀도 그라데이션 중간의 40 g 솔루션 굴절률 준비 ( 재료의 표참조) 0.02 M 인산 버퍼 (PB), 0.1% 트윈-20, 그리고 0.01% 나트륨 아 지 드의 30 ml에서. 수산화 나트륨으로 7.5의 pH에 솔루션을가지고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.46 1.48 및 1 %agarose 굴절률을 가진 바퀴에 지운된 샘플을 놓습니다. 붕 규 산 유리 배관으로 샘플을 삽입 하 고 실 온 (23 ° C)에서 공고히 agarose를 허용.</li>
	<li>움직임을 제어 하는 붕 규 산 유리 튜브를 3 차원 동력된 변환 단계를 연결 하 고 3 차원 내에서 샘플의 방향 인쇄 ABS 챔버 ( 보충 그림 1참조).</li>
</ol>4. 성인 심장 이미징
<ol><li>2 개월 야생 타입 (C57BL/6) 마우스의 꼬리 정 맥으로 심장 관련 분 T 발기인 (cTnT) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 포함 하는 1012 의 바이러스 유형 adeno 관련 바이러스 벡터 9 (AAV9) x 8.7 100 μ 볼륨에 주사. 참고:는 AAV9 위안 외 에 의해 설명 하는 기술에 따라 개발 되었다 13. 그러면 신장 외부 골 수 칼륨 채널 (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP 생산에 바인딩할 GFP ( 재료의 표참조).</li>
	<li>NHLBI11에서 설명 하는 기술에 따라 7.5 개월에서 성인 쥐 심 혼을 해 부. 단계 3.1-3.3을 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.</li>
	<li>모터 액추에이터를 모터 컨트롤러를 연결 합니다. 움직임을 제어 하는 붕 규 산 유리 튜브에 액추에이터를 연결 하 고 3 차원 내에서 샘플의 방향 인쇄 ABS 챔버.</li>
	<li>그것은 이중 조명 시스템에 의해 만들어진 가우스 광속의 센터에 되도록 샘플을 놓습니다. 100 fps의 속도로 sCMOS 카메라를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
	<li>모터 컨트롤러를 사용 하 여 샘플 1 m m 축 방향에서 이동한 sCMOS 카메라와 함께 각 1 m m 증가에서 이미지를 수집 합니다. 전체 샘플 이미지가 포함 된 때까지 계속 합니다. 참고: 시스템 사용자 정의 개발 장비 제어 소프트웨어에 의해 제어 됩니다.</li>
	<li>시각화 소프트웨어를 사용 하 여 인수 이미지 스택 ( 재료의 표참조). 이러한 이미지 스택 및 시각화 소프트웨어14를 사용 하 여 3 차원 이미지를 개발 합니다. 획득된 한 이미지 스택에 단계 2.6에서에서 PSF deconvolve 심장의 윤곽을 관찰 하 고 의사 색이 회색조 강도에 따라 이미지를 추가 하려면 픽셀 임계값 강도 값을 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
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<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

LSFM 시스템 및 여기에 설명 된 기술 개발의 출생 및 성인 단계에서 이미지 마우스 마음에 광 청소와 함께 양면 조명 광속을 이용 한다. 전통적인 단일 조명 광선은 광자 산란 및 흡수 두꺼운 및 더 큰 조직 샘플1,3에서 겪고 있다. 양면 보 샘플, 스트라이핑 및 종종 한 면 조명에 의해 생산 하는 이미지에 표시 되는 다른 아티팩트 효과 최소화의 더 심지어 조명을 제공 합니다. 이 기술은 또한 듀얼 가우스 빔8의 위치를 조정 하 여 몇 군데 수 샘플의 크기를 증가 시킵니다. 단일 조명 제 브라와 초파리 의 마음 같은 작은 마음에 샘플의 크기를 제한 하는 반면이 광선의 최대 분리 조직 샘플 성인 마우스 마음 처럼 크기가 몇 밀리미터 이미징에 대 한 허용 .
형광 이미징 광학 투명 하지 않은 조직에 더 도전 산란 조직 ...

빛-시트 형광 현미경 검사 법 1903 년에 처음 개발 하는 기술 이었고, 유전자 발현을 연구 하 고 조직 샘플1,2,3또는 4 차원 3 차원 모델을 생성 하는 방법으로 오늘 사용 된다. 이 이미징 방법만 그 비행기는 검출기에 의해 캡처 있도록 샘플의 단일 면을 밝히는 빛의 얇은 시트를 사용 합니다. 샘플 다음 이동할 수 있습니다 축 방향으로 각각 캡처 레이어, 한 번에 하나의 섹션 및 인수 이미지4의 후 처리 후 3 차원 모델을 렌더링. 그러나, 흡수 및 산란 광자의 LSFM 되었습니다 샘플 중 몇 미크론 두께 또는 광학 투명1을 제한.
LSFM의 한계는 제 브라 같은 광학 투명 한 조직 있는 생물의 광범위 한 연구를이 끌고있다. 심장 개발 및 차별화는 종종 연구 zebrafish에 있기 때문에 인간과 zebrafish5,6보존된 유전자. 이러한 연구는 cardiomyopathies6,7에 관련 된 심장 연구에 발전을 이끈, 비록 여전히 포유류와 같은 수준의 유기 체에 유사한 연구 수행 필요가 하다.
포유류 심장 조직의 두께와 불투명도 조직, 전통적인 LSFM 방법1 아래 샘플의 단면 조명으로 인해 발생 하는 스트라이핑에 붉은 혈액 세포, 헤모글로빈 때문 흡수의 과제를 안으십시오 , 8. 이러한 제한에 대 한 보상, 우리 양면 조명과 선명도 기법9 일치 하는 솔루션 (RIMS) 굴절 인덱스와 결합의 단순화 된 버전을 사용 하 여 제안. 따라서,이 시스템은8비행기 축과 측면에서 좋은 품질의 해상도 유지 하면서 10 m m3 x 10 x 10 보다 크면 시료의 이미징에 대 한 수 있습니다.
이 시스템은 먼저 유리 튜브 내에서 다른 구성에서 배열 하는 형광 구슬을 사용 하 여 보정 됩니다. 그런 다음, 시스템 출생 및 성인 murine 마음을 이미지를 사용 되었다. 첫째, 출생 후 마우스 마음은 7 일 (P7) 심 실 구멍, 심 실 벽, 밸브 구조 및 trabeculation의 존재의 두께 공개에 몇 군데. 둘째, 연구 cardiomyocytes Cre 표시와 노란 형광 성 단백질 (YFP) 1 일 (P1)에서 출생 마우스 마음을 사용 하 여 cardiomyocytes에 분화 것 셀을 식별 하기 위해 실시 됐다. 마지막으로, 7.5 개월에서 성인 쥐 유전자 치료8후 신장 외부 골 수 칼륨의 존재 (ROMK) 채널을 관찰 하는 몇 군데 했다.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>형광단의 여기</td></tr><tr><td>중성 밀도 필터</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>시스템에 들어가는 빛의 양 제어</td></tr><tr><td>무채색 빔 확장기</td><td>Thorlabs</td><td>GBE05-A</td><td>광선 확장</td></tr><tr><td>기계식 슬릿</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>빔</td></tr> <tr>폭 제어<td>빔 스플리터</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>형태 이중 조명 빔</td></tr><tr><td>1X 대물 렌즈가 있는 실체 현미경</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>샘플 관찰에 사용</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 LT sCMOS 카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>이미지 캡처에 사용</td></tr><tr><td>아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(ABS),</td> <td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>, 샘플 홀더를 3D 프린팅하는 데 사용되는 재료</td></tr><tr><td>형광 폴리스티렌 비드</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>이미징 시스템 보정에 사용</td></tr><tr><td>붕규산 유리 튜브</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>샘플 임베딩용 튜빙</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>샘플 챔버 채우기</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>마우스 심장용 헹굼 용액</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>RT-15700</td><td>첫 번째 배양 용액</td></tr><tr><td>아크릴아미드</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>마우스 심장용 두 번째 배양 용액을 위해 2,2'-Azobis dihydrochloride와 혼합</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis dihydrochloride</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>마우스 심장</td></tr><tr><td>용 두 번째 배양 용액을 위해 아크릴아미드와 혼합소듐 도데실 설페이트&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>마우스 심장용 3차 배양 용액을 위해 붕</td></tr>산과 혼합 <tr><td>Boric acid</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>마우스 심장용 3차 배양 용액을 위해 도데실황산나트륨과 혼합</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>굴절률 정합 용액으로 PB, Tween-20 및 아지드화나트륨과 혼합</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>굴절률 정합 용액으로 Sigma D2158, PB 및 Sodium azide와 혼합</td></tr><tr>Sodium<td>azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>굴절률 정합 용액으로 Sigma D2158, PB 및 Tween-20과 혼합</td></tr><tr>GFP <td>Vector Biolabs</td><td>VB2045</td><td>로 태그된 심장 특이적 트로포닌 T 프로모터가 있는 Adeno-associated virus vector 9</td> ROMK DC 서보 모터 액추에이터 Thorlabs<td>에 결합 시 GFP를 발현</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Z825B</td><td>라이트 시트 내에서 축 방향으로 샘플의 이동에 사용</td></tr><tr><td>K-Cube 브러시 DC 서보 모터 컨트롤러</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>모터 액추에이터에 연결하여 액추에이터의 움직임을 제어</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI 소프트웨어</td><td>N/A</td><td>2D 및 3D 이미지 생성을 위한 시각화 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

빛 시트 형광 현미경 검사 법은 축 고해상도 마이크로미터에서 밀리미터 규모와 빠른 이미지 수집을 위해 널리 사용 되었습니다. 전통적인 빛 시트 기술 샘플 조직에서 기가 감독 단일 조명 광속의 사용을 포함 한다. 단일 조명 광선을 사용 하 여 생성 되는 큰 샘플의 이미지 줄무늬 또는 아티팩트를 포함 하 고는 조직에 의해 빛의 흡수와 산란 감소 해상도에서 고통. 이 연구 양면 조명 광속 및 단순화 된 선명도 광학 기술 murine 마음에 대 한 삭제를 사용 합니다. 이러한 기술은 마음에서 지질을 제거 하 여 깊은 이미징에 대 한 허용 하 고 영상, 10 x 10 x 10 m m3보다 더 큰 분야를 생산. 결과적으로,이 전략을 수 있습니다 계량 실의 크기, 심장 계보를 추적 하 고 심장 특정 단백질 및 충분 한 대비와 성인 쥐 심 혼에는 출생에서 이온 채널의 공간 분포를 지역화 하 고 해상도입니다.

설명 하는 기술은 여기 깊은 이미징 깊이 및 충분 한 이미지 해상도 (그림 1) 더 큰 이미징 볼륨 마우스 심장 조직 샘플의 광학 청소와 함께 양면 조명 광선을 사용. 시스템 보정, 형광 구슬 유리 튜브 내부와 이미징 시스템 내에서 배치 했다. 구슬에 몇 군데 했다 그리고 x y 평면, y z 평면, 시각 그리고 포인트를 x-z 평면에서 시스템8기능 (PSF)를 확산. 시스템 보정 d측면 ≈의 측면 방향에서 해결 생산 2.8 µ m 및 dXZ ≈ 17.4 µ m 및 dYZ ≈ 17.9 µ m 포함 중간8로 글리세롤을 사용 하는 경우의 축 방향에서 해결.
형광 구슬 캘리...

이 연구 murine 마음 공부 광 청소와 함께 양면 조명 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 기법을 사용 합니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

이 기술의 주요 장점은 마우스 심장 중 하나의 빠른 이미징을 허용한다는 것입니다. 그리고 유전자 치료 후 공기 채널의 존재를 관찰하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 발달 심장학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만 신경학 및 폐학과 같은 다른 시스템에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로, 개별은 성인 마우스 심혼의 화상 진찰을 장착하는 것은 어려울 수 있고, 공초점 및 반전된 현미경 검사법과 같은 그밖, 전통적인 기술에서 다르기 때문에 이 기술로 투쟁할 것입니다. 405 나노미터, 473 나노미터 및 532 나노미터의 3 개의 파장을 가진 연속 파레이저를 배치합니다. 그런 다음 미러를 부착하고 45도에서 거울 평면과 빔에 정렬합니다.이렇게 하면 레이저가 빔 스플리터쪽으로 향하게 되며, 이는 양면 조명 설정을 형성합니다. 다음으로, 50mm 직경의 중성 밀도 필터, 빔 익스팬더 및 25mm 직경핀 구멍을 통해 빔을 전달하며, 모두 서로 150mm 떨어진 곳에 배치됩니다. 핀홀에서 150밀리미터 떨어진 50-50 빔 스플리터를 통과합니다.다음으로 빔 스플리터에서 150mm 떨어진 미러 2개를 90도에서 전방 빔으로 배치하고 미러 평면이 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 그런 다음 미러 2에서 미러 3 개를 100밀리미터 3개 배치하고 미러 평면이 미러 2에서 반사되는 빔에 45도 각도로 되도록 정렬합니다. 이 반사 빔을 사용하여 이중 조명 라이트 시트의 한쪽을 형성합니다.빔 스플리터의 맨 쪽에 미러 5를 배치하여 미러 평면이 전방 방향으로 방출되는 빔에 45도 떨어져 있습니다. 미러 5에서 방출되는 빔을 사용하여 이중 조명 광시트의 두 번째 면을 형성합니다. 다음으로, 체계적인 방식으로 이중 측 조명 시스템을 설정합니다.원통형 렌즈2대150밀리미터 에서 미러 3, 또 다른 동일한 원통형 렌즈를 거울 5에서 150밀리미터 떨어진 곳에 두면 이중 조명 설정의 반대편에 놓습니다. 다음으로, 각각 원통형 렌즈에 맞춰 각각 2개의 거울을 50mm 의 거리에 배치하여 빔을 90도반사합니다. 라이트 시트의 양쪽에, 렌즈 의 쌍에서 achromatic 더블을 형성, 첫 번째 렌즈는 이전 거울에서 100 밀리미터 배치되고, 1 인치 직경과 100 밀리미터의 초점 길이를 갖는.두 번째 렌즈는 렌즈 1개에서 160mm, 직경은 1인치, 초점 거리는 60mm로 배치되어야 합니다. 그런 다음, 조명 목표를 이전 achromatic doublets에서 150밀리미터, 그래서 빔과 일치되도록 배치합니다. 목표에서 방출되는 빔은 샘플을 이미징하기 위한 광시트를 형성합니다.먼저, 0.53 마이크로미터 비드 용액을 1~150, 000으로 미리 데워진 굴절률 매칭 솔루션에 희석하여 형광 비드 샘플을 준비하고, 1% 낮은 용융을 가리키는 아가로즈를 사용한다. 다음으로, 12밀리미터의 내지름과 외경 18mm의 보로실리케이트 유리 튜브를 길이 30mm로 사용합니다. 보로실리케이트 튜브의 비드 아가로즈 용액파이펫을 피펫하여 실온에서 아가로즈가 고화되도록 합니다.지금, 99.5 % gylcerol 솔루션으로 3 D 인쇄 ABS 챔버를 채우기. 구슬이 들어 있는 보로실리케이트 유리 튜브를 챔버 내부에 놓습니다. ABS 챔버 내의 시료의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 borosilicate 유리 튜브에 부착합니다.그런 다음 사용자 지정 설계 소프트웨어를 사용하여 초당 30 프레임의 속도로 sCMOS 카메라를 사용하여 이미지를 수집합니다. 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 측면 방향으로 1밀리미터 이동하고 전체 샘플이 이미지화될 때까지 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택하고 이러한 비드 이미지를 사용하여 시스템의 포인트 확산 기능을 측정합니다.7.5의 pH와 굴절 인덱스 일치 솔루션을 사용하고 1%의 아가로즈를 일치 솔루션에 용해합니다. 클리어된 성인 마우스 심장 샘플을 굴절지수 매칭 솔루션에 넣고 1%의 아가로즈가 용해됩니다. 그런 다음, 샘플을 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입하고, 아가로즈가 실온에서 고화되도록 한다.3D 프린팅 ABS 챔버 내에서 샘플의 움직임과 방향을 제어하기 위해 3D 전동 번역 단계를 보로실리케이트 유리 튜브에 부착합니다. 이중 조명 시스템에 의해 생성된 가우시안 빔의 중심에 있도록 샘플을 배치합니다. 그런 다음 sCMOS 카메라의 획득 속도를 초당 30프레임으로 설정합니다.이제 모터 컨트롤러를 사용하여 샘플을 축 방향으로 1밀리미터 이동하고 각 1밀리미터 단위로 이미지를 수집합니다. 전체 샘플이 이미지화될 때까지 계속합니다. 시각화 소프트웨어를 사용하여 획득한 이미지를 스택합니다.이러한 이미지 스택을 사용하여 3D 이미지를 개발합니다. 이를 위해 이전에 결정된 포인트 스프레드 함수를 데온볼브하고 획득한 이미지 스택에 활용합니다. 마지막으로 픽셀 임계값 을 설정하여 심장의 윤곽을 관찰하고 이 회색 배율 강도를 기반으로 이미지에 의사 색상을 추가합니다.어느 날 산후, 하나는 밸브, 아트리움, 심실, 페티나테 근육 및 궤적을 시각화 할 수 있습니다. 산후 7일째에 그 특징은 더욱 정의됩니다. 심실, 심실 구멍 치수 및 심실 벽 두께는 모두 분명합니다.심장 내의 심근세포 분화를 연구하기 위해 이종구스 노크인 마우스는 심근세포를 보여주기 위해 크레라벨을 부착했습니다. 표지된 셀은 각 평면 방향으로 여기에 표시됩니다. 세 개의 평면이 병합되어 심장의 3D 렌더링을 만들었습니다.인셋 내의 빨간색 원영역은 선명도 기술을 받고 보로실리케이트 유리 튜브에 삽입된 후 두 개의 반투명 마우스 하트를 보여줍니다. 산후 마우스를 공부하는 것 외에도, 이미징 시스템은 성인 마우스 심장을 연구하는 데사용할 수도 있습니다. 여기서, GFP 태그 ROMK 채널은 7.5 개월에 표시됩니다.이들은 주로 심실 벽에서 찾아냈습니다. 이 기술을 마스터하면 1~2분 후에 이 기술을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 튜브의 샘플 주위의 모든 거품을 제거하는 것이 중요합니다.이미지 스택의 자동 세분화와 같은 다른 방법은 심혈관 손상 및 재생과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 발달 후에, 이 기술은 마우스에 있는 산후 및 성인 발달 단계에 있는 심장 건축을 공부하기 위하여 연구원에 의해 이용되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

중심부에 위치한 분자 이벤트는 기관의 전기 및 수축 기능을 조정. 여기에 제시된 지역 필드 형광 현미경 기술의 집합은 그대로 마음에 휴대 변수의 기록을 할 수 있습니다. 심장 기능을 정의하는 메커니즘을 확인하면 마음이 병적 인 상황에서 어떻게 작동하는지 이해에 중요하다.

지역 필드 형광 현미경 : 본래 마음의 세포 신호 이미징

여기, 우리는 CD11c.DTR 마우스의 기관 내 디프테리아 독소 치료에 의해 유도되는 무균 성 심근염의 쥐 모델에서 심장 CD45 + 백혈구 침윤을 시각화하기위한 가벼운 시트 현미경 접근법을 설명한다.

Light Sheet Microscopy에 의한 심근 성 심근염의 Murine 모델에서의 백혈구 침윤의 정량적 시각화

여기, 선물이 시각화 4 차원 (4d)에서 zebrafish에 마음을 개발 하는 프로토콜. 빛-시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM)를 통해 4 차원 영상, 3 차원 (3 차원) 이미지 개발 마음을 재구성 하는 시간 걸립니다. 우리 그 전단 응력 활성화 endocardial 노치 신호 챔버 개발, 심장 trabeculation를 승진 시키는 동안 질적 및 양적 보여줍니다.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

우리는 빛 시트 형광 현미경 검사법과 생체 내 제브라피시 심장을 연구하는 최적화 된 도구를 설명합니다. 특히, 우리는 밝은 심장 형질 전환선을 제안하고 발달과 심장 결함을 피하는 새로운 부드러운 임베드 및 고정 기술을 제시합니다. 심장 이미징에 적응된 가능한 데이터 수집 및 분석 파이프라인도 제공됩니다.

얼룩말 물고기 배아에서 빠른 심장 역학의 빛 시트 현미경 검사

우리는 조직 변형 및 염색의 새로운 발전과 축 방향 스캔 라이트 시트 현미경의 개발을 결합하여 전체 마우스 심장의 메조스코픽 재구성 방법을 보고합니다.

전체 마우스 심장의 메조스코픽 광학 이미징

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

설치류 심장의 심장 구조를 밝히기 위한 Light-Sheet Imaging

재관류 급성 심근경색증(repAMI)에서 심장 손상의 3차원(3D) 재구성은 관련 질병에 영향을 미치는 패턴의 충실한 정량화 및 공동 국소화를 가능하게 합니다. 여기에서는 심장 손상, 위험 영역 및 면역 세포 반응의 동시 측정을 위해 자동화 가능한 라이트 시트 유도 이미징 접근 방식이 제공됩니다.

라이트 시트 형광 현미경을 이용한 재관류 급성 심근경색증의 심장 손상 및 면역 반응의 동시 3D 분석

생리학 및 병리 학적 압력 조건에 심장 밸브 조직을 쓰는 수있는 순환 압력 생물 반응기는 설계되었습니다. LabVIEW 프로그램은 사용자가 압력 크기, 진폭 및 주파수를 제어할 수 있습니다. 이 장치는 심장 밸브 조직이나 격리 세포의 mechanobiology을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

개인 모델링에 대한 환자의 심장 구조의 생체 영상에서 심실 섬유 방향을 예측할 수 방법론이 설명되어 있습니다. 방법의 유효성을 검사는 정상 사용하고 견 (犬) 마음이 입증 실패 수행 한 임상 관찰 수준의 예상과 인수 섬유 방향 사이에 큰 차이가 없다는 겁니다.

심장의 환자 별 모델링 : 심실 섬유 오리엔테이션의 추정

배우세요 쥐 심장 연구를 위한 양측 조명 빛-시트 형광 현미경법을 광학 투명화와 함께 사용하는 방법을. 이 기술은 유전자 치료 후 구조 변화를 신속하게 관찰하여 심장 발달 생물학 연구에 활용됩니다.

Murine 심장 연구에 대 한 빛-시트 형광 현미경 검사 법

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