Name: 미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 배우세요 바이설파이트 시퀀싱과 바이오인포매틱 파이프라인을 활용한 정확한 미토콘드리아 DNA 메틸화 정량화 방법론입니다. BamHI 소화로 mtDNA를 선형화하여 과대평가를 방지하고 질병 연구에 활용할 수 있습니다.

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노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.

1. 제한 효소 처리
<ol><li>총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화. 참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다.</li>
	<li>각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물</li>
	<li>4 h 37 ° c.에 대 한 열 cycler에 있는 장소 관</li>
</ol>2. 황산 변환
<ol><li>BamHI 치료 DNA 나트륨 황산29설명 되어 있는 대로 사용 하 여 변환 합니다.</li>
	<li>200-500 ng BamHI 치료 DNA를 사용 하 여 각 변환 반응 20 μ의 전체 볼륨에 대 한. DNA 복구 50-70%입니다.</li>
	<li>황산 변환 DNA 10 μ 차입 버퍼에 elute</li>
	<li>Fluorometry에 의해 단일 가닥 DNA를 계량.</li>
	<li>선택 사항: 프로토콜의 나머지를 진행 하기 전에-20 ° C에서의 황산 변환 DNA를 저장 합니다. 장기 저장을 위한 저장-80 ° C에서의 황산 변환 DNA</li>
</ol>3입니다. 뇌관을 시퀀싱 하는 황산의 디자인
<ol><li>황산 시퀀싱 온라인 도구 Methprimer30 BiSearch31,32를 사용 하 여 뇌관 디자인. 참고: Methprimer 및 BiSearch 수 뇌관 바인딩 시퀀스 게놈 시퀀스에 대 한 검색 cytosines thymines 후 황산 처리와 유사 하 게 변환 됩니다.</li>
	<li>최적의 고 공평한 확대를 위한 뇌관에서 CpG 디를 방지 하 고 100-300 bp 사이 amplicon 크기를 디자인 합니다.</li>
	<li>설계 된 뇌관 뇌관 검색BiSearch의 함수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 DNA에 특정 인지 확인 합니다. 이미 설계 된 황산 변환 뇌관 삽입, 황산 상자 똑 딱 거리 고 PCR 매개 변수 및 참조 게놈을 포함. 참고: 가능한 PCR 제품의 목록이 표시 됩니다.</li>
	<li>복사 가기 1-5 뇌관 시퀀스 하 그들 oligonucleotide 종합에 대 한 주문 양식으로. 참고: 목록 인간 실험실에서 검증 된 마우스 mtDNA 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>황산을 사용 하 여 테스트 뇌관 PCR agarose 젤 전기 이동 법 4 단계에 설명 된 대로 다음 변환. 테스트와 별도로 모든 뇌관 쌍을 최적화 하 고 정확한 amplicon 크기 agarose 젤에 표시. 참고: 멀티플렉싱 뇌관, 필요한 경우 추가 하나에 여러 개의 뇌관 PCR 반응 단일 agarose 젤 전기 이동 법 또는, polyacrylamide 젤 전기 이동 법, 비슷한 제품을 구별 하는 것 같은 더 resolutive 방법에 PCR 제품을 시각화 크기입니다.</li>
</ol>4. 황산 PCR 및 젤 추출 변환
<ol><li>관심 영역을 증폭, 뜨거운 시작 Taq 중 합 효소를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 믹스 100 ng DNA, 500 µ M와 반대로 감각 뇌관, 1 µ L dNTP 믹스 (각 dNTP의 10 µ M), 그리고 50 µ L. 총 볼륨에 7.5 U/반응에서 중 합 효소를 변환 하는 간단히, 다음과 같은 조건 가진 PCR 실행: 95 ° C에서 5 분 (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 별도로 프라이 머를 사용 하거나 다중화.</li>
	<li>선택 사항: 뇌관, 멀티플렉싱 사용 200 ng 변환 DNA와 자전거 다음과: 5 분 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 주기; 10 분 72 ° c. 참고: 온도 뇌관의 녹는 온도 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>2 %agarose 100 볼트에 전기 이동 법 젤에 PCR 제품 주제.</li>
	<li>부드러운 자외선에서 메스와 PCR 제품을 추출 하 고 microtubes에 추가 합니다. DNA의 손상을 방지 하려면 과도 한 자외선에 PCR 제품을 노출 하지 마십시오. 노출 시간을 30 이상 하지 s.</li>
	<li>앞에서 설명한3젤 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>4.5 단계에서 순화 된 DNA를 계량 fluorometry를 사용 하 여. 5 단계 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
</ol>5입니다. 황산 시퀀싱 라이브러리 준비
<ol><li>황산 변환 PCR 제품의 라이브러리 준비를 수행 합니다. 옵션:이 단계에서 PCR 제품 멀티플렉스할.</li>
	<li>최대 100을 사용 하 여 최종 복구 수행 PCR 제품의 ng. 0.2 mL 튜브에 55.5 µ L PCR 제품을 3 µ L 최종 준비 효소와 6.5 µ L 최종 수리 반응 버퍼 (10 배)를 추가 합니다. 장소 및 20 ° c에서 65 ° c.에 30 분 뒤 30 분에 대 한 열 cycler에 튜브를 품 어</li>
	<li>15 µ L 블런트/TA 리가 믹스, 2.5 µ L 최종 수리 DNA를 혼합 하 여 시퀀싱 어댑터 선 어댑터와 1 µ L 결 찰 증강. 사용 하는 경우 &lt; 100 ng PCR 제품 입력으로 희석 어댑터 10 번.</li>
	<li>열 cycler에 믹스 (5.3 단계) 하 고 20 ° c.에서 15 분을 품 어 열 cycler 일시 중지 하 고 3 µ l 사용자 추가 튜브에 효소. 혼합 열 cycler에 다시 튜브를 배치 하 고 37 ° c.에서 15 분을 품 어</li>
	<li>크기는 DNA PCR 제품 크기에 따라 구슬의 다양 한 비율 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 비즈를 사용 하 여 어댑터 출혈 DNA를 선택 합니다.</li>
	<li>5.4 고 55 resuspended µ L SPRI 구슬에서 어댑터 출혈 DNA를 13.5 µ L H2O를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 5 분 및 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 솔루션은 분명, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬이 들어 있는 튜브를 삭제. 참고:는 상쾌한 어댑터 출혈 DNA를 포함 하 고 큰 원치 않는 조각을 폐기 구슬에 바인딩됩니다.</li>
	<li>단계의 5.6는 상쾌한에 25 µ L resuspended SPRI 구슬을 추가 하 고 섞어 실 온에서 5 분 동안 품 어. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명 하다는 상쾌한을 삭제 합니다. 참고: 폐기 상쾌한 어댑터 출혈 DNA 구슬에 바인딩되어 반면 원치 않는 DNA를 포함 합니다.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 실행 하는 동안 씻어 구슬 200 µ L 80% 에탄올 (갓 준비)를 추가 합니다. 품 어 30 s 및 제거와 삭제는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>공기 건조 구슬 5 분에 대 한 튜브 오픈 뚜껑 마그네틱 스탠드에 있는 동안.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 23 µ L 차입 버퍼에 DNA elute 혼합. 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명, 이전 PCR 증폭 (단계 5.14)에 대 한 96-잘 PCR 접시에 2 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>PCR 증폭 (단계 5.17)에 대 한 새로운 0.2 mL 튜브에 나머지 약 21 µ L를 전송. 참고: 해야 하지 어떤 구슬 구슬의 다음 단계 효소 반응 억제 수 있습니다 전송 합니다.</li>
	<li>단계 5.14 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행</li>
	<li>RT-정량 어댑터 출혈 DNA 증폭에 필요한 사이클 수를 예측 하 여 사전-PCR 증폭을 수행 합니다. 반응, 당 96 잘 PCR에서 다음 접시 포함 2 µ L DNA (단계 5.11) 추가: 0.4 µ L 인덱스 뇌관, 0.4 µ L 범용 PCR 뇌관, 7.2 µ L H2O, 10 µ L 실시간 정량 마스터 믹스.</li>
	<li>실시간 PCR 기계에 접시를 놓고 다음과 같은 조건에 접시를 주제: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 주기; 5 분 65 ° c.</li>
	<li>사전 증폭 RT-정량 PCR 반응의 선형 단계의 끝에 해당 Ct 값에 한 Ct 값을 빼서 각 샘플에 필요한 증폭 사이클의 수를 견적 한다.</li>
	<li>혼합 하 여 단계의 5.12 어댑터 출혈 DNA 증폭: 21 µ L DNA, 25 µ L PCR 마스터 혼합, 1 µ L 인덱스 뇌관, 1 µ L 범용 PCR 뇌관 및 2 µ L H2o. 열 cycler에서 다음과 같은 조건에 각 샘플 제목: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [5.16 단계에서 계산 된 Ct] 주기; 5 분 65 ° c. 참고:만 샘플 당 하나의 인덱스 뇌관을 사용 하 여 멀티플렉싱 있도록 기억 해요. 인덱스는 PCR 동안 삽입 됩니다.</li>
	<li>증폭된 DNA SPRI 구슬을 정화 하 고 22 µ L 차입 버퍼에 elute.</li>
	<li>젤 전기 이동 법 또는 대체 방법으로 라이브러리 품질을 제어 합니다. 올바른 라이브러리 피크 크기 (PCR 제품 크기 플러스 어댑터)를 찾습니다.</li>
	<li>얼룩 분석 라이브러리 제품의 평균 기본적인 쌍 크기 예측: 고급 전역 설정을 두 번 클릭 "테이블"에 얼룩 분석에서. 100-1000 bp에서 영역을 정의 하 고 확인을 클릭 합니다. 지역 테이블에서 정의 된 지역 나타나고 라이브러리 평균 크기 (bp) 계산 됩니다.</li>
	<li>Fluorometry에 의해 라이브러리를 계량. 6 단계 또는-20 ° c.에 게 라이브러리를 진행</li>
</ol>6. 다음 세대 시퀀싱
<ol><li>수식을 사용 하 여 라이브러리의 nM 농도 계산: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>라이브러리 같은 nM 농도 2 예 nM 희석 (선택 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 0.5 nM 라이브러리 농도 따라). 2 nM 라이브러리의 수영장을 달성 하기 위해 모든 라이브러리를 풀.</li>
	<li>변성 고 시퀀싱 악기 가이드 다음과 같은 라이브러리를 희석. 한마디로: 0.2 N NaOH 추가 하 여 2 nM 풀 변성 및 5 분 Dilute 오후 10의 최종 희석 변성된 풀에 대 한 실 온에서 품 어. 변성 고 오후 12 시 5의 최종 희석에 상용 컨트롤 라이브러리를 희석. 새로운 튜브 10 오후 수영장 20% 오후 12 시 5 컨트롤 라이브러리와 함께 혼합 한다. 참고: 황산 변환 매우 낮은 복잡성을 소개합니다. 20% 컨트롤 라이브러리 스파이크-에서 더 나은 품질의 시퀀싱 발생 합니다.</li>
	<li>깊은 시퀀싱 악기를 사용 하 여 150 bp 쌍-엔드 시퀀싱을 실행 합니다.</li>
</ol>7. 전산 분석-예상 메 틸 화 수준
<ol><li>.Fastq 파일 (sample1_R1.fastq.gz 및 sample1_R2.fastq.gz에 여기 라고 함)를 생성, 관심의 전체 게놈의 비스마르크 인덱스 생성 (여기에서 bismarkIndex라는 폴더) chrM의 게놈 시퀀스 fasta에 사용할 수 있는지 확인 하 고 형식 (여기서는 chrM라는 폴더에).</li>
	<li>어댑터 및 뇌관에 의해 소개 하는 바이어스를 제거에 전처리: Trim_galore33도구를 사용 하 여. 정방향 및 역방향 읽기의 5' 끝에서 2 개의 뉴클레오티드를 제거 합니다. trim_galore-clip_R1 2-clip_R2 2-o. /-쌍이 trim1-sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>전처리 된 읽기 비스마르크34 를 사용 하 여 전체 게놈에 정렬 비스마르크-사 개-빵-o. /. / bismarkIndex /-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz 참고: 다른 동기 기를 사용 하는 경우 고유 정렬 수 없습니다 읽기 삭제 됩니다 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>추출 읽고 염색체 M, Samtools35 를 사용 하 여 여기에 매핑 samtools 정렬-l 0-O BAM-o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam samtools 인덱스 sample1_sorted.bam samtools 볼-u sample1_sorted.bam chrM | samtools 정렬-n-O BAM-o sample1_chrM.bam</li>
	<li>메 틸 화 정보 추출 bismark_methylation_extractor-p-cx는-cytosine_report-포괄적인-genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>.bedGraph는.cov 또는 CX_report.txt 파일을 사용 하 여 추가 분석을 위해. 시각화 및 테스트에 대 한 sample1_chrM.CX_report.txt 파일을 사용 합니다.</li>
	<li>수행 추가 전처리 단계에서 클리핑 영역이 여러 개를 심문 하 고 뇌관 바이어스 매핑 중 생성 M 바이어스 플롯에서 볼 수 있습니다. 자세한 내용은 대 한 비스마르크 설명서를 참조 하십시오.</li>
</ol>8. 전산 분석-차이의 테스트
<ol><li>CX_report.txt 파일 들어 염색체 M에 모든 c 7 열, 염색체 (여기 chrM), 위치, 스트랜드, 갠 읽기 수, unmethylated 읽기, C 컨텍스트 및 주변 시퀀스의 수를 확인 합니다.</li>
	<li>CX_report chrM 전체에서 커버, 증폭 되는 지구를 하위 집합을 확인 합니다.</li>
	<li>비 파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여 개별 c의 어 부의 정확한 테스트 등 전체 영역에 대 한 로그인 테스트 샘플 간의 차이 대 한. 참고: 정량화 될 것입니다 종종 0% 메 틸 화, 가까운 왜 정상 가정 적절 하지 않은 이유입니다.</li>
	<li>마찬가지로, 시각화, 시각화 quantiles 하거나 이항 비율 신뢰 간격을 계산 합니다.</li>
</ol>

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저자는 선언할 수 없습니다 경쟁 금융 관심 있다.

여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 황산 시퀀싱 유물 이전 보고37했다. K 되었습니다 가수분해에 의해 DNA 액세서리 단백질의 부족 제거37을 설명 합니다. 불완전 한 변성 또는 부분 reannealing 이어질 수 있습니다 불완전 한 변환의 뻗어 아마도 단일 가닥 DNA37황산의 액세스를 낮춰서. 나중 유물 mtDNA에 놀이에 이차 구조 cytosines에 대 한 액세스를 손상...

미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 "황산 시퀀싱", 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화-번개 키트</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA 어세이</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 어세이 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA 중합효소 키트</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligo for Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>고감도 DNA 칩</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 고감도 dsDNA 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 시약 키트 v2 300 사이클</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>열 순환기 C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR 감지 시스템</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 형광측정기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 기기</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

미토 콘 드리 아 dna 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.

이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.
제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.
그대로 mtDNA 이차 구조와 황산의 가능한 장애 mtDNA unconversion 속도과 대 평가 매우 높습니다. 중 아 황산 염 연속, mtDNA unconversion 속도 조사에 소화, 미토 콘 드리 아 게놈의 5 가지 영역에서 인간 골격 근육 세포에서 전체 DNA...

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

이 중아황산염 염기서열분석 프로토콜과 생물정보학 파이프라인의 전반적인 목표는 미토콘드리아 DNA 메틸화의 정확한 정량화를 달성하는 것입니다. 이 방법은 미토콘드리아 DNA 메틸화가 인간의 질병을 변화시키고 있는지와 같은 유사분열학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미토콘드리아 DNA 메틸화를 정확하게 정량화할 수 있다는 것입니다.미토콘드리아 DNA 메틸화를 조사할 때 중요한 단계는 중아황산나트륨으로 처리하기 전에 BamH1 소화를 통해 미토콘드리아 DNA를 선형화하는 것입니다. BamH1 제한 효소 부위는 인간 미토콘드리아 게놈의 이 지도에 표시되어 있습니다. 또한 중아황산염 염기서열분석(bisulfite sequencing)에 의해 조사될 미토콘드리아 게놈의 5개 영역도 보여집니다.치환 루프, tRNA 페닐알라닌 및 12S 리보솜, 16S 리보솜, NADH 탈수소효소 5, 시토크롬 B mRNA 인코딩 유전자. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 온라인 도구를 사용하여 중아황산염 염기서열분석을 위한 프라이머를 설계한 후 BiSearch를 사용하여 미토콘드리아 게놈에 대한 프라이머 특이성을 검증합니다. 프라이머 염기서열은 BiSearch 기능 프라이머 검색에 추가됩니다.중아황산염 상자가 선택되고 참조 게놈이 선택됩니다. 검색 결과에는 감지 및 안티센스 체인에서 생성된 잠재적인 PCR 산물이 표시됩니다. 중아황산염으로 변환된 미토콘드리아 게놈에서 관심 영역을 증폭하려면 Hot-start Taq 중합효소를 사용하여 PCR을 수행합니다.프라이머를 별도로 사용하는 경우, 100 나노그램의 변환된 DNA, 500 마이크로몰의 센스 및 안티센스 프라이머, 1 마이크로리터 dNTP 믹스 및 중합효소를 50 마이크로리터의 총 부피에서 반응당 7.5 단위로 혼합합니다. 다음 조건으로 PCR을 실행합니다 : 섭씨 95 도에서 5 분, 섭씨 94 도에서 1 분, 섭씨 55 도에서 1 분, 섭씨 72 도에서 1 분 35 사이클 동안 1 분, 섭씨 72 도에서 10 분. 다중화 뇌관을 위해, 뒤에 오는 순환 조건에 있는 개조된 DNA의 200 nanograms를 이용하십시오: 95 섭씨 온도에 5 분, 94 섭씨 온도에 1 분, 55 섭씨 온도에 1.5 분, 및 72 섭씨 온도에 10 분을 위한 35 주기 동안 72 섭씨 온도에 1.5 분.PCR가 완료될 때, 100개의 볼트에 2%agarose를 사용하여 PCR 제품에 젤 전기 이동법을 실행하십시오. 아가로스 겔에서 PCR 산물의 추출은 UV 노출과 DNA 손상 위험을 최소화하는 방식으로 수행되어야 합니다. 자외선 아래에서 젤 사진을 찍습니다.그런 다음 매우 빠르게 메스로 PCR 산물 주위를 표시하고 자외선을 끕니다. 다음으로, 자외선에 노출되지 않고 PCR 산물을 천천히 절단합니다. 겔 슬라이스를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 겔 정제를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다.형광측정법을 사용하여 정제된 DNA를 정량화합니다. 샘플을 섭씨 20도에서 보관하되, 즉시 중아황산염 염기서열분석 라이브러리 준비를 진행하지 마십시오. 최대 100나노그램의 PCR 산물을 사용하여 말단 복구를 수행하여 중아황산염 변환된 PCR 산물의 라이브러리 준비를 시작합니다.각 0.2 millil 튜브에 55.5 microlit의 PCR 산물, 3 microliter의 end prep enzyme 및 6.5 microl의 10X end repair 반응 완충액을 추가합니다. 열순환기에서 튜브를 섭씨 20도에서 30분 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 말단 복구된 DNA를 15마이크로리터의 Blunt/TA 리가제 혼합물, 2.5마이크로리터의 어댑터, 1마이크로리터의 라이게이션 인핸서와 혼합하여 접합 시퀀싱 어댑터를 접합합니다.혼합물을 열 순환기에 넣고 섭씨 20도에서 15분 동안 배양합니다. thermocycler를 일시 중지하고 각 튜브에 3마이크로리터의 USER 효소를 추가합니다. 튜브를 섞어 써모사이클러에 다시 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.크기: 고체상 가역성 고정(solid phase reversible immobilization) 또는 SPRI를 사용하여 어댑터-결찰된 DNA를 선택합니다. 어댑터 결찰 DNA에 13.5마이크로리터의 물과 55마이크로리터의 재현탁 SPRI 비드를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 용액이 투명해지면 어댑터 결찰 DNA가 포함된 상등액을 새 튜브로 옮기고 비드가 포함된 튜브를 폐기합니다. 25 마이크로 리터의 재현 탁 된 SPRI 비드를 상층액에 첨가하십시오. 섞어서 실온에서 5분 동안 배양합니다.튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 투명해지면 상등액을 버립니다. 어댑터 결찰 DNA는 이제 비드에 결합됩니다. 튜브가 마그네틱 스탠드에 있는 동안 각 튜브에 갓 준비한 80% 에탄올 200마이크로리터를 추가하고 30초 동안 배양하여 비드를 세척합니다.상층액을 제거하고 폐기합니다. 이 에탄올 세척 단계를 반복하여 총 두 번 세척합니다. 두 번째 세척에서 에탄올을 제거하고 뚜껑을 연 상태에서 마그네틱 스탠드에 튜브를 그대로 두어 5분 동안 비드를 자연 건조합니다.5분 후, 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 비드에 23마이크로리터의 DNA 용출 버퍼를 첨가한 후 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다. 용액이 깨끗해질 때까지 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다.그런 다음 사전 PCR 증폭을 위해 2마이크로리터의 용액을 96-Well PCR 플레이트로 옮깁니다. 비드를 조심스럽게 피하면서 나머지 용액을 PCR 증폭을 위해 새로운 0.2 밀리리터 튜브로 옮깁니다. RT-qPCR에 의한 사전 PCR 증폭을 수행하여 어댑터 결찰된 DNA를 증폭하는 데 필요한 주기 수를 추정합니다.사용된 반응당 다음의 마스터 믹스를 만듭니다. 인덱스 프라이머 0.4마이크로리터, 범용 PCR 프라이머 0.4마이크로리터, 물 7.2마이크로리터, RT-qPCR 마스터 믹스 10마이크로리터. 그런 다음 마스터 믹스를 혼합하고 96-Well PCR 플레이트에 있는 2마이크로리터의 DNA에 18마이크로리터의 마스터 믹스를 추가합니다.플레이트를 Real-Time PCR 기계에 넣고 섭씨 98도에서 30초, 섭씨 98도에서 10초, 섭씨 65도에서 75초 동안 20주기 동안 증폭을 수행한 다음 섭씨 65도에서 5분 동안 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 샘플에 필요한 증폭 주기 수를 추정한 후 어댑터 결찰 DNA를 증폭합니다. 각 샘플에 대해 DNA 21마이크로리터, PCR 마스터 믹스 25마이크로리터, 인덱스 프라이머 1마이크로리터, 범용 PCR 프라이머 1마이크로리터 및 물 2마이크로리터를 혼합합니다.thermocycler에서 각 샘플에 다음 조건을 적용합니다.계산된 사이클 수에 대해 섭씨 98도에서 30초, 섭씨 98도에서 10초, 섭씨 65도에서 75초, 섭씨 65도에서 5분. 앞서 설명한 바와 같이 SPRI 비드를 사용하여 증폭된 DNA를 정제하고 22마이크로리터의 용리 완충액에서 용리합니다. Bioanalyzer를 사용하여 라이브러리 품질을 제어합니다.올바른 라이브러리 피크 크기를 찾습니다. 도말 분석을 통해 라이브러리 제품의 평균 염기쌍 크기를 추정합니다. Advanced Global Settings(고급 전역 설정)의 Smear Analysis(스미어 분석)에서 Table(테이블)을 두 번 클릭합니다.100에서 1000 염기 쌍 사이의 영역을 찾고 확인을 클릭합니다. Region Table(영역 테이블)에서 정의된 영역이 나타나고 라이브러리 평균 크기가 계산됩니다. 형광 측정법으로 라이브러리를 정량화합니다. 차세대 염기서열분석 및 컴퓨터 분석을 위해 준비될 때까지 라이브러리를 섭씨 20도에서 보관하십시오.중아황산염 염기서열분석을 통해 미토콘드리아 게놈의 5개 다른 영역에서 인간 골격근 세포의 소화되지 않은 DNA와 소화된 총 DNA에서 미토콘드리아 DNA 메틸화를 조사했습니다. 전체 사각형은 시토신 구아닌 디뉴클레오티드 부위를 나타냅니다. 열린 사각형은 비시토신 구아닌 디뉴클레오티드 부위를 나타냅니다.소화되지 않은 미토콘드리아 DNA의 경우, 메틸화 수치는 조사된 모든 영역에서 0-15.1% 범위였습니다. 그러나 중아황산염 전환 전에 DNA를 분해했을 때 모든 영역에서 역전환율이 최대 1%로 떨어졌습니다. 이는 미토콘드리아 DNA 메틸화 수준의 과대 평가를 피하기 위해 중아황산염 변환 전에 BamH1 분해의 중요성을 보여줍니다.이 비디오를 시청한 후에는 미토콘드리아 중아황산염 염기서열분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 당사의 생물정보학 파이프라인을 따라 미토콘드리아 DNA 메틸화를 정확하게 정량화할 수 있습니다.

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

DNA의 methylation 분석을위한 황금 표준 bisulphite 변환 DNA의 게놈 시퀀싱 수 있습니다. 이 방법은 산성 조건 하에서 deamination을 bisulphite 5 - methylcytosine (5 멕)과 비교 사이 토신의 증가 감도 활용합니다. Unmethylated cytosines는 대상 게놈의 DNA의 PCR 증폭 후 methylated cytosines 구별하실 수 있습니다.

의 DNA Methylation : Bisulphite의 변경 및 분석

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

이 비디오는 나일론 멤브레인에 DNA 샘플을 블롯팅하고 단클론 항체를 사용한 후속 시각화를 통해 체외에서 인간 연골 세포의 DNA 메틸화 수준을 결정하는 도트 블롯 기술을 설명합니다. 이는 배양의 다양한 단계에서 연골세포의 표현형을 결정하는 데 도움이 됩니다.

DNA 메틸화 정도를 결정하기 위한 5-메틸시토신 점 블롯

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

mtDNA 합성 및 분포를 검출하고 정량화하기 위해 다중 웰 플레이트 형식 및 자동화된 면역형광 이미징을 사용하여 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 대사의 역학을 연구하는 절차가 설명되어 있습니다. 이것은 mtDNA 대사에 대한 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵의 효과를 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

배우세요 바이설파이트 시퀀싱과 바이오인포매틱 파이프라인을 활용한 정확한 미토콘드리아 DNA 메틸화 정량화 방법론입니다. BamHI 소화로 mtDNA를 선형화하여 과대평가를 방지하고 질병 연구에 활용할 수 있습니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

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