Name: 항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 학습하세요 항체 배열을 이용한 신호 전달 경로 변화 분석 방법으로 암 세포 모델에서 인산화 상태를 신속하게 평가하고 약물 내성 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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우리는 관대 한 재정 지원의 로렌스 J. 엘리슨의 Transformative 의학 연구소의 USC (데이비드 Agus을 선물)에 대 한 감사. 우리가 Beemer와 세대에 이어질 리사 Flashner의 지원과이 원고에의 게시 주셔서 감사 합니다. 우리는 그녀의 행정 지원에 대 한로 라 니 감사합니다.

1. 단백질 추출
<ol><li>10 m m 조직 문화 접시 (또는 플라스 크)에 5 x 106 세포 조직 문화 후드에서 플레이트. 자동 셀 카운터 또는 hemocytometer 도금 시 셀을 계산 합니다. 또는, 세포 수를 견적 한다.</li>
	<li>10 m m (또는 플라스 크)에 성장 셀 린스 철저 하 게 10 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 배 (pH = 7.4). 세포의 용 해 버퍼를 추가 하기 전에 모든 PBS를 제거 되었는지 확인 합니다. 참고: 세포의 용 해 버퍼는 보통 키트와 함께 제공 됩니다. 그렇지 않은 경우에 다음 사용 radioimmunoprecipitation 분석 결과 버퍼 (RIPA) 또는 어떤 다른 세포 세포의 용 해 버퍼 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 칵테일을 포함 하.</li>
	<li>셀에 버퍼의 정확한 금액을 추가 하 고 세포의 용 해 버퍼에 셀 스 크레이 퍼와 세포를 근 근이 여 1 x 107 셀/mL의 세포 세포의 용 해 버퍼를 lyse. (예를 들어, HeLa 세포와 MiaPaCa-2, 10 cm 접시 당 600 µ L) 사용 합니다.</li>
	<li>(약 10 배) 위아래로 lysate 플라스틱 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 그것을 전송.</li>
	<li>선호는 로커/쉐이 커에 4 ° C에서 30 분 동안 lysates 품 어. 눌러 눌러는 lysate 주사기 27 G 바늘 10 x는 cell membrane(s)의 적절 한 중단 되도록 합니다. 또는, lysate를 sonicate. -20 ° C에서 lysates 저장 하거나 즉시 그들을 사용 합니다.</li>
	<li>15 분 동안 4 ° C에서 14000 x g 에서 lysate 원심 하 고 깨끗 한 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 성 시험 (BCA)20 또는 리 등 브래드포드 동등한 총 단백질의 양을 quantitate 고 적어도 50-400 μ g 계속 합니다. 즉시 단백질 또는 약 수를 사용 하 여 및 동결 /-70 ° C에서 그들 매장 (여러 freeze-thaw 주기를 피하기 위해).</li>
</ol>2. 인간의 Phosphokinase 배열
<ol><li>(약 1 시간)에 대 한 시작 하기 전에 실내 온도에 모든 시 약을가지고. 참고: 모든 시 약 및 플라스틱 마모 키트에 포함 됩니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 절차를 시작 하기 전에 모든 시 약 신선한 (배열 버퍼)를 준비 (대상/배열의 선택에 따라 지침 달라질 수 있습니다 약간).</li>
	<li>이온을 제거 된 물 100 μ의 탐지 항 체 칵테일을 다시 구성 하거나 제공 1.5 mL 테스트 튜브 다 해야 제조 업체의 지침을 따르십시오.</li>
	<li>워시 버퍼 이온 물 960 ml에서 x 25의 40 mL를 diluting 하 여 워시 버퍼 x 1을 준비 하 고 반전 하 여 그들을 믹스. 참고: 크리스탈 실 온에서 분해. 버퍼는 시간이 지남에 노란색 설정할 수 있습니다 하지만 여전히 작동 합니다.</li>
	<li>8 잘 멀티 트레이 (또는 4-잘 멀티 트레이 2 mL)의 각 음에 배열 버퍼 1의 1 mL 플라스틱</li>
	<li>플랫 팁 핀셋 보호 시트 사이 배열 막 제거와 우물에 그들을 배치. 멤브레인에 숫자 위쪽으로 직면 하 고 있는지 확인 합니다. 참고: 침수, 시 막에 염료 사라질 것 이다.</li>
	<li>뚜껑 트레이 커버 하 고 실 온에서 60 분에 대 한 락 플랫폼 통에 품 어. 참고: 이것은 막 차단 단계입니다.</li>
	<li>인큐베이션 기간 동안 단백질 샘플 준비. 총 단백질의 50-100 μ g을 추가 합니다. 희석 lysate 334 μ 1 mL의 최종 볼륨을 세포의 용 해 버퍼의 최대 볼륨을 데. 참고: 총 단백질의 50-100 μ g는 일반적으로 충분합니다.</li>
	<li>신중 하 게 배열 버퍼 1을 aspirate 하 고 품 어 락 플랫폼 통에 2-8 ° C에서 하룻밤 샘플의 1 mL로 세포 막. 참고: 않습니다 하지 터치/스크래치는 막.</li>
	<li>다음 날, 신중 하 게 각 배열을 제거 하 고 개별 플라스틱 용기 (약 8 x 11 cm2)에 그것을 배치 하 여 20 mL 1 x 워시 버퍼의 배열 씻어. 실 온에서 버퍼를 세척 x 1에서 락 플랫폼에 막 3 x 10 분을 씻어.</li>
	<li>재구성 된 항 체 칵테일의 20 μ 플라스틱에서 단계 배열 버퍼 2 x 1의 2.3 1 mL. 각 8 잘 사용할 수에이 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 세척 쟁반에서 멤브레인을 제거. 어떤 과잉 워시 버퍼를 제거 하 고 항 체 칵테일을 포함 하는 쟁반으로 다시 그들을 전송 하는 종이 타 올에 아래쪽 가장자리를 되 리. 뚜껑 트레이 커버 하 고 락 플랫폼에 실 온에서 2 h에 품 어. 철저 하 게 dH2O 사용된 트레이 헹 구 고 나중 사용을 위해 그들을 건조.</li>
	<li>조심 스럽게 각 배열 제거 하 고 다시 1 x 워시 버퍼의 20 mL와 함께 깨끗 한 개별 플라스틱 용기 (약 8 x 11 cm2)에 배치. 실 온에서 락 플랫폼에 워시 버퍼와 3 x 10 분 워시 그들.</li>
	<li>희석 Streptavidin HRP (키트와 함께 제공) 또는 streptavidin 형광 염료 (더 양적 감지)에 대 한 15 mL 테스트 튜브에서 배열 버퍼 2 x 1에 1:1,000.</li>
	<li>HP 솔루션을 포함 8 잘 요리에 멤브레인을 (해당 되는 경우 형광를 사용 하 여 모든 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 트레이 포장) 락 플랫폼에 실 온에서 30 분 동안 그들을 품 어.</li>
	<li>3m 종이 5 mm의 2 조각 사이 막 배치 하 여 초과 버퍼를 제거 합니다. X 선 필름/chemiluminescent 이미징 이미징, HRP 탐지 솔루션 (믹스 두 chemiluminescent 솔루션 1:1) 3 분 건조 막 품 어 고 막 투명 한 플라스틱 시트 보호 합니다. 참고: 말린된 membrane(s); 형광 신호를 검출 하는 형광 영상에 배치 될 수 있습니다 또한 영상 전에 막에 빛 노출을 최소화 합니다. X 선 필름 또는 영상 파일의 정량화에 대 한 노출 과도를 하지 마십시오. 대부분 chemiluminescent/형광 감시 신호 포화를 방지 하는 기능이 있다.</li>
</ol>3. 데이터 분석
<ol><li>ImageJ, 처리 프로그램21, 이미지를 다운로드 하 고 소프트웨어를 설치.</li>
	<li>ImageJ 'ImageJ 아이콘'을 더블 클릭 하 여 엽니다. 메뉴 표시줄에서 '파일' 을 클릭 하 여 분석할 이미지 선택 다음 드롭 다운 메뉴에서 '열기' 를 선택 하 고 관심의 이미지에 대 한 컴퓨터 파일 검색. 열려는 파일을 클릭 합니다.</li>
	<li>메뉴 표시줄에서 '편집' 을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 '반전' 을 선택 하 여 분석 (검은색에 흰색 반점에 흰색 바탕에 검은 반점)에 대 한 그림을 반전.</li>
	<li>도구 모음 (ImageJ 도구 모음에서 두 번째 옵션)에서 '타원형 아이콘'을 선택 합니다. (블랙 십자가) 그림을 클릭 하 고 마우스를 이동 하 여 원/타원을 그립니다. 점 오 점에 점 들을 둘러싸 자 원형/타원형의 크기/모양 조정 합니다.</li>
	<li>메뉴 막대에서 '분석' 을 클릭 하 고 자동으로 선택 된 영역 (지역, 평균, 최소, 및 최대)의 값으로 새로운 창을 열고 드롭 다운 메뉴에서 '측정' 을 선택 합니다.</li>
	<li>원형 지역 센터 (넣어 중간에 화살표 오른쪽 지점)에서 동그라미를 드래그 하 여 이동 하 고 측정 (도트) 주변 장소. 관심, 긍정적인 통제, 부정적인 컨트롤 및 분석에 대 한 백그라운드의 모든 관광 명소를 측정 합니다. 주: 부정적인 컨트롤은 PBS, 배경 없이 어떤 자리 (어떤 부분을 할 것입니다), 막의 한 부분 이다 고 긍정적인 컨트롤은 제조업체에서 제공 하는 컨트롤.</li>
	<li>PBS 부정적인 제어 관광 명소를 선택 하 고 각 자리 값을 뺍니다. 각 수용 체 티로신 키나 제 (RTK)를 대표 하는 중복 명소의 각 쌍에 대 한 강도 평균. 각 평균 강도 겹 변경 계산 컨트롤 관련이 있을 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

많은 생물학 정보를 결합 하는 접근은 수행 하는 실험에서 세포 기계의 본질적으로 더 정확한 표현입니다. 인 항 체 배열의 출현의 어떤 단일 단백질의 수정 상태 보다 더 유익 될 수 있는 수정 패턴의 신속한 특성화 수 있습니다. 인 항 체 배열의 응용 프로그램에 대 한 일반적인 워크플로 수정 떠들고, 트레오닌, 또는 티로신을 기반으로 합니다. 이 예제에서는 변경 연관 된 폐암에 치료에 저항을 특성화에 집중 했다. 이 응용 프로그램에 대 한 주요 근거는 많은 인간 암18, 신호 변환에서 중심 역할을 담당 하는 단백질 인 산화 그리고이 메서드는 다른 시스템에 양도 될 것입니다. 암 인 산화의 dysregulation는 티로신 키 니 아 제, hyperactivation에 일반적으로 포함 한다 존재 하 고 따라서, phosphorylated 기판 (자동 phosphorylated 키 자체를 포함 하 여 종종) 보다 높은 수준에서 정상에 생리 적 설정 및, 따라서, 암 세포에 phosphopro...

타겟된 티로신 키 니 아 제 억제제 (TKI)의 임상 구현 그 드라이브 종양 약 변화에 특정 단백질을 대상으로 효과적인 도구로 의사를 제공 하 여 암 치료를 변화 하고있다. 이러한 화합물을 억제 하거나 tyrosine kinases1,2에 의해 표적으로 하는 단백질의 인 산화를 차단 합니다. TKIs는 유전자를 신호 하는 다양 한 키에 유전 변경 드라이브 암 개시 [예를 들어, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), proto-oncogene 티로신 단백질 키 니 아 제 Src (SRC), 진행 하기에 충분 하기 때문에 부분에서 개발 되었다 BCR-ABL, 그리고 인간 표 피 성장 인자 수용 체 2 (HER2)]3,4. 세포 주기5 와6 분자 신호 경로 TKIs의 영향 분자로 가이드 암 치료에는 타겟이 불분명 한에서 변환을 나타냅니다. TKIs 대 화학 요법의 주요 장점은 증가 응답 속도 건강 한 세포7독성의 낮은 위험. 결과적으로, 거기 증가 하고있다 소설 TKIs의 개발과 연구에 대 한 관심.
게놈 시퀀싱 결과에 대 한 액세스 인간 게놈 프로젝트8,,910 함께 시작 하 고 다양 한 다음-세대 (NextGen) 암 시퀀싱 노력 [예를 들면,의 암 게놈 오늘 계속 아틀라스 (TCGA)11,12]. 이 유전자의 수천에 동시 정보를 제공 하 고는 그리고/또한 유전자 또는 생물학 섭13로 변조 하는 단백질의 편견된 스냅샷을 제공 하는 많은 실험 방법론을 영감 하고있다. 포스트 번역 상 수정 단백질 그리고 그들의 활동의 유전자의 녹음 방송에서 여러 수준에서 발생 하는 세포 기능의 규칙 이후 세포질 기능을 제어 하는 이벤트에 대 한 완전 한 이해는 궁극적으로 다양 한 생물 학적 정보에서 데이터의 통합이 필요 합니다. 단일 셀 유전자 해상도와 유전자의 수천의 메신저 RNA (mRNA) 레벨을 모니터링 하는 기능 전체 게놈 규모로 유전자 기능 및 상호 작용에 대 한 추론을 할 수 있는 능력을 증가 했다. 그러나, 유전자 식 배열의 해석 항상 본질적으로 불완전 한 것 없이 규제의 다른 레벨의 통합: 즉, 단백질 표정 수준, 단백질 수정 상태 및 포스트 번역 상 단백질 수정 (인 산화, ubiquitylation, 메 틸 화, 등) 여기, 우리는 하나의 실험14,15, 에서 다양 한 조건의 기능으로 중요 한 신호 구성 요소의 포스트 번역 상 수정이 수단으로 항 체 배열 유틸리티 설명 16.
구별 하 여 신호 변환 통로16에 대 한 변경 내용을 분석 인 항 체 어레이 사용할 수 있습니다. 이러한 유전 수정 또는 셀 라인 kinase 억제제, chemotherapeutics, 포도 당 부족, 저 산소 증, 또는 혈 청 기아로 인 한 스트레스의 치료에서 발생할 수 있습니다. 참고, 약물 내성 또는 특정 유전자의 업 또는 downregulation 발생할 수 있습니다 또한 변화 신호 변환 통로17에.
예를 들어 약물 저항 감도 피하기 위해 마약 대상의 돌연변이에서 발생할 수 있습니다. 폐암, 알려진 EGFR 돌연변이 렌더링 암 특정 TKIs에 무감각 하지만 다른 사람에 게 더 취약. 대체 경로 신호 변이17시 활성화할 수 있습니다. 저항 및 hypoxia, 등등에 관련 된 신호 변환 통로의 식별에 대 한 광범위 한 응용 프로그램으로 인 항 체 배열에, 더 많은 통찰력을 제공 하 고 관련 된 메커니즘의 결과적으로 이해 하 고.
그들은 종종 효소 또는 단백질 사이 육체적 인 상호 작용의 활동을 조절 하는 등 규제 기능을 제공 하기 때문에 단백질 수정의 평가 허용 하는 기술 시스템 생물학의 중요 한 구성 요소를 나타냅니다. 포스트 번역 상 수정의 중요성은 거의 모든 트리거 extracellular 신호 변환 통로18인 산화 단백질의 역할에 의해 나와 있습니다. 전통적으로, kinases 또는 단백질의 인 산화 상태의 식별 수 또한 의해 결정 될 서쪽 오 점 분석 연구원은만 1-5 대상에 관심이 있는 경우에 특히. 그러나, 서쪽 오 점은 매우 선택적 사전 지식으로 바이어스 될 수 있다 고 결과적으로 중요 한 목표를 놓칠 수도 있습니다. 항 체 어레이 (예를 들어, 유리 또는 니트로) 단단한 매트릭스에 다양 한 캡처 항 [팬 전용 phosphorylated tyrosine(s), 안티-유비퀴틴, 등]를 포함 하 여 여러 대상의 중간 처리량 판독을 제공 합니다. 2 차 항 체 ELISA 샌드위치 기반 형식 (그림 1)에 있는 특정 단백질에 정보를 제공합니다. 이 분석 결과 더 많은 목표의 또는 사전 지식이 제한15로 더 강력 하 고 관련 된다. 그들은 뿐만 아니라 일반 양의 다양 한 실험 대상의 단백질 인 산화를 비교 하 고 질량 분석을 통해 크게 향상 된 정량화를 제공 수 인 배열 더 광범위 하 게 자격이 있습니다. 이 기술은 새로운 또는 이전에 알려지지 않은 인 산화 위치의 식별에 대 한 적용 되지 않습니다.
대규모 질량 분석 기반 단백질 단백질19의 인 산화 특정 사이트를 식별 하기 위해 채택 될 수 있습니다. 이 기술은 수천 닢 이벤트를 열거할 수 있습니다, 하지만 비싼 계측, 전용된 실험 파이프라인 및 대부분 연구자의 범위 저쪽에 전산 전문 지식을 필요 합니다.
항 체 배열과 다양 한 단백질 해독16동시 판독을 제공합니다. 이러한 단백질 ubiquitylation (유비퀴틴 배열) 또는 인 산화에 변경 될 수 있습니다. 이 배열 기술의 주요 장점은 그것 중요 한 세포 매개 변수 (53 kDa, p53, 수용 체 tyrosine kinases와 세포내 통로 단백질)와 관련 된 다양 한 생물학 통로의 생물 학적 상태에 중요 한 피드백을 제공 동시에. 또한, 그것이 분석 결과 (예:, apoptosis와 유비퀴틴과 인 산화)의 침투를 증가 하기 위하여 다양 한 배열 형식을 결합 가능 합니다. 이 시간 및 비용 effective 방식으로 특정 계측 또는 전문 지식을 필요로 하지 않는 동시에 여러 샘플에서 다양 한 닢 변경을 평가 하기 위해 여러 개의 배열을 결합 기능은 경우에 중요 한 이점의 항 체 배열.

<table><tbody><tr><td>Odysee SA Imager</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>형광 이미저</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>Eppendorf</td><td>22363212</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falkon (Corning)</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS)</td>단백질 <td>추출을 위한</td> <td>Corning</td><td>21-031-CV</td> 세척 버퍼</tr><tr><td>조직 배양 접시 100 mm</td><td>TRP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>ICC 인슐린 주사기 U100</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td>27 G5/8,&nbsp; 단백질 샘플의 바늘 처리를 위한 1 mL</td></tr><tr><td>단백질 프로파일러 ARRAY&nbsp;</td><td>R& D</td><td>ARY003B</td><td>Human phospho MAPK 어레이</td></tr><tr><td>단백질 프로파일러 어레이&nbsp;</td><td>R& D</td><td>ARY002B</td><td>Human phospho kinase array</td></tr><tr><td>Centrifuge Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Table top centrifuge</td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMAX M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>단백질 정량화를 위한 흡광도 리더</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-32230</td><td>형광 검출을 위한 Streptavidin 접합체</td></tr><tr><td>LabGard ES Class II, Type A2 생물 안전성 캐비닛</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td>조직 배양 후드</td></tr><tr><td>TC20 자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>세포 계수기</td></tr><tr><td>중단 프로테아제 & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78446</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 버퍼</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>F60</td><td>sonicator</td></tr><tr><td>Rocking platform shaker</td><td>VWR</td><td>10860-780</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH 오픈 소스</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>SAS Institutie JMP&reg; 12.1.0 (64비트)</td><td>마이크로소프트</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 tyrosine kinase 억제제에 평가

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

암 환자는 단백질 인 산화 네트워크의 탈 규제와 종종 tyrosine kinase 억제제와 함께 처리 됩니다. 85%에 접근 하는 응답 속도 일반적 이다입니다. 불행 하 게도, 환자 자주 될 치료에 다루기 힘든 그들의 신호 전달 경로 변경 하 여. Microarrays와 식 프로 파일링의 구현 전체 mRNA 수준 변화를 식별할 수 있습니다 및 단백질 단백질 수준에서 전반적인 변화를 확인할 수 있습니다 또는 단백질, 그러나 신호 변환의 활동을 확인할 수 있다 경로 포스트 번역 상 수정 단백질의 심문 하 여 설정할 수 있습니다. 그 결과, 약물 치료는 성공 여부 또는 저항 발생 여부를 식별 하는 기능 또는 신호 경로에 모든 변경 하는 능력은 중요 한 임상 도전 이다. 여기, 우리는 시스템 차원의 변경 다양 한 포스트 번역 상 수정 (예를 들어, 인 산화)에서 확인할 수 있는 도구로 서 항 체 배열의 자세한 설명을 제공 합니다. 항 체 어레이 사용의 장점 중 하나는 그들의 접근성 (배열 하지 않아도 proteomics에 전문가 또는 비용이 많이 드는 장비) 및 속도 포함 됩니다. 포스트 번역 상 수정 조합 대상 배열의 여부 기본 제한 사항입니다. 또한, 공평한 접근 (phosphoproteomics) 항 체 어레이 가장 널리 특징이 대상에 대 한 이상적인 소설 발견에 대 한 더 적합 한 수 있습니다.

TKI 저항 세포에서 신호 변환 통로에 효과 조사, 4 개의 샘플 분석 되었다. 한 컨트롤 샘플 (H3255r1) 및 3 TKI 저항 셀 라인 (H3255r2-4) (그림 2) 자리 항 체 서식 파일 (그림 3)에 관련 되었다. 모든 4 샘플은이 프로토콜을 사용 하 여 준비 되었다. 차동 활동 6 phosphoproteins 항 체 배열 (그림 4)의 분석의 데모에 대 한 선정 됐다. 열 지도 (그림 5)는 중요 한 신호 전달 단백질의 단백질 인 산화에 변화에 반 양적 판독을 제공합니다. 배열 결과의 유효성 검사는 서쪽에 게 더 럽 히기 등 직교 방법을 구현 하 여 완료할 수 있습니다.
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여기, 우리는 다양 한 세포 모델에서 신호 경로 변경을 식별 하기 위해 항 체 배열에 대 한 프로토콜을 제시. 마약/산소/초 violet 빛/방사선, 또는 overexpression/downregulation/녹아웃, 한 이러한 변경 사항을 다양 한 질병 모델에 대 한 중요 하 고 치료 효과가 있을 것입니다 또는 약물의 메커니즘을 확인할 수 있습니다. 여부를 나타낼 수 있습니다. 저항입니다.

항 체 배열에 의해 신호 변환 통로의 심문에 의해 Tyrosine Kinase 억제제에 평가

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

이 방법은 암 성장을 유발하거나 특정 치료에 대한 저항의 발달을 일으킬 수있는 신호 네트워크의 혼란에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 암에서 자주 규제되는 여러 네트워크의 인산화 상태에 신속하고 신뢰할 수있는 피드백을 제공 할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 변경 및 번역 후 수정의 식별신호 변환 통로 활동에 있는 변경을 해명할 수 있기 때문에 약 저항하는 암의 치료로 확장합니다.이 기술은 인산화에 사용되지만, 글리코실화 및 유비쿼터틸화와 같은 다른 번역 후 수정을 보는 데사용할 수도 있습니다. 마지막 세척 후 PBS를 모두 제거하기 위해 주의하는 PBS의 10 밀리리터로 야간 배양 세포를 세 번 완전히 헹구는 것으로 시작합니다. 다음으로, 단백질 분석 키트로부터 적절한 양의 용해 완충제를 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리한다.결과 세포 용액을 약 10회 트리투레이한 후 1.5 밀리리터 튜브로 7세포로 10회 이상 이송한다. 셀을 섭씨 4도에서 30분간 배양하여 흔들어 보임합니다. 그런 다음 27 게이지 바늘이 장착된 주사기에 용액을 적재하고 샘플을 10번 분배하여 세포막을 전단합니다.세포막이 완전히 중단되었을 때, 원심분리기 는 용해를 원심분리하고 표준 프로토콜에 따라 후속 총 단백질 정량화를 위해 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 상체를 전달합니다. 인간 인포키나아제 분석기를 수행하려면 먼저 평평한 핀셋을 사용하여 4웰다트 트레이의 각 웰에 1개의 어레이 멤브레인을 배치하여 막의 수와 잘 함께 새로 준비된 어레이 버퍼 1개씩 들어 놓습니다. 침수시 멤브레인의 염료가 사라집니다.트레이를 뚜껑으로 덮고 실온에서 60분 동안 흔들 플랫폼 셰이커의 멤브레인을 배양합니다. 이 차단 인큐베이션 동안, 각 용액 샘플을 최대 334 마이크로리터의 최대 부피로 50-100 마이크로그램의 단백질 농도로 희석하고 신선한 어레이 버퍼로 추출된 단백질 샘플의 최종 부피를 최대 1.5 밀리리터까지 가져옵니다. 다음으로, 멀티 트레이의 각 우물에서 배열 버퍼를 조심스럽게 흡인하고 흔들 플랫폼 셰이커에서 섭씨 2~8도에서 하룻밤 동안 1.5 밀리리터의 단백질 샘플로 멤브레인을 배양합니다.다음 날 아침, 각 배열을 각 배열을 실온에서 흔들리는 플랫폼에서 10분 동안 세척 버퍼 20밀리리터가 들어 있는 개별 플라스틱 용기에 조심스럽게 옮겨 넣습니다. 마지막 세척 후, 적절한

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

RPPA이 휘황이라는 항체를 사용하여 동시에 심문을 할 수 니트로 셀룰로스 슬라이드에 인쇄 샘플 수백의 단백질 표현을 할 수 있습니다. 이 기술은 투명 세포 신장 암에서 약물 치료 이질성의 효과를 연구에 적용되었습니다.

개인 신장 세포 암에서 단백질 표현 변화를 탐험하기 위해 역 위상 단백질 배열 (RPPA)의 사용

수용체 티로신 키나아제는 ectopically 많은 암에서 발현되는 급성 백혈병의 치료 표적으로 확인되었습니다. 이 원고는 급성 백혈병의 치료를위한 티로신 키나제 억제제의 전 임상 평가를위한 효율적인 전략을 설명한다.

급성 백혈병의 치료에 대한 티로신 키나제 억제제의 전임상 평가

키나제 억제제 치료에 대한 저항성 유전자의 출현은 효과적인 암 치료를위한 중요한 도전을 포즈. 새로 개발 된 약물에 대한 식별 및 내성 돌연변이의 특성은 더 나은 임상 관리 및 차세대 약물 설계에 도움이됩니다. 여기서 우리는 체외 검사 및 내성 돌연변이의 검증하기위한 우리의 프로토콜을 설명합니다.

키나제 억제제에 대해 내성 돌연변이의 검사 및 검증을위한 방법

펩타이드 어레이 스크리닝은 단백질-단백질 상호 작용 부위를 식별하기 위한 고처리량 분석법입니다. 이를 통해 표적 단백질의 여러 상호 작용을 매핑할 수 있으며 단백질을 표적으로 하는 억제제의 부위를 식별하는 방법으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 어레이를 스크리닝하고 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

펩타이드 배열을 사용하여 단백질 - 단백질 상호 작용 사이트를 확인

임상 증상은 다음 이전에 또는에 - - 타겟 치료제에 대한 약물 저항은 광범위하고 저항의 메커니즘을 식별 할 필요가있다 대체 임상 관리 전략을 안내하기위한 중요합니다. 여기, 우리는 이러한 메커니즘의 발견을 촉진하는 순서와 체외에서 약제 내성 라인의 몇 유도에 프로토콜을 제시한다.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

여기, 우리는 생체 외에서 그리고 vivo에서 유전자 및 인간 답게 된 마우스 모델을 사용 하 여 백혈병에서 마약 대상으로 c Fos와 Dusp1의 유전과 화학 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 유전 유효성 검사 및 치료 개발에 대 한 모든 대상에 적용할 수 있습니다.

Oncogene 의존에 c Fos의 역할 및 Dusp1를 평가 하기 위한 방법

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

키나아제 억제제의 스크리닝을 위한 자가 조립된 인간 단백질 마이크로어레이의 생성을 위한 상세한 프로토콜이 제시된다.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

시간-분해된 Förster 공명 에너지 전달 세포 기반 분석 프로토콜은 384-웰 포맷의 세포 용해물에서 내인성 인산화 신호 변환기 및 전사 활성화제(STAT) 1/3/4/5/6 단백질의 단순하고, 특이적이며, 민감하고, 강력한 정량화를 위해 기술된다.

인간 세포에서 내인성 인산화 STAT 단백질의 측정을 위한 시간 분해된 Förster 공명 에너지 전달 분석

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