Name: 깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 배우세요 유리 Optrode를 이용한 깨어 있는 쥐의 단일 신경 단위 광유전학 기록 기법으로 GABAerg성 및 글루타메이트성 뉴런을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 비용 효율적인 재료로 신경 회로를 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 승진의 과학 KAKENHI 그랜트 JP16K11200 및 17 H 02223, 일본 사회와 가나자와 의료 대학 S2016-8 및 C2017-3에서 연구 보조금에 의해 지원 되었다. 우리는 사진 촬영에 그의 지원에 대 한 Yuhichi 것을 감사 합니다.

모든 절차는 동물 관리 위원회의 가나자와 의과대학의 승인와 일본의 생리 사회의 원칙에 따라 수행 됩니다.
1입니다. 건설 유리 Optrode 홀더
참고: 유리 optrode 홀더를 구축 하는 상업 전극 홀더 사용 됩니다 (그림 1A).
<ol><li>부드럽게 소유자의 배럴에서 압력 제어를 위해 스틸 튜브 밖으로 당겨.</li>
	<li>드릴링에 의해 소유자의 배럴에서 핀 좌석 쪽의 구멍을 확대. 깊이 3 m m 직경에서 그리고 12mm 구멍을 확인 합니다.</li>
	<li>스테인리스 강 관 (직경에서 3 m m, 두께, 0.5 m m 그리고 길이; 8 m m를 넣어 그림 1A 2) 구멍에.</li>
	<li>구멍에 ⌀2.5 m m 깃 봉 (그림 1A1)에 대 한 짝짓기 소매를 분할 하는 세라믹을 삽입 합니다.</li>
	<li>에폭시 접착제는 L 자 모양의 사 개에 전극 홀더의 배럴을 수정 합니다.</li>
	<li>사 개에 구멍 (직경에서 3 m m)를 확인 하 고 나사와 조작에 첨부.</li>
</ol>2. 머리 포스트 설치
<ol><li>회로 보드 스페이서의 만든 맞춤식 머리 게시물을 준비. 열 회로 보드 스페이서 밀링 커터 cuboidal 모양으로 만들고 (그림 1B) 톱으로 2 머리 게시물에 그것을 잘라. 밀링 커터 헤드 게시물의 하단에 평평 하 게.</li>
	<li>빛에 민감한 opsin 연구에 대 한 특정 뉴런 형식에 표현 하는 유전자 변형 동물을 준비 합니다. 이 작품에는 억제 신경 channelrhodopsin-2 (ChR2)11 을 표현 하는 유전자 변형 마우스 (VGAT-ChR2 마우스) 사용 됩니다.</li>
	<li>복 관리에 의해 medetomidine의 0.3 mg/kg, 4.0 mg/kg, midazolam의 및 butorphanol의 5.0 mg/kg의 혼합물으로 동물을 anesthetize. 동물 마 취 완벽 하 게 확인, 곤란 꼬리의 반응을 테스트 합니다.</li>
	<li>생리대에 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 청소 stereotaxic 프레임 및 난방 패드 70% 알코올로 미리. 치아를 물린 바의 구멍에 놓고 가볍게 코 클램프를 조여. 귀 막대를 사용 하 여 머리의 양쪽 모두를 수정 합니다. 머리 귀 막대로 고정 올바르게 때 코 클램프를 조입니다. 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.</li>
	<li>작은 위로 머리 피부를 면도 하 고 액체 글 루 콘 산의 면봉으로 두 피를 청소. 수술 하기 전에 수술 도구와 머리 압력솥 (121 ° C, 15 분)와 게시 모든 소독 합니다.</li>
	<li>두 피 중간 선 따라가 위로 잘라 고 옆으로 밀어. 눈 (약 20 m m)를 머리 뒤쪽에서 절 개를 확인 합니다. 70% 알코올에 담근 면봉으로 여과 제거 하 고 건조 한 두개골.</li>
	<li>조작자를 머리 게시물을 연결 합니다. 머리 게시물 두개골 bregma 조작자를 사용 하 여 주위에 배치 합니다.</li>
	<li>단위체 (4 정), 촉매 (1 방울), 및 냉장고에 미리 냉장은 작은 접시에 치과 시멘트의 폴리머 (1 작은 스푼) 섞는다. 정면에 해골 머리 게시물 수정 두개골의 정수 리 뼈 (1 g) 아래 치과 시멘트를 넣어.</li>
	<li>치과 시멘트 하드 후, stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거 합니다. 노출 된 피부에 항생제 연 고를 넣어. Medetomidine 길 항 제 (0.3 mg/kg)과 항생제 (oxytetracycline; 20 mg/kg) 주사. 깨우 고, 주택 케이지를 반환 때까지 장소와 모니터에 마우스에에서 패드.</li>
	<li>하우스 몇 가지 농축 장치 개별 주택 장에 동물. 케이지를 청결 한 유지 하 고 감염을 방지 하기 위해 매일 침구 동물 종이 변경 합니다. 신중 하 게 모니터링 동물 표시 불편의 어떤 표시 든 지. 상처에 적용 lidocaine 통증이 의심 되는 경우. 관리 meloxicam 또는 carprofen 두 머리 포스트 설치 및 craniotomy 수술 후 48 h 한 번 모든 24 h. 로컬 lidocaine 주어질 수 있다 또한 경우에 NSAID 적합 하지 않습니다.
</li>
</ol>3입니다. 새 환경 순응
<ol><li>2 일 (최소), 마 취에서 회복 후 녹음 실에서 머리 고정 상태로 동물 적응. 적어도 5 일 동안 새 환경 순응 세션을 수행 합니다.</li>
	<li>새 환경 순응 세션 동안 사용자 클램프에 고정 머리 게시물 사용 녹음 실에서 동물을 놓습니다. 움직임을 제한 하기 위하여 세션 동안 커버 맞춤 수 지 반 튜브 (그림 1C), 시체 3 차원 프린터를 사용 하 여 만든. 참고: 1 일, 새 환경 순응 세션 5 분 긴를 이어야 한다. 그것은 다음 증가 매일 10, 20, 40, 및 60 분 동안 2, 3, 4, 및 5, 각각.</li>
	<li>각 세션의 끝에, 동물을 음식 보상을 제공 합니다. 동물에 새 환경 순응 기간 동안 지속적으로 투쟁을 하는 경우는 세션을 중지 합니다.</li>
</ol>4입니다. craniotomy
참고: 새 환경 순응, 후 한 craniotomy가 이루어집니다 녹음에 대 한 뇌 영역을 통해. craniotomy 마 취, 머리로 설치 게시물 stereotaxic 프레임에서 수행 됩니다. 사후 작업 절차는 머리 게시물 설치는 동일 합니다.
<ol><li>Craniotomy, 하기 전에 액체 글 루 콘 산 및 70% 알코올 면봉으로 두개골을 청소.</li>
	<li>조심 스럽게 치과 함께 녹음 사이트를 통해 두개골을 다쳤어요. 뼈를 충분히 얇은 되 면 메스의 팁으로 넘어가지 고 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>두개골을 강화 노출 지역의 치과 시멘트를 넣어.</li>
	<li>치과 시멘트 하드 후 실리콘 접착제로 노출 된 뇌 영역을 커버. 수술 후 절차는 2.8 단계에서 설명한 대로.</li>
</ol>5. electrophysiological 기록
<ol><li>동물 electrophysiological 녹화를 수행 하기 전에 craniotomy 후 최소 1 일에 대 한 복구를 허용 합니다. 같은 방법으로 그것을 녹음 시작 될 때 새 환경 순응 세션 동안 한 녹음 실에서 동물을 놓습니다.</li>
	<li>붕 규 산 유리 모 세관에서 유리 펫 만들기 (OD = 1.5 m m, ID = 0.9 m m, 길이 90.0 m m) 전극 끌어당기는 사람에. 그들의 팁 직경은 2-3 µ m 이다, 그리고 그들의 저항에서 4-6 m ω가 때 그들은 10mm PBS로 가득. 전극의 길이 40-50 m m입니다. 일부 녹음에 2% neurobiotin 10 m m PBS에 추가 됩니다.</li>
	<li>주문 품 optrode 홀더를 채워진된 유리 피 펫을 연결 합니다.</li>
	<li>유리 피 펫에 Ag Cl 코팅 실버 와이어 (직경에서 0.2 m m)를 넣어. 실버 와이어를 핀을 통해 얇은 코팅된 전기 와이어를 연결 합니다. 녹음 앰프의 headstage에 핀을 연결 합니다.</li>
	<li>광섬유 패치 코드를 연결 (코어 = 960 µ m, 클 래 딩 1000 µ m, NA = = 0.63) 지 르 코니 아 깃 봉을 가진 (OD = 2.5 m m) optrode 홀더에 소매 짝짓기 분할. 아무의 팁 연락처 유리 피 펫의 뒷면까지 소매에 패치 코드를 밀어. 패치 코드 제공 빛 (파장 = 465 nm) LED에서. LED 빛은 단일 채널 LED 드라이버에 의해 제어 됩니다.</li>
	<li>craniotomy 통해 실리콘 접착제를 제거 합니다. 넣어 예 열된 염 분 (38 ° C) 기록 세션 동안 건조에서 뇌 표면 방지 하기 위해 주기적으로 뇌 표면에. 필요한 경우 날카로운 핀셋으로 경질을 제거 합니다.</li>
	<li>유리 전극 조작자와 뇌 조직에 삽입 합니다. 이 삽입 될 때 전극 저항을 모니터링 합니다. 저항 되는 전극의 팁 손상 될 수 있습니다 때문에 예상 보다 낮은 전극을 교체 합니다. 관심의 깊이에서 검색 하 고 2 ~ 5 µ m 단계에 깊이 조정 하 여 단일 단위 스파이크를 분리 합니다.</li>
	<li>단일 단위 격리 된 후에, LED 빛을 전달 하 고 빛 자극에 응답을 관찰.</li>
	<li>세포 유형의 식별 후 신경 활동을 기록 합니다. 2-3 h에 대 한 녹음을 수행 합니다. 녹음에서 만든 연속 일 (최대 2 일의), 경우 실리콘 접착제 craniotomy 커버. 녹음을 완료 하 고 동물 희생, 머리 게시물을 검색 하 고 세척 하 고 그것을 다시 아세톤에 넣어.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Optogenetics 신경 과학에 강력한 도구가 되고있다. 그것은 특정 신경 통로의 활동을 조작 뿐만 아니라 특정 신경 형식에서을 식별 비보에 이용 되었습니다. 신경 종류의 신경 활동의 명확한 신경 회로의 메커니즘의 이해를 촉진합니다. 여기, 우리는 깨어 VGAT ChR2 쥐의 IC에 유리 전극을 통해 녹음 사이트에 빛을 전달 하는 방법을 설명 했다.
설명 하는 방법을 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 그것은 동물 대상 신경에 있는 opsins의 충분 한 및 특정 식을 사용 하 여 요구입니다. Extracellular 녹음과 빛에 대 한 응답을 식별 하는 opsin 활성화 대상 신경에서 스파이크 끝이 필요 하다. 일부 유전자 변형 종자에 신경에 있는 transgene 식 수준 낮은 젊은 동물14, 그리고 실험에 대 한 최소 연령은 있을 가능 하다. 또한, 그것은 빛 자극에 응답 (예를 들어, imm...

다양 한 종류의 다른 기능을 하는 신경 중추에 의하여 이루어져 있다. 이러한 서로 다른 유형의 신경 신경 회로 내에서 작동 하는 어떻게 신경 과학에서 중요 한 관심사 중 하나입니다. 그러나, 많은 두뇌 지구에서 그것은 되었습니다 하지 몇 가지 예외와 함께 전기 스파이크 신호 자체에 분명 차이가 있기 때문에 전기 활동의 비보에 녹음에 신경 종류를 구별 하는 것. Optogenetics의 최근 발전 돌파구1,2를 만들었습니다. 빛에 민감한 opsin (예를 들어, channelrhodopsin-2) 특정 신경 종류에 표현 하는 유전자 변형 동물을 사용 하 여, 그것은 되었다 vivo에서 녹음3, 에서 효율적으로 신경 종류를 구별할 수 4,,56. 이 동물에 빛에 민감한 opsin와 뉴런 전기 녹음 하는 동안 가벼운 자극을 제공 하 여 흥분 하지만 다른 신경 있습니다. Opsin 양성 신경, 따라서 쉽게 구별 된다 다른 신경 종류에서 빛에 대 한 답변으로.
Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 비-침략 적 방법으로 빛은 종종 뇌의 표면에서 감독. 그러나, 빛의 강도 감소 뇌 조직 속으로, 때문에 두뇌의 표면에서 깊은 두뇌 지구를 자극 하기 어렵다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 마 취 동물에 electrophysiological 실험 자주 수행 되었습니다 몸 움직임 녹음에 잡음을 발생 하기 때문에. 그러나 잘 설명 된 대로, 마 취 신경 응답7,8,,910변경으로 알려져 있다. 따라서, 그것은 깨어 있는 동물을 사용 하 여 마 취의 인공 효과 없이 신경 응답을 공부 하기 위하여 필요가 있다. 마 취 동물 실험, 달리 electrophysiological 녹음 깨어 동물 실험에서 수술에서 회복 후 수행 됩니다. 수술과 기록 사이 간격 동안 조직 exudate 자주 뇌 표면에 축적 하 고 낮은 뇌 표면의 광 투명성을 만든다.
여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 단일 단위 기록 기록 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

<table><tbody><tr><td>전극 홀더</td><td>분자 장치</td><td>1-HL-U</td><td>마이크로 전극 증폭기 용 피펫 홀더</td></tr><tr><td>세라믹 분할 결합 슬리브</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm 페룰</td></tr><tr><td>회로 기판 스페이서</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm 길이</td></tr><tr><td>마우스 용 입체 프레임</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>마우스</td></tr> <tr><td>용 입체 운동 기기매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>수동 매니퓰레이터</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>치과용 접착제 수지 시멘트</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D 프린터</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>저독성 실리콘 접착제</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 길이 90.0 mm</td></tr><tr><td>광섬유 패치 코드</td><td>Doric 렌즈</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>단섬유 패치코드, OD, 2.5mm, 코어 = 960mm, 클래딩 = 1000mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>연결 LED</td><td>Doric 렌즈</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>중심파 길이 = 465nm, 출력 전력 = 45mW(코어 960mm 0.63NA)</td></tr> <tr><td>LED 드라이버</td><td>Doric 렌즈</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1채널 LED 드라이버, 최대 출력 = 1000mA</td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>2단 유리 마이크로피펫 풀러</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>볼로실리케이트 유리 모세관, OD, 1.5mm, ID, 0.9mm, 90.0mm 길이</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., LTD</td><td>185711173</td><td>항생제 연고</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 마우스</td></tr><tr><td>멀티클램프 700B</td><td>분자 장치</td><td>2500-0157</td><td>미세 전극 증폭기</td></tr></tbody></table>

깨어 있는 쥐에 유리 optrode 신경 형식의 optogenetics 식별

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

그것은 어떻게 다른 신경 과학에서 중요 한 관심사 종류 뉴런의 신경 회로에서 작동. Optogenetics의 최근 발전은 광범위 한 뇌 영역에 vivo에서 electrophysiological 실험에서 신경 유형 식별을 활성화 했습니다. Optogenetics 실험, 그것이 기록 사이트에 빛을 전달 하기 위해 중요 합니다. 그러나, 그것은 종종 뇌의 표면에서 깊은 두뇌 영역을 자극 빛을 제공 어렵다입니다. 특히, 그것은 종종 깨어 있는 동물에서 녹음의 경우 뇌 표면의 광 투명성은 낮은, 깊은 두뇌 지역 도달 자극 빛 어렵습니다. 여기, 우리는 주문 품 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 빛을 스파이크 응답 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법에서는, 빛은 안정적으로 깊은 두뇌 지구에서 빛으로 기록 된 신경 자극 수 있도록 녹음 유리 전극을 통해 배달 됩니다. 이 주문 품 optrode 시스템 접근 가능 하 고 저렴 한 재료를 이루어져 있고 조립 하기 쉽습니다.

그림 2, 우리는 팁 크기의 효과 유리 펫 펫 (그림 2A-B)의 끝에 빛 파워에의 길이 검사합니다. 가벼운 힘 1 m m 팁에서 배치 하는 광 파워 미터에 의해 측정 되었다. 팁 크기 전체 길이 변화 때 2.5 µ m 팁 크기 설정 하는 동안, 변화 하는 때 전체 길이 50 ± 2 mm로 설정 되었습니다. 유리 피 펫의 샹 크 8 m m로 설정 되었습니다. 3-5 mW (평균 ± SD;에서 배열 하는 끝에 가벼운 힘 그림 2A: 3.77 ± 0.29 mW, n = 20; 그림 2B: 4.24 ± 0.31 mW, n = 21). 펫의 팁 크기 (그림 2A</st...

이 작품은 optogenetic 단일-단위 맞춤 유리 optrode를 사용 하 여 깨어 마우스에서 안정적으로 녹화를 수행 하는 방법을 소개 합니다.

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

이 방법은 다양한 유형의 뉴런 기능과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 접근 가능한 재료로 생체 내에서 다양한 유형의 뉴런을 안정적으로 식별할 수 있다는 것입니다. 저는 우리 기술자인 Shinji Muramoto와 우리 연구실의 조교수인 Lanlan Ma와 함께 절차를 시연할 것입니다.이 절차를 시작하려면 홀더의 배럴에서 압력 제어를 위해 강철 튜브를 부드럽게 당겨 빼냅니다. 드릴링으로 홀더의 배럴에 있는 핀 시트 쪽의 구멍을 넓힙니다. 그런 다음 구멍에 스테인리스 스틸 파이프를 넣습니다.다음으로, 2.5mm 직경의 페룰을 위한 세라믹 분할 결합 슬리브를 구멍에 삽입합니다. L자형 토끼에 구멍을 뚫고 전극 홀더의 배럴을 에폭시 접착제로 토끼에 부착합니다. 그런 다음 나사로 매니퓰레이터에 부착하십시오.밀링 커터로 기둥형 회로 기판 스페이서를 직육면체 모양으로 만들어 맞춤형 헤드 포스트를 준비하고 톱으로 두 개의 헤드 포스트로 자릅니다. 그런 다음 밀링 커터로 헤드 포스트의 바닥을 평평하게 만듭니다. 수술 전에 오토클레이브로 모든 수술 기구와 헤드 포스트를 소독하십시오.입체성 프레임과 가열 패드를 70% 알코올로 청소합니다. 다음으로, 마우스를 마취하고 가열 패드의 입체 프레임에 놓습니다. 이 실험에서는 채널로돕신-II를 발현하는 억제성 뉴런이 사용되는 형질전환 마우스가 사용됩니다.바이트 바의 구멍에 이빨을 놓고 코 클램프를 가볍게 조입니다. 그런 다음 이어바를 사용하여 머리의 양쪽을 고정합니다. 머리가 이어바에 의해 올바르게 고정되면 코 cl을 조입니다.amp.눈에 안과 연고를 바릅니다. 작은 가위로 머리 위의 머리카락을 자르고 클로르헥시딘 글루코네이트를 섞은 면봉으로 두피를 닦는다. 그런 다음 정중선을 따라 두피를 자르고 옆으로 밀어 넣습니다.알코올 70%를 적신 면봉으로 골막을 제거하고 두개골을 건조시킵니다. 그런 다음 헤드 포스트를 매니퓰레이터에 부착합니다. 매니퓰레이터를 사용하여 브레그마 주위의 두개골에 헤드 포스트를 평평하게 놓습니다.단량체 4방울, 촉매 1방울, 폴리머 작은 숟가락 1개를 냉장고에 차게 한 작은 접시에 섞습니다. 전두골과 두정골에 치과용 시멘트를 바르고 헤드 포스트를 두개골에 고정합니다. 치과용 시멘트가 굳은 후 입체 액자에서 마우스를 제거합니다.노출된 피부에 항생제 연고를 바르고 메데토미딘 길항제와 항생제의 칵테일을 주사합니다. 그런 다음 깨어날 때까지 케이지의 열 패드에 마우스를 놓고 농축이 있는 하우징 케이지로 되돌립니다. 기록을 위해 표적 뇌 부위에 개두술을 시행하려면 클로르헥시딘 글루코네이트와 70% 알코올을 적신 면봉으로 두개골을 청소합니다.치과용 드릴로 기록 부위의 두개골을 조심스럽게 긁어냅니다. 뼈가 충분히 얇아지면 메스 끝으로 잘라 제거합니다. 그런 다음 두개골을 강화하기 위해 노출된 부위 주위에 치과용 시멘트를 바르십시오.치과 시멘트가 굳은 후 노출된 뇌 부위를 실리콘 접착제로 덮습니다. 그런 다음 동물이 깨어날 때까지 케이지의 열 패드에 동물을 놓고 케이지로 되돌립니다. 전기생리학적 기록을 수행하기 전에 개두술 후 최소 하루 동안 동물이 회복할 때까지 기다립니다.전기 생리학적 기록을 수행하기 전에 전극 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 유리 피펫을 만듭니다. 피펫에 10밀리몰 PBS를 채웁니다. 일부 기록에서는 10밀리몰 PBS에 2%의 뉴로비오틴이 첨가됩니다.다음으로, 동물을 녹음실에 넣습니다. 채워진 유리 피펫을 맞춤형 옵트로드 홀더에 부착합니다. 염화은으로 코팅된 와이어를 유리 피펫에 삽입합니다.그런 다음 핀을 헤드 스테이지에 연결합니다.tage 녹음 앰프. 그런 다음 지르코니아 페룰이 있는 광섬유 패치 코드를 옵트로드 홀더의 분할 결합 슬리브에 연결합니다. 페룰의 끝이 유리 피펫 뒷면에 닿을 때까지 패치 코드를 슬리브에 밀어 넣습니다.패치 코드는 단일 채널 LED 드라이버에 의해 제어되는 LED에서 빛을 전달합니다. 그런 다음 개두술 위의 실리콘 접착제를 제거합니다. 녹음 세션 동안 뇌 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 주기적으로 뇌 표면에 따뜻한 식염수를 바르십시오.필요한 경우 날카로운 핀셋으로 경막을 제거합니다. 여기서, 스파이크 반응은 깨어 있는 VGAT 채널로돕신-II 마우스의 하구(inferior colliculus)에서 기록되었습니다. VGAT 채널로돕신-II 마우스의 하구(inferior colliculus)에서 GABAergic 뉴런은 특이적으로 채널로돕신-II를 발현합니다.깨어 있는 쥐에서 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런은 모두 가벼운 자극을 받았을 때 각각 흥분되거나 억제되었습니다. 빛의 자극이 유리 전극을 통해 전달될 때, 그것은 일부 뉴런에서 스파이크 반응을 불러일으켰다. 대조적으로, 다른 뉴런에서는 빛의 자극이 소리 자극에 의해 유발되는 스파이크 반응을 억제했습니다.이러한 결과는 유리 옵트로드가 잘 분리된 단일 단위 활성을 기록하고 기록된 뉴런을 빛에 의해 안정적으로 자극할 수 있음을 보여줍니다. 개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 다양한 뇌 영역의 신경 소켓에서 다양한 유형의 뉴런이 어떻게 작동하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

출처: Kodani, S., et.al. 마우스의 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학적 조작. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 생쥐의 수면에서 각성으로의 전환에 관여하는 신경 회로의 광유전학적 조작을 보여줍니다. 이 절차에는 광섬유와 전극을 뇌와 근육에 외과적으로 이식하여 빛 자극과 전기생리학적 기록을 가능하게 하는 것이 포함됩니다. 말단 줄조선(BNST)의 침대 핵에서 빛에 민감한 양이온 채널을 활성화하기 위해 빛을 전달함으로써 신경 활동이 조절되어 연구자들은 각성 유도와 관련된 뇌 및 근육 신호를 분석할 수 있습니다.

마우스의 수면에서 각성으로의 전환을 위한 신경 회로의 광유전학적 조작

이 비디오는 형질전환 마우스의 광학 창을 통해 뇌의 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 쥐는 신경 활동을 감지할 수 있는 형광 단백질을 발현합니다. 두개골의 작은 부분을 조심스럽게 제거하여 광학 창을 설치하고, 두개골을 검은색 시멘트로 덮어 이미징 전에 빛을 차단합니다.

신경 활동을 이미지화하기 위해 형질전환 마우스의 뇌에 광학 창 설치

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

우리는 시험관 내에서 신경 세포 집단을 광자극하기 위해 광유전학적 접근 방식을 사용하여 전뇌 회로의 기능적 지형 및 시냅스 특성을 특성화하는 방법을 설명합니다.

광유전학적으로 표적화된 전뇌 회로의 레이저 스캐닝 광자극

광유전학은 행동 신경과학 실험에 사용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다. 이 프로토콜은 레이저 시스템의 설계 및 설정에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 대부분의 설치류 행동 테스트 패러다임과 호환되는 다중 및 동시 생체 내 광유전학적 자극을 수행하기 위한 전체 프로토콜을 제공합니다.

설치류 중추 신경계의 생체 Optogenetic 자극

여기에서는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 설명합니다. ChR2를 발현하는 뉴런은 청색광에 대한 반응으로 식별됩니다. 이 방법은 표준 세포 외 기록 장비를 사용하며 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 저렴한 대안으로 사용됩니다.

에 가이드 생체 단일 단위 기록

여기에서, 우리는 마우스에 있는 잠/각성 상태의 감시 도중 뉴런의 특정 모형의 광유전학 조작의 방법을 기술합니다, 예를 들면 stria 말단의 침대 핵에 우리의 최근 일을 제시하.

마우스에서 수면/각성 상태를 모니터링하는 동안 신경 회로의 광유전학 적 조작

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

여기에서는 광 전달을위한 광섬유와 신경 기록을위한 전극 어레이가있는 옵트로드 시스템의 제조 방법을 제시합니다. 채널로돕신-2를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 이용한 생체내 실험은 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록을 동시에 위한 시스템의 실현가능성을 보여준다.

동시 광유전학적 변조 및 전기 신경 기록을 위한 광섬유 어레이

배우세요 유리 Optrode를 이용한 깨어 있는 쥐의 단일 신경 단위 광유전학 기록 기법으로 GABAerg성 및 글루타메이트성 뉴런을 식별하는 방법입니다. 이 기술은 비용 효율적인 재료로 신경 회로를 연구하는 데 활용됩니다.

깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

더 많은 동영상 탐색