깨어 있는 쥐에 유리 Optrode 신경 형식의 Optogenetics 식별

이 방법은 다양한 유형의 뉴런 기능과 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴하고 접근 가능한 재료로 생체 내에서 다양한 유형의 뉴런을 안정적으로 식별할 수 있다는 것입니다. 저는 우리 기술자인 Shinji Muramoto와 우리 연구실의 조교수인 Lanlan Ma와 함께 절차를 시연할 것입니다.

이 절차를 시작하려면 홀더의 배럴에서 압력 제어를 위해 강철 튜브를 부드럽게 당겨 빼냅니다. 드릴링으로 홀더의 배럴에 있는 핀 시트 쪽의 구멍을 넓힙니다. 그런 다음 구멍에 스테인리스 스틸 파이프를 넣습니다.

다음으로, 2.5mm 직경의 페룰을 위한 세라믹 분할 결합 슬리브를 구멍에 삽입합니다. L자형 토끼에 구멍을 뚫고 전극 홀더의 배럴을 에폭시 접착제로 토끼에 부착합니다. 그런 다음 나사로 매니퓰레이터에 부착하십시오.

밀링 커터로 기둥형 회로 기판 스페이서를 직육면체 모양으로 만들어 맞춤형 헤드 포스트를 준비하고 톱으로 두 개의 헤드 포스트로 자릅니다. 그런 다음 밀링 커터로 헤드 포스트의 바닥을 평평하게 만듭니다. 수술 전에 오토클레이브로 모든 수술 기구와 헤드 포스트를 소독하십시오.

입체성 프레임과 가열 패드를 70% 알코올로 청소합니다. 다음으로, 마우스를 마취하고 가열 패드의 입체 프레임에 놓습니다. 이 실험에서는 채널로돕신-II를 발현하는 억제성 뉴런이 사용되는 형질전환 마우스가 사용됩니다.

바이트 바의 구멍에 이빨을 놓고 코 클램프를 가볍게 조입니다. 그런 다음 이어바를 사용하여 머리의 양쪽을 고정합니다. 머리가 이어바에 의해 올바르게 고정되면 코 cl을 조입니다.amp.

연고를 바릅니다. 작은 가위로 머리 위의 머리카락을 자르고 클로르헥시딘 글루코네이트를 섞은 면봉으로 두피를 닦는다. 그런 다음 정중선을 따라 두피를 자르고 옆으로 밀어 넣습니다.

알코올 70%를 적신 면봉으로 골막을 제거하고 두개골을 건조시킵니다. 그런 다음 헤드 포스트를 매니퓰레이터에 부착합니다. 매니퓰레이터를 사용하여 브레그마 주위의 두개골에 헤드 포스트를 평평하게 놓습니다.

단량체 4방울, 촉매 1방울, 폴리머 작은 숟가락 1개를 냉장고에 차게 한 작은 접시에 섞습니다. 전두골과 두정골에 치과용 시멘트를 바르고 헤드 포스트를 두개골에 고정합니다. 치과용 시멘트가 굳은 후 입체 액자에서 마우스를 제거합니다.

노출된 피부에 항생제 연고를 바르고 메데토미딘 길항제와 항생제의 칵테일을 주사합니다. 그런 다음 깨어날 때까지 케이지의 열 패드에 마우스를 놓고 농축이 있는 하우징 케이지로 되돌립니다. 기록을 위해 표적 뇌 부위에 개두술을 시행하려면 클로르헥시딘 글루코네이트와 70% 알코올을 적신 면봉으로 두개골을 청소합니다.

치과용 드릴로 기록 부위의 두개골을 조심스럽게 긁어냅니다. 뼈가 충분히 얇아지면 메스 끝으로 잘라 제거합니다. 그런 다음 두개골을 강화하기 위해 노출된 부위 주위에 치과용 시멘트를 바르십시오.

치과 시멘트가 굳은 후 노출된 뇌 부위를 실리콘 접착제로 덮습니다. 그런 다음 동물이 깨어날 때까지 케이지의 열 패드에 동물을 놓고 케이지로 되돌립니다. 전기생리학적 기록을 수행하기 전에 개두술 후 최소 하루 동안 동물이 회복할 때까지 기다립니다.

전기 생리학적 기록을 수행하기 전에 전극 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 유리 피펫을 만듭니다. 피펫에 10밀리몰 PBS를 채웁니다. 일부 기록에서는 10밀리몰 PBS에 2%의 뉴로비오틴이 첨가됩니다.

다음으로, 동물을 녹음실에 넣습니다. 채워진 유리 피펫을 맞춤형 옵트로드 홀더에 부착합니다. 염화은으로 코팅된 와이어를 유리 피펫에 삽입합니다.

그런 다음 핀을 헤드 스테이지에 연결합니다.tage 녹음 앰프. 그런 다음 지르코니아 페룰이 있는 광섬유 패치 코드를 옵트로드 홀더의 분할 결합 슬리브에 연결합니다. 페룰의 끝이 유리 피펫 뒷면에 닿을 때까지 패치 코드를 슬리브에 밀어 넣습니다.

패치 코드는 단일 채널 LED 드라이버에 의해 제어되는 LED에서 빛을 전달합니다. 그런 다음 개두술 위의 실리콘 접착제를 제거합니다. 녹음 세션 동안 뇌 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 주기적으로 뇌 표면에 따뜻한 식염수를 바르십시오.

필요한 경우 날카로운 핀셋으로 경막을 제거합니다. 여기서, 스파이크 반응은 깨어 있는 VGAT 채널로돕신-II 마우스의 하구(inferior colliculus)에서 기록되었습니다. VGAT 채널로돕신-II 마우스의 하구(inferior colliculus)에서 GABAergic 뉴런은 특이적으로 채널로돕신-II를 발현합니다.

깨어 있는 쥐에서 GABAergic 및 glutamatergic 뉴런은 모두 가벼운 자극을 받았을 때 각각 흥분되거나 억제되었습니다. 빛의 자극이 유리 전극을 통해 전달될 때, 그것은 일부 뉴런에서 스파이크 반응을 불러일으켰다. 대조적으로, 다른 뉴런에서는 빛의 자극이 소리 자극에 의해 유발되는 스파이크 반응을 억제했습니다.

이러한 결과는 유리 옵트로드가 잘 분리된 단일 단위 활성을 기록하고 기록된 뉴런을 빛에 의해 안정적으로 자극할 수 있음을 보여줍니다. 개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 다양한 뇌 영역의 신경 소켓에서 다양한 유형의 뉴런이 어떻게 작동하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.