Name: 유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 인간 섬유아세포에서 세포 노화를 유도하고 검증하는 방법을. 이 프로토콜은 노화와 암 연구에서 재현성 높은 결과를 제공하며 특수 장비가 필요 없습니다.

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우리는 유익한 토론에 대 한 관리자 실험실 및 데이터와 UV-유도 노화에 프로토콜을 공유 하기 위한 Thijmen 밴 Vliet의 회원을 감사 합니다.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
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<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
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<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

여기 설명 하는 프로토콜은 인간의 기본 섬유 아 세포, 최적화 된 특히 BJ와 WI-38 셀. 일차 노화, 전리 방사선, 독 소 루비에 대 한 프로토콜을 성공적으로 다른 세포 유형 즉 신생아 melanocytes와 keratinocytes (iPSC 파생 cardiomyocytes)과 섬유 아 세포 (HCA2 및 IMR90)의 다른 종류에 적용 우리의 실험실. 그러나, 몇 가지 세부 사항을 시드 셀, 방법 및 플라스틱 지원에 연결/분리에 대 한 셀 수 있도록 화학 물질의 수 등의 독성을 피하기 위해 치료 복용량을 조정 하 여 추가 셀 형식에 대 한 적응을 최적화할 수 있습니다.
기본 섬유 아 세포의 사용에도 다양 한 도전 포즈. 노화 세포는 일반적으로 더 어려운 proliferating 들 보다 분리 하 고 그들은 종종 trypsinization에 더 민감한 또는 분리 메서드를 분리 후 생존의 것 보다 약간 낮은 의미의 다른 종류 확산 셀입니다. 다른 노화 유도 하는 방법에 대 ...

1961 년, Hayflick와 무어 헤드 문화에 기본 fibroblasts 연속 구절1후 그들의 증식 잠재력을 잃고 보고. 이 프로세스는 각 세포 분열 후 telomeres의 순차 단축에 의해 발생 합니다. Telomeres 비판적으로 짧은 길이 도달, 그들은 활성화 확산의 돌이킬 수 없는 체포 하는 DNA 손상 응답 (DDR)에 의해 인식 됩니다-또한 일차 노 쇠로 정의. 일차 노화 현재 구분 mitogens와 apoptotic 신호2,3셀을 렌더링 하는 영구 세포 주기 검거의 상태를 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 많은 자극 중 하나입니다. 노화 프로그램은 일반적으로 높은 lysosomal 활동, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 핵 변화, chromatin 재배열, 바인딩과 그물 스트레스, DNA 손상 및 노화 관련을 포함 하 여 추가 기능 특징 분 비 형 (SASP)3,4. 노화 세포는 신체에 여러 기능을가지고: 개발, 상처 치유 및 종양 억제2. 똑같이, 그들은 노화와, 역설적으로, 종양 진행5에서 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 노화의 부정, 그리고 부분적으로 모순 된 효과 종종 SASP6에 기인 된다.
최근에, 그것은 생쥐에서 노화 세포의 수명 연장 하 고 노화 기능7,,89,10,11, 의 많은 것의 제거에 지도 표시 했다 12. 같은 방식으로, 여러 약물 개발 되었습니다 하거나 노화 세포 (senolytics)를 제거 하거나 대상 SASP13,14. 안티 에이징 치료 잠재력 최근 분야에 더 많은 관심을 모으고 있다.
세포 노화에 관련 된 메커니즘의 연구 그리고 약리학 내정간섭에 대 한 검 진 무 겁 게 비보 전 모델, 특히 인간의 기본 fibroblasts에 의존. 노화 표현 형에 있는 큰 가변성 관찰 이며 셀 유형, 자극 및 시간 포인트3,15, 등 다양 한 요인에 따라 다양 한 노화 inducers에 의해 활성화 하는 몇 가지 일반적인 기능을 확인 하 고는, 16,17. 공부 및 노화 세포를 대상으로 고려 하는 것이 필수적입니다. 따라서,이 프로토콜 일련의 다른 치료를 사용 하 여 기본 섬유 아 세포에서 노화를 유도 하는 데 사용 하는 메서드를 제공 하는 것을 목표로. 로 설명 될 것입니다 방법을 쉽게 다른 셀 형식에 적용할 수 있습니다.
일차 노화 외에도 다른 5 노화 유도 치료 설명: 이온화 방사선, 자외선 (UV) 방사선, 독 소 루비, 산화 긴장 및 epigenetic 변화 (즉 histone acetylation 또는 DNA demethylation의 진흥) . 둘 다, 이온화 방사선 및 자외선 직접적인 DNA 손상 그리고, 적절 한 복용량에 트리거 노화18,19. 독 소 루비 또한 DNA 손상을 통해 주로 노화 DNA로 intercalating 하 여 원인과 topoisomerase II 기능을 방해 하 고 따라서 중단 DNA 수리 메커니즘20. 노화에 대 한 필수적인 유전자의 표현은 일반적으로 histone acetylation와 DNA 메 틸 화에 의해 제어 됩니다. 결과적으로, DNA demethylating (예를 들어, 5-아 자) 에이전트 및 히스톤 deacetylase 억제제 (예를 들면, 나트륨 낙 산 염 및 사 하) 그렇지 않으면 정상 세포21,22노화를 트리거합니다.
마지막으로, 노화 세포에 관련 된 가장 일반적인 마커의 4 설명 될 것 이다:는 노화 관련-β-galactosidase (SA-β-gal) 듀 합동 분석 결과, 세포 주기 규칙의 overexpression에 의해 DNA 종합의 비율의 활동 및  종속 kinase 억제제 p16, p21, 및 overexpression 멤버는 SASP의 분 비

<table><tbody><tr><td>DMEM 매체 - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>하이클론</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (P/s; 10,000 U/ml)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제 무함유 정제수(DEPC 처리되지 않음)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 솔루션</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 15mL 원심분리기 튜브</td><td>: Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td>, <td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr>, <tr><td>24웰 플레이트</td>, <td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr>, <tr><td>13mm 원형 커버슬립,</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr>, <tr><td>Steriflip</td>, <td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cesium137-source</td><td></td><td></td><td>, IBL 637, Cesium-137&gamma;-ray machine</td></tr><tr><td>UV 방사선 챔버</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&ouml; bel BS-02</td></tr><tr><td>독소루비신 디하이드로클로라이드&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoxycytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 부티레이트&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>시트르산 일수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 이염기성 인산</td><td>염 Acros 유기물</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 페로시아나이드&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>페리시안화칼</td><td>륨 Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% 글루타르알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% 포름알데히드(w/v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU(5-에티닐-2'-데옥시우리딘)</td><td>루미프로브</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>설포-시아닌3 아지드(설포-Cy3-아지드)</td><td>루미프로브</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>구리(II) 황산염 5수화물(Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros 유기물</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 기반</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, 화이트&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 밀봉 호일&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast 프로브 Lo-ROX 키트&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL 프로브 라이브러리</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카운팅 슬라이드</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>건식 인큐베이터</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' 실험실 필름</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>핀셋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

세포 노화의 영구 세포 주기 검거 다른 손상 자극에 반응에서 활성화 상태입니다. 세포 노화의 활성화는 다양 한 병 태 생리 조건 종양 억제, 조직 리 모델링 및 노화 등의 특징입니다. Vivo에서 세포 노화의 inducers는 아직도 가난 하 게 특징 이다. 그러나, 자극의 수 ex vivo세포 노화 촉진 사용할 수 있습니다. 그 중 가장 일반적인 노화-inducers 일차 피로, 이온화 및 비 이온화 방사선, 차적인 약물, 산화 스트레스, 그리고 demethylating와 acetylating 대리인 있습니다. 여기, 우리가 노화에 섬유 아 세포를 유도 하는 것이 자극을 사용 하는 방법에 자세한 지침을 제공 합니다. 이 프로토콜은 쉽게 1 차 셀 및 셀 라인, 암 세포를 포함 하 여 다른 유형의 적용할 수 있습니다. 우리는 또한 노화 유도의 유효성 검사를 위해 다른 방법을 설명합니다. 특히, 우리는 lysosomal 효소 노화 관련 된 β-galactosidase (SA-β-gal), 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (듀) 합동 분석 결과, 세포 주기 식의 레벨을 사용 하 여 DNA 합성의 속도의 활동을 측정에 초점 억제제 p16, p21, 식 그리고의 Senescence-Associated 분 비 형 (SASP)의 분 비. 마지막으로, 우리 예제에서는 결과 제공 하 고 이러한 프로토콜의 응용 프로그램을 추가 논의.

SA-β-gal 노화 섬유 아 세포에서 얼룩의 농축
Β-galactosidase (β-gal)는 모든 세포에 표현 되 고 4.025,26의 최적 pH는 lysosomal 효소 이다. 그러나, 노화, 동안 리소좀 크기가 증가 하 고, 따라서, 노화 세포 축적 β-gal. 이 효소의 증가 금액 차선 pH 6.025,27에서도 그 활동 감지를 가능 하 게. 그림 1A 대 노화 기본 섬유 아 세포 확산에 SA-β-gal 얼룩의 대표 이미지를 보여줍니다. 세포는 또한 확대 하 고 불규칙 한 셀 시체와 함께 보세요. 앞...

여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

이 방법은 세포 노화를 유도하기 위한 일반적인 기술을 수행하는 방법 및 노화 표현형을 평가하는 방법과 같은 노화 및 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 따라하기 쉽고, 재현성이 높고, 특별하거나 값비싼 장비가 필요하지 않으며, 세포 집단의 최소 50%에서 노화를 유도한다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Alejandra Hernandez-Segura입니다.먼저 10ml의 D10을 함유한 T75 플라스크에 개체군 배가 낮거나 PD가 낮은 5번째 생존 가능한 1차 섬유아세포를 10배로 7번 파종합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소와 5%의 산소로 밤새 세포를 배양합니다. 11 마이크로 리터의 1, 000X 독소루비신 원액을 11 밀리리터의 D10에 250 나노 몰의 최종 농도로 희석합니다.그런 다음 세포에서 배지를 흡인하고 10ml의 D10과 독소루비신으로 교체합니다. 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 정확히 24시간 동안 5%의 이산화탄소와 5%의 산소로 세포를 배양합니다. 그런 다음 배지를 흡인하고 10ml의 D10을 사용하여 세포를 조심스럽게 한 번 씻습니다.10ml의 D10에 세포를 6일 더 배양하고 약 3일마다 배지를 정기적으로 교체합니다. 베타-갈락토시다아제 염색을 수행하기 위해, 각 샘플 시드에 대해 500마이크로리터의 D10을 포함하는 24웰 플레이트의 적어도 하나의 웰에서 네 번째 세포에 대해 10배씩 세포가 희박하도록 합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 5%의 산소로 밤새 세포를 배양합니다.다음 날, 500마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 PBS에 2%포름알데히드와 0.2%글루타르알데히드를 웰당 500마이크로리터씩 첨가하고 세포를 실온에서 3-5분 동안 배양하여 고정합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.다음으로, 새로운 염색 용액을 준비한 후 웰당 500마이크로리터를 추가하고 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하여 결정이 형성될 수 있는 증발을 방지합니다. 섭씨 37도의 어두운 곳에서 이산화탄소가 없는 건식 인큐베이터에서 12-16시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 500마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.일반 광학 현미경으로 세포를 확인하여 양성 세포가 파란색 준핵 염색과 함께 나타나는 결과를 평가합니다. 개별 세포의 시각화 및 정량화를 용이하게 하려면 DAPI를 카운터 스테인으로 사용하십시오. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 동일한 샘플의 여러 사진을 촬영하여 총 세포 수 대비 양성 세포의 비율을 측정하여 최소 100개의 단일 세포를 평가합니다.각 샘플 또는 조건에 대해 웰당 하나의 커버슬립을 24웰 플레이트에 넣습니다. 웰당 500마이크로리터의 D10을 사용하여 네 번째 세포에 10을 10번 파종하여 세포가 희박해지도록 합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 5%의 산소로 밤새 세포를 배양합니다.각 샘플이 250마이크로리터를 받을 수 있도록 20마이크로몰 EdU 용액과 D10을 충분히 준비합니다. 처리 중인 각 웰에서 배지의 절반을 제거하고 EdU D10 용액으로 교체합니다. 최종 EdU 농도는 10마이크로몰입니다.섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소와 5%의 산소로 샘플을 18-24시간 동안 배양합니다. 대조 세포와 노화 세포에 대해 동일한 배양 시간을 사용합니다. 배양 후 500마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다.그런 다음 PBS에 500마이크로리터의 4%포름알데히드를 첨가하고 세포를 10분 동안 배양하여 고정시킵니다. 고정 후 500마이크로리터의 100밀리몰 Tris pH 7.6을 샘플에 추가하고 5분 동안 배양합니다. 다음으로, PBS에 있는 0.1%Triton X-100 500마이크로리터를 세포에 첨가하고 10분 동안 투과시킵니다.그런 다음 PBS를 사용하여 샘플을 세 번 세척합니다. 각 커버슬립에 대해 50마이크로리터의 라벨 믹스를 준비하고, PBS 44.45마이크로리터, 황산구리(II)0.5마이크로리터, 설포-cy3-아지드 0.05마이크로리터, 아스코르브산나트륨 5마이크로리터의 순서로 성분을 추가합니다. 피펫 : 50 마이크로 리터의 라벨이 파라 필름 조각에 혼합되어 있습니다.그런 다음 핀셋과 바늘을 사용하여 커버슬립을 들어 올리고 라벨 믹스 위에 셀 면이 아래로 향하게 놓습니다. 기포가 없고 커버슬립의 전체 표면이 라벨 믹스에 닿는지 확인하십시오. 어두운 곳에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.세포를 24웰 플레이트의 웰에 다시 넣고 PBS를 사용하여 세 번 세척합니다. 그런 다음 DAPI와 함께 장착 매체를 사용하여 샘플을 장착하고 밤새 건조시킵니다. 우선, 개체군 2배가 낮은 5번째 실행 가능한 1차 섬유아세포에 10배의 7번 시드를 뿌리거나.조건당 최소 100개의 셀을 이미지화합니다. 마지막으로 다음 공식을 사용하여 EdU를 통합한 세포의 백분율을 정량화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 유전자 및 단백질 발현 연구를 수행합니다.여기에 표시된 것은 증식 대 노화 원발성 섬유아세포에서 SA-beta-gal 염색의 대표적인 이미지입니다. 노화 세포는 일반 세포체 내에서 확대된 것처럼 보입니다. 앞서 언급했듯이 개별 세포를 구별하기 어려울 수 있습니다.따라서 DAOP와 함께 염색하면 시각화 및 세포 계수가 용이합니다. 이 실험에서는 suflo-cy3-azide를 사용하여 집단에 구리 촉매 아지드-알킨 순환첨가를 수행했습니다. 아지드와 알킨의 결합이 발생한 경우, 세포는 증식 세포와 비증식 세포를 구별하는 cy3 필터 아래에서 형광을 표시합니다.이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 36시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 산소 농도의 진동이 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 인큐베이터 외부의 세포를 취급하는 동안 가능한 한 빨리 해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 사이토카인 어레이 또는 웨스턴 블롯과 같은 다른 방법을 수행하여 분비되는 단백질의 수준 또는 특정 신호 전달 경로 이해와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 노화 및 암 분야의 연구자들이 노화 세포가 포유류의 생리학적 및 병리학적 상태에 어떻게 관여하는지 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 일차 세포에서 노화를 재현성 있게 유도하는 방법과 노화 상태를 평가하는 방법에 대해 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

이 프로토콜은 인간 지방 조직에서 분리된 기질 혈관 분획에서 노화 관련 베타-갈락토시다제(SA-β-gal) 활성을 객관적이고 단일 세포로 검출하기 위한 반사광 공초점 현미경을 제시합니다. 이 방법은 면역세포화학과 호환되며, 정량 평가를 위한 pH 조절을 포함하고, 기존의 SA-β-갤 염색보다 더 민감하고 주관적인 대안을 제공합니다.

지방 기질 혈관 분율에서 반사광을 이용한 노화 검출

tBHP를 이용한 HNM 조기 노화 유도 표준화 프로토콜, 성장 정지, SA-β-갈락토시다제 활성, SASP 인자 등 주요 노화 지표 분석의 표준화 프로토콜.

테르트-부틸 하이드로퍼옥사이드를 이용한 스트레스 유발 조기 노화 유도 프로토콜

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

배우세요 인간 섬유아세포에서 세포 노화를 유도하고 검증하는 방법을. 이 프로토콜은 노화와 암 연구에서 재현성 높은 결과를 제공하며 특수 장비가 필요 없습니다.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

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