Name: 전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활성을 감지하여 유전자 발현을 추적하는 방법입니다. 이 기술은 발생생물학 연구에서 높은 감도와 직접적인 가시화를 제공하여 발달 과정의 유전자 기능을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대 한 Histopathological 서비스 센트 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)에 감사 하 고 싶습니다. 지원 우리의 프로젝트 및 원고 그녀의 중요 한 독서에 대 한 우리는 또한 친절 하 게 제공 Mt4 mmpLacZ 마우스, 박사 전 部와 박사 엘리샤 G. 아로요를 감사. 피터 Bonney이이 문서를 교정 하는 것을 감사 하 길. 이 이는 그랜트 (# 2017UEM01) C.S.C.에 게 수 여에 의하여 대학 Europea 마드리드에 의해 지원 되었다

모든 실험 절차는 최소한의 동물의 고통을 CNIC (센트로 나시오날 드 Investigaciones Cardiovasculares)과 지방의 Autónoma 드 마드리드의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. (E12.5에 E8.5)에서 임신 쥐에서 배아의 수집
<ol><li>자 궁 경관 탈 구 또는 CO2 흡입에 의해 임신 쥐를 희생. 첫 번째의 하루 질 플러그 배아 여겨졌다 관찰 하루 0.5 (E0.5).</li>
	<li>흡수 성 패드에 부정사 위치에 동물을 70% 에탄올과 마우스의 복 부 피부를 청소. 참고: 무 균 다음 단계에는 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>꼬 집 고 마우스 이빨 집게를 사용 하 여 복 부 피부.</li>
	<li>피부와 복 부 벽, 수술가 위를 사용 하 여 복 부의 중간에 걸쳐 수직으로 2 ~ 4 cm을 통해 절 개를 확인 합니다.</li>
	<li>복 부를 노출 하 고 수술가 위는 자 궁의 안쪽 곡률에 따라 혈관 절단 집게 어머니 로부터 자 궁 뿔 제거.</li>
	<li>배아의 문자열을 제거 하 고 10 mL 차가운 0.01 M 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.4 (PBS)를 포함 하는 얼음의 페 트리 접시 전송.</li>
	<li>신중 하 게 10 mL 신선한 얼음 처럼 차가운 PBS와 페 트리 접시에 stereomicroscope 아래 자 궁에서 밖으로 태아를 해 부. 다음 동봉 된 배아와 노 른 자 sac는 집게의 팁을 사용 하 여 제거 하는 양수 막 눈물을 양수 골목, 노출 시계 집게와 근육 벽을 잡고.</li>
	<li>(E12.5에 E8.5)에서 초기 단계에서 littermate 배아 임신 쥐에서 수집 (그림 2).</li>
	<li>10 mL 감기 1 x PBS 곡선된 겸 자 사용 하 여 신선한 요리에 배아를 전송 하거나, 매우 작은 태아 (E8.5-E9.5)를 사용 하 여 플라스틱 전송 펫 태아 손상 없이 샘플을 수집.</li>
	<li>시작 하기 전에 고정, 태아의 작은 조각을 절단 또는 시계 셉 (E9.5에 E8.5)에서 가장 작은 태아에서 양수 막 복용 배아 샘플 유전형 microcentrifuge 튜브에 걸릴. 참고: LacZ 유전형 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 뇌관에 의해 결정 됩니다: 앞으로, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; 반대로, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.</li>
</ol>2입니다. 마우스 배아의 고정
<ol><li>1 mL 1 x PBS를 포함 하는 둥근된 기지와 2 mL microcentrifuge 튜브에 각 배아를 전송. 참고: 회전 통을 사용 하 여 동요와이 튜브에 프로토콜에서 모든 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>나머지 혈액을 제거 하기 위해 실내 온도에서 1 분 동안 1 x PBS에 배아를 씻어. 튜브에 액체를 변경 하려면 사용 플라스틱 전송 펫.</li>
	<li>얼음에 0.125% 글의 1 mL에 태아를 수정. 참고: 고정 시간 태아의 크기에 따라 달라 집니다: E8.5 E9.5 배아, E10.5 배아 및 E12.5 배아에 대 한 1 시간 30 분에 대 일 분.</li>
	<li>정착 액을 제거 하 고 X-여자 얼룩에 대 한 샘플을 처리 하기 전에 실 온에서 10 분 동안 두 번 1 x PBS에 배아를 세척.</li>
</ol>3. 전체 산 β-galactosidase Histochemistry 마우스 배아의
<ol><li>준비 X Gal 린스 버퍼와 절차를 시작 하기 전에 X Gal 얼룩이 솔루션 ( 표 1 및 재료의 표참조). 야생-타입 (WT) littermate 배아를 사용 하 여 효소 반응에 대 한 부정적인 컨트롤.</li>
	<li>(그림 2) 실 온에서 10 분 X Gal 린스 버퍼에 태아를 품 어.</li>
	<li>빛에서 보호 하는 37 ° C에서 하룻밤에 2 h에서 X Gal 얼룩이 솔루션에 태아를 품 어. 블루 얼룩의 충분 한 강도 태아에서 배경 없이 관찰 될 때까지 색상 반응 해 현미경을 통해 정기적으로 모니터링 합니다. 8과 동안을 줄이기 위해 배경 전체 얼룩 9 사이의 솔루션의 산도 유지. 얼룩 솔루션 빛을 시작, 신선한 기판 솔루션 효소 반응 확장을 교체.</li>
	<li>원하는 신호는 각각 실 온에서 10 분에 대 한 두 번 1 mL 1 x PBS 가진 microcentrifuge 관에서 배아를 세척 하 여 얻어진 반응 중지.</li>
	<li>4 ° c.에 하룻밤 1 h 1 mL 4 %paraformaldehyde (PFA) 다시 들을 수정, 스테인드 배아 전송 참고: 배아는 4%에 저장할 수 있습니다 PFA/PBS 4 ° C에서 더 긴 시간에 대 한 단면에 대 한 즉시 처리 될 수 있습니다. 이 마지막 정착 단계 얼룩 패턴의 장기 보존을 위해 결정적 이다.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 두 번 1 mL 1 x PBS에 배아를 씻어.</li>
	<li>옵션 1: 일련의 글리세롤 (1 x PBS에 20%, 40%, 60% 및 80% 글리세롤) 각 솔루션에 실 온에서 1 h의 농도 증가 함께 해결책에 있는 침수에 의해 태아를 선택을 취소 합니다. 참고: 긴 시간 동안 80% 글리세롤에 배아를 세척도 일 때까지 그들은, 삭제 하 고이 단계 (그림 2)에서 4 ° C에서 80% 글리세롤에 그들을 저장. 글리세롤 또는 1 x 4 ° C에서 저장 된 배아에 아메리카의 나트륨 아 지 드 오 라 크리스탈의 아주 작은 금액을 추가 PBS 형 성장을 방지 하기 위해 좋습니다. 개간, 후 전체 마운트 배아 (4 단계) 촬영을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>옵션 2: 파라핀 포함 하 고 톰 (그림 2)를 사용 하 여 단면에 대 한 배아를 처리 합니다. (4, 5 단계)를 구분 하기 전에 전체 스테인드 배아에 식 패턴을 문서화 합니다.</li>
</ol>4입니다. 전체 산 태아의 사진
<ol><li>전체 산 단면 전에 태아를 얼룩이 사진, 페 트리 접시의 기초와 준비에 그들을 전송 1 x PBS에서 1-2 %agarose 경화.</li>
	<li>완전히 탈수 및 액체를 통해 촬영 하는 동안 반사 방지 하기 위해 agarose 코팅 요리에 10 mL 1 x PBS 가진 배아를 커버.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 1 x PBS에 배아 찾으시는 오래 된 배아 (E10.5-E12.5), 배치 하 고 다른 각도에서 그것에서 견본을 위치 하 고 동안을 피하기 위해는 부동성 사진 집게와는 agarose 작은 구멍을 확인 합니다.</li>
	<li>전송된 (아래 단계) 빛을 사용 하 여 stereomicroscope 단계에 접시를 놓습니다. ' 다크 필드 '와 ' 밝은 필드 ' 조정 사진 중 원하는 조명 설정 하 고 최적화 하는 샘플의 반투명을 변경 합니다. 참고: 파이버 광섬유 조명 나중 단계 배아에 대 한를 사용 하 여 태아의 표면에서 반사를 피하기 위해. 지운된 태아 촬영 때 동일한 절차에 따라 하지만 100% 글리세롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 전송 하 고 완전히 그들을 담가.</li>
</ol>5. 파라핀 포함 하 고 X-여자의 단면 스테인드 배아
<ol><li>파라핀 왁 스 포함<ol>
<li>4 ° C (3.5 단계)에서 배아 스테인드 X gal을 제거 하 고 그들을 씻어 1 mL 1 x PBS와 세 번 정착 액의 과잉을 제거 하.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 조직학 카세트에 각 배아를 전송 합니다.</li>
		<li>비 커에 배아를 포함 하는 카세트를 놓고 다음 실 온에서 등급된 에탄올 시리즈를 통해 전달 하 여 탈수: 70% 에탄올, 한 번 30 분; 96% 에탄올, 각; 30 분 동안 두 번 30 분 동안 두 번 100% 에탄올 참고: 배아 저장할 수 있습니다 70% 에탄올에서 탈수 과정을 시작 때까지 4 ° C에서 알 수 없는 시간에 대 한.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 소 프로 파 놀에 전체 카세트를 품 어.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 미리 데워 진된 소 프로 파 놀을 포함 하 여 물 얼룩 유리를 카세트를 전송 하 고 오븐에서 30 분 동안 60 ° C에 두고.</li>
		<li>새로운 유리 50% 소 프로 파 놀의 혼합물을 포함 하 여 물 얼룩에 카세트를 배치 / 50% 파라핀 왁 스를 녹아 하 고 60 ° C 오븐에서 4 h 떠나.</li>
		<li>녹은 파라핀 왁 스, 60 ° C에서 30 분의 변화 2와 배아와 카세트를 품 어.</li>
		<li>최종 파라핀 세척의 끝에, 카세트 열고 몰드는 stereomicroscope 아래 샘플을 볼 수를 포함 하는 별도 조직에 각 배아를 전송 합니다.</li>
		<li>60 ° c.에 녹은 파라핀 왁 스로 잘 채우기 열띤된 집게를 사용 하 여 녹은 왁 스를 유지 하 고 신중 하 게 금형에 배아를 찾으시는. 참고: 샘플의 적절 한 방향을 원하는 평면에서 배아를 단면에 대 한 중요 한 단계입니다.</li>
		<li>금형에 파라핀 굳은, 전에 블록 위에 뚜껑 없이 카세트 놓고 녹은 파라핀 왁 스와 함께 작성 합니다. 하룻밤 실 온에서 경화 될 때까지 나머지 왁 스 식 지.</li>
		<li>파라핀은 완전히 경화, 일단 금형에서 고체 블록을 제거 하 고 단면14까지 실내 온도에 또는 4 ° C에 파라핀 블록 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 단면<ol>
<li>동양에 톰 블레이드 하 고 5-7 µ m 두께의 설정. 5.2.2. 시원한 얼음에 파라핀 블록 하 고 큐브 또는 피라미드 트림.</li>
		<li>녹은 왁 스의 작은 금액을 사용 하 여 블록 톰 홀더를 연결 합니다.</li>
		<li>최적의 절단에 대 한 블록을 방향을 정하십시오. 표준 톰을 사용 하 여 실 온에서 5-7 µ m 두꺼운 조각으로 파라핀 블록 섹션.</li>
		<li>좋은 붓을 사용 하 여, 조작 하 고 슬라이스 선택에 대 한 실 온에서 물 욕조에 섹션을 배치 합니다.</li>
		<li>현미경 슬라이드와 물 탕에서 섹션을 선택 하 고 스트레칭을 위한 42 ° C에 물 목욕으로 그들을 전송.</li>
		<li>물 목욕에서 섹션을 제거 하 고 부드럽게 접착 현미경 슬라이드에 그들을 배치.</li>
		<li>건조 오븐에서 37 ° C 하룻밤 수 있도록 완전히 준수 섹션에서 슬라이드, 그렇지 않으면, 그들은 얻을 수 있습니다 손실 얼룩이 지는 동안. 참고: 절차를 얼룩 시작까지 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deparaffinization 및 X Gal 스테인드 파라핀 섹션의 Counterstaining<ol>
<li>현미경 슬라이드 트레이 더 액체 파라핀 왁 스를 만들기 위해 적어도 45 분 동안 60 ° C에서 오븐에서에 슬라이드를 넣어.</li>
		<li>전송에 랙 슬라이드 및 유리 얼룩 요리를 사용 하 여 다음 단계를 수행: 감소 하는 완전 한 파라핀 제거 및 조직의 수 분 농도의 알콜을 포함 하는 얼룩 항아리에 랙 잠수함: 소 프로 파 놀에서 5 분 60 ° C; 소 프로 파 놀 3 분;에 대 한 2 분;에 대 한 100% 에탄올 96% 에탄올 1 분; 실 온에서 1 분의 70% 에탄올</li>
		<li>없는 알코올 잔류물 있는지 확인을 두 번 증류수에 섹션 린스.</li>
		<li>(예를 들어 핵-빠른 레드 솔루션) 실내 온도 (그림 2)에 (3-8 분) 사이 보통 5 분에 대 한 얼룩으로 섹션 counterstain 참고:이 얼룩 섹션에서 전체 조직 구조를 밝히는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>얼룩, 후 1 분 증류수에 슬라이드를 세척 하 고 현미경에 얼룩 섹션을 확인 합니다. 참고: 원하는 착 색 하는 것이 너무 약한 경우 counterstain 섹션 다시 긴 시간.</li>
		<li>에탄올의 농도 증가 함께 다음 시리즈에서 섹션 탈수: 2 분에 대 한 95% 에탄올에 두 세척,이 분 각, 100% 에탄올에 씻어 하 고, 파란색을 해산 하지 않으려면 색 침전 물, 크 실 렌에서 한 빠른 세척.</li>
		<li>랙 하나 하나에서에서 슬라이드를 제거 하 고 종이의 조각에 그들을 배치. 다음 산과 coverslip 각 합성, 영구 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드. 참고: 크 실 렌의 증기는 자극 하 고 인간의 건강 및 수생 생물에 유해 인화성 제품 이다. 그것은 후드 내에서 조작 하 고 적절 한 보호 장비를 사용 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자 들은 경쟁 금융 관심 선언 합니다.

대장균 LacZ 유전자 널리 사용 되었습니다 유전자 표현 패턴의 연구에 기자로 서의 높은 감도 및 검출의 용이성. 현재 프로토콜은 간단 하 고 저렴 한 뿐만 아니라 수행 하는 효소 반응에 따라 β-gal 식 탐지 하기 위한 고전적인 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 또한 전체 마운트 배아, 그대로 장기, cryostat 조직 섹션 또는 배양된 세포에서 중요 수정 없이 적용할 수 있습니다.
이 방법의 정확한 응용 프로그램 강력 하 고 해석할 얼룩이 발생합니다. 그러나, 동시 컨트롤 및 후속 확정 단계는 좋습니다. 이와 관련, 현재 프로토콜 일반적인 X-여자 얼룩 모니터링을 제공 하는 부정적인 컨트롤으로 사용 하는 야생 타입 littermate 배아에서 병렬로 수행 됩니다. 또한, 식 데이터 때 서쪽 오 점 그리고 양이 많은 PCR (Q-PCR)에 의해 확인 된다 β-gal 얼룩을 사용 하 여 얻은 분석 또는 β-gal에 의하여 immunohistochemistry ...

특정 유전자 표현 패턴을 설명 하기 위해 기자 유전자 마커로 사용 초파리 에서 포유동물에 최고 되었습니다. 유전자 변형 및 녹아웃 동물 관련 된 실험, 대장균 (대장균)의 세균 β-galactosidase 유전자 (LacZ) 가장 널리 사용 되는1,2,3, 중 하나입니다. 4. β-galactosidase (β-gal)의 단 (포도 당 그리고 갈 락 토스)5에 β-galactosides (유 당) 등의 가수분해를 catalyzes. 가장 일반적으로 사용 되는 기판은 X-여자 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), β-galactosidase 주는 상승 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole 그리고 갈 락 토스로 분해 glycoside 했다. 첫 번째는 이합체에 산화, 사용 하는 경우 칼륨 ferri 결합-및 페로 시안 화물 생산 특성 불용 성, 파란색 침전 (그림 1)6.
LacZ 유전자 이상 30 년 전 리포터 유전자로 사용 될 시작7,8. LacZ 삽입은 일반적으로, 그것은 내 생의 추적으로 유전자 변형 동물에서 뿐만 아니라 특정 삽입, 포함 된 셀을 시각화 하기 위해 박테리아와 세포 문화에 사용 될 수 있도록 열려있는 독서 프레임 대신 생 발기인의 하류 유전자 개발9중 식 패턴입니다. 이와 관련, β-galactosidase 활동의 시각화는 광범위 하 게 사용 되었다 초파리 에서 전체 조직에 단일 셀에서 개발 및 세포 프로세스를 이해 하. 초파리 유전학 부탁 있는 LacZ 는 취재 원 유전자를 포함 하는 수정 된 P 요소 구문 삽입 위치는 게놈에 무작위로 안정적인 라인의 세대. 따라서, 증강 요소의 영향 아래에 배치 하는 경우 그것은 수 있습니다 드라이브의 식을 조직 특정 방식으로, 지난 2 년간10동안 많은 유전자의 표현 패턴의 체계적인 분석을 허용 했다. 또한, 유전자 변형 생쥐 LacZ 유전자 발현 모니터링의 사용 또한 수 있습니다 Cre loxP 유전자 재조합 이벤트의 중재 재결합, 그리고 공상 분석 돌연변이 배아 줄기 세포 유래의 지역화 11, 용이 하 게 특정 조직에 LacZ 식의 제어 뿐만 아니라 일시적으로. 전체 배아의 β-galactosidase 활동의 일시적인 유전자 발현 에서에서 분석에 다른 발달 단계에 걸쳐 편리 하 게 관찰 될 수 있다 다른 농도에서 차동 얼룩 패턴을 생성 될 수 있습니다 또한, 8,12.
이 문서에서는, 선물이 X gal 통해 유전자 발현을 시각화 하는 프로토콜 마우스 배아의 초기 발달 단계에서 전체 산 조직에 얼룩. 우리는 파라핀 조직 또는 배아를 포함 하는 후 전체 산 표본 또는 세포 수준에서 레이블이 지정 된 셀의 정확한 탐지를 호의 매우 민감하고 저렴 한 기술로이 조직화 학적인 방법 제시. 메서드를 사용 하면 다른 방법13와 비교할 때 최소 배경과 마우스 조직에 얼룩의 직접적인 시각화 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SCHARLAU</td><td>50004/ LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>수성 마운팅 매체</td><td>VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>합성 마운팅 미디어</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>PROLABO</td><td></td><td></td>20824365</tr><tr><td>99.9% 에탄올 절대</td><td>SCHARLAU</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>50% 글루타르알데히드 용액</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>85% 글리세롤</td><td>MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>99.9% 글리세롤</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>비이온성 계면활성제(Nonidet P-40)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>542334</td><td></td></tr>핵 <tr><td>고속 적색 대조염색</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 파스틸,</td><td>MERCK</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(정제)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>페로시아</td>네이트 <td>칼륨 MERCK</td><td>1049840500</td><td></td></tr><tr><td>페로시아나이드 칼</td>륨 <td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>데옥시콜레이트</td><td>나트륨 SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소나트륨 일수화물</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 이수화물</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>트리스 하이드로 클로라이드 (Tris HCl)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (Roche)</td><td></td></tr> <tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일회용 플라스틱 cryomoulds 15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>회전식 마이크로톰</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>카세트</td><td>Oxford Trade</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>접착 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>부유 수조</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>일회용 로우 프로파일 마이크로 톰 블레이드</td><td>페더</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>파라핀 오븐</td><td>J.R. SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 2000205 <tr><td>왁스 파라핀 디스펜서</td><td>J.R. SELECTA</td><td></td><td></td></tr> 4000490 <tr><td>실체 현미경</td><td>Leica</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>교반 핫 플레이트</td><td>비비</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>볼텍스 쉐이커</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>실험실 저울</td><td>GRAM</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>정밀 저울</td><td>Sartorius</td><td>ISO9001</td><td></td></tr><tr><td>pHmeter</td><td>Crison</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>광섬유</td><td>Optech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Β-galactosidase, 인코딩 대장균 LacZ 유전자, 유전자 발현에 대 한 기자로 서 고 세포 계보 연구에서 추적 프로그램으로 크게 사용 된다. 클래식 조직화 학적인 반응은 쉽게 시각화 하는 불용 성 푸른 침전을 생성 하 고 철 제 2 철 이온, 함께에서 기판 X gal의 가수분해를 기반으로 합니다. 따라서, β-galactosidase 활동은 관심사의 유전자의 표현 패턴에 대 한 표식으로 개발 진행 있습니다. 여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 후속 방법 설명. 또한, 전체 배아를 명확히 하는 절차는 더 나은 X-여자 태아의 더 깊은 영역에 얼룩을 시각화 하 제공 됩니다. 반응 조건의 최적화 백그라운드 작업을 최소화 하는 데 필요한 있지만 일관 된 결과이 절차를 수행 하 여 얻을 수 있습니다. 분석 결과에 한계 고려 되어야 한다 또한, 특히 전체 마운트 얼룩에서 태아의 크기에 관한. 우리의 프로토콜 민감하고 cryostat 섹션 뿐만 아니라 모든 장기에 더 적용할 수 있는 마우스 개발 중 β-galactosidase 탐지에 대 한 신뢰할 수 있는 메서드를 제공 합니다. 따라서, 개발에 걸쳐 동적 유전자 표현 패턴 전체 태아에서이 프로토콜을 사용 하 여 쉽게 분석 될 수 있다 그러나 또한 세포 수준에서 상세한 식 파라핀 단면 후 평가 될 수 있다.

여기 우리는 X-gal을 사용 하 여 전체 마우스 배아 (그림 1 및 그림 2)에서 기판으로 β-galactosidase 조직화 학적인 반응에 대 한 표준 프로토콜을 적용 결과 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 우리는 서로 다른 배아 발달 단계 (E9.5, E11.5, 및 E12.5)에 막 유형 4 매트릭스 metalloproteinase (Mt4-mmp) 식 검사 LacZ 기자는 내 생의 통제를 표현 하는 Mt4 mmp 돌연변이 마우스를 사용 하 여 Mt4 mmp 발기인 (그림 3, 그림 4및 그림 5)9,...

여기 우리가 전체 마우스 배아 초기에 β-galactosidase 활동의 검출을 위한 표준 프로토콜 및 파라핀 단면화 및 counterstaining에 대 한 방법을 설명 합니다. 이것은 개발 조직 단면도에 또한 적용 될 수 있는 유전자 발현을 모니터링 하는 간단 하 고 빠른 절차 기관 또는 배양된 세포.

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

이 방법은 배아 발달 중 유전자 발현 패턴 연구와 같은 발생 생물학 분야의 주요 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 민감하고 수행하기 쉽고 빠르며 전체 마운트 조직에서 염색을 직접 시각화하거나 샘플의 파라핀 절편 후 더 높은 해상도로 염색을 시각화할 수 있다는 것입니다. Maria Jose Blanco 박사, Anabel Learte 박사, Emma Munoz 박사 및 Miguel Marchena 박사가 시연을 맡을 예정이며, 이들 모두는 제 연구실의 선임 박사후 연구원입니다. 먼저 갈락토시다아제를 발현하는 글루타르알데히드 고정 형질전환 배아를 갓 준비한 X-gal 린스 버퍼에 넣어 실온에서 10분 동안 배양합니다. 야생형 깔짚으로 만든 배아를 효소 반응에 대한 음성 대조군으로 사용합니다. 다음으로, 헹굼 버퍼를 pH 8-9의 X-gal 염색 용액으로 교체하고 빛을 피하고 37도에서 밤새 2시간 동안 배양합니다.

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 신속하게 식별하고 마우스 배아 줄기 세포 유지 및 자기 갱신을 조절 유전자를 특성화하기 위해 형광 기자 분석을 설명합니다.

마우스 배아 줄기 세포 유지 보수 및 자체 갱신을 조절 유전자를 공부하는 Oct4GiP 리포터 분석

이 비디오는 마우스 배아에서 레티노산 활성을 평가하는 기술을 보여줍니다. 마우스 배아에서 세포를 분리하면 세포를 레티노산(RA) 리포터 세포와 공동 배양합니다. 배아 세포는 RA를 생성하는데, 이는 리포터 세포에서 베타-갈락토시다아제 발현을 유도하여 배아 세포에서 RA 활성을 나타냅니다.

마우스 배아 세포에 의한 레티노산 생산을 연구하기 위해 공동 배양에서 리포터 세포 사용

우리는 유전자 조작 마우스 개발에서 감각 축삭 성장 표현형을 평가하는 효과적인 방법으로 전체 동물에서 말초 통각 수용기 축삭돌기 이미징을 위해 태아 마우스를 유전형, 염색 및 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다.

마우스 배아 감각 축삭 돌기 전체 마운트 이미지

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.

유전자 변형 마우스 생산을 중재 하는 lentiviral: 창시자의 직접적인 연구를 위한 간단 하 고 매우 효율적인 방법

수정 된 난 자 마우스와 초기 단계 배아 zona pellucida, 유전자 배달에 대 한 장벽을 형성 하는 당단백질 매트릭스에 의해 보호 됩니다. 이 문서는 zona transduce lentiviral 벡터와 배아 세포와 유전자 변형 쥐를 만들고 레이저로 꿰뚫기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

마우스를 레이저를 이용한 Lentiviral 유전자 전달 수정 된 계란

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

우리는 초기 배아 발생 시 단일 세포에서 조기 배아 발생 시 접합 게놈 활성화 중 발생 전사를 시각화하는 방법을 설명합니다.

초기 배아 단일 세포에서 접합 게놈 활성화 시각화

배우세요 전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활성을 감지하여 유전자 발현을 추적하는 방법입니다. 이 기술은 발생생물학 연구에서 높은 감도와 직접적인 가시화를 제공하여 발달 과정의 유전자 기능을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

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