Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

이 방법은 인실리코(in silico) 예측 mRNA 표적이 특정 세포 microRNA와 직접 상호 작용할 수 있는지 여부와 같은 mRNA 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 비오틴화된 모방체를 활용하여 표적 mRNA를 끌어내린다는 것입니다. 그리고 이러한 비오틴화된 모방체는 핵산 또는 LNA 기반 모방 화학을 가지고 있어 반응의 특이성을 향상시킬 수 있는 매우 높은 친화도를 가진 매우 안정적인 올리고뉴클레오티드의 형성에 도움이 됩니다.

이 방법론의 의미는 microRNA의 생물학을 이해하는 것에서 microRNA 기반 치료에 이르기까지 확장할 수 있다는 것입니다. 이것은 주로 우리 모두가 microRNA가 세포 생물학의 모든 측면에서 중요한 역할을 한다는 것을 알고 있기 때문입니다. 따라서 microRNA의 표적을 확인함으로써 mRNA와 같은 발견과 치료에 중요한 중요한 지식을 확실히 제공할 수 있습니다.

프로토콜을 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Sabyasachi Dash입니다. 자성 비드를 스트렙타비딘으로 코팅하려면 먼저 비드를 완전히 와류로 돌려 재현탁시킵니다. 그런 다음 30마이크로리터의 재현탁된 비드를 2mm 뉴클레아제가 없는 마이크로분리 튜브에 전달합니다.

자석의 마그네틱 비드 서스펜션으로 채워진 튜브를 2분 동안 그대로 둡니다. 2 분 후, 비드가 자석과 접촉하는 튜브 측면으로 당겨 질 때 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 세척 버퍼를 비드에 추가합니다.

세척 버퍼를 추가한 후 자석에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 구슬을 15초 동안 소용돌이쳐 씻습니다. 다음으로, 자석에 자석 비드가 들어있는 튜브를 2 분 동안 옮깁니다.

배양이 끝나면 상층액을 피펫으로 빼내고 폐기합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 RNase freeing solution을 비드에 추가합니다. RNase 용액을 혼합하기 위해 15초 동안 비드를 소용돌이칩니다.

그런 다음 실온에서 5분 동안 구슬을 배양합니다. 5분 배양 후 자석에 자성 비드가 들어 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다. 배양 후 상층액을 피펫으로 빼내고 폐기합니다.

다음으로, 비드에 100마이크로리터의 재현탁액을 넣고 15초 동안 와류를 사용합니다. 볼텍싱 후 실온에서 튜브를 5분 동안 배양합니다. 5분 후 자석에 자석 구슬이 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다.

2분 후 상층액을 피펫으로 빼내고 버립니다. 그런 다음 비드에 200마이크로리터의 비드 차단 용액을 추가합니다. 차단 용액에 비드를 다시 부유시키려면 실온에서 15초 동안 완전히 와류로 가열합니다.

그런 다음 튜브를 섭씨 4도의 다중 튜브 회전기에 16시간 동안 그대로 두십시오. 용해물을 준비하려면 세포 스크레이퍼를 사용하여 형질 주입된 HEK293T 세포를 층류 후드 아래에서 긁어냅니다. 그런 다음 세포 현탁액을 2ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로, 세포 현탁액을 1, 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 pH 7.2로 유지되는 1x 인산염 완충 식염수에 세포 펠릿을 용해시킵니다. 잔류 매체가 없는 펠릿을 얻기 위해 원심분리 과정을 반복합니다.

원심분리가 끝나면 펠릿을 얼음 위에 빠르게 옮깁니다. 다음으로, 신선한 세포 용해 완충액을 준비합니다. 완충액을 준비한 후 260마이크로리터의 완전한 세포 용해 완충액을 마이크로분리 튜브의 샘플에 추가합니다.

균질한 현탁액을 위해 세포 펠릿을 여러 번 피펫으로 만듭니다. 세포를 용해하려면 섭씨 80도에서 10-15분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 두십시오.

섭씨 4도의 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 16, 000g에서 원심분리 과정을 반복합니다. 원심분리 후 용해액이 함유된 상등액을 멸균 1.7ml 마이크로분리 튜브에 넣고 얼음 위에 옮기고 펠릿을 배출합니다. 상층액에 5몰 염화나트륨을 첨가하여 최종 농도 1어금니를 얻습니다.

먼저 풀다운 세척 버퍼를 준비합니다. 비드 차단 후 하룻밤 배양 후 자석 비드가 들어 있는 튜브를 2분 동안 자석에 옮깁니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오.

구슬에 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 풀다운 세척 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 15초 동안 구슬을 소용돌이칩니다. 그리고 즉시 실온에서 30-60초 동안 배양합니다.

1분 후 자석에 자성 구슬이 들어 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 그런 다음 300마이크로리터의 완전한 풀다운 세척 버퍼에 비드를 다시 매달아 놓습니다.

염화나트륨을 첨가한 후 300마이크로리터의 세포 용해물을 300마이크로리터의 비드로 채워진 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 한 시간 동안 너트 믹서에 그대로 두십시오. 한 시간 후 자석의 튜브를 5분 동안 옮깁니다.

배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 다음으로, 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 완전 풀다운 세척 버퍼를 비드에 추가합니다. 버퍼를 추가한 후 실온에서 15초 동안 비드를 와류로 가열합니다.

그런 다음 튜브를 자석에 5분 동안 놓습니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물 100마이크로리터에 비드를 녹여 얼음에 보관합니다.

비드에서 전체 RNA를 분리합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 분리된 RNA를 용해시킵니다. 다음으로, 분광 광도계에서 RNA의 농도를 측정합니다.

마지막으로, 마이크로리터당 50나노그램에서 RNA의 작업 원료 용액을 준비합니다. 다음으로, 총 분리된 RNA 50나노그램을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 상보적 DNA를 합성합니다. 그런 다음 올리고 프라이머를 최종 부피 20마이크로리터에 추가합니다.

PCR 튜브를 써모사이클러에 놓고 실행을 시작합니다. qPCR이 완료된 후 플레이트의 각 웰에 9마이크로리터의 PCR 반응 혼합물을 옮깁니다. 각 웰에 1마이크로리터의 보상 DNA를 추가하여 최종 부피 10마이크로리터를 얻습니다.

다음으로, 내열 PCR 플레이트 씰러를 사용하여 PCR 플레이트를 밀봉하고 열순환기에 로드합니다. 그런 다음 thermocycler에서 프로그램을 시작합니다. miR-125b의 표적을 검증하기 위해 PARP-1 및 p53의 표적 mRNA의 발현 수준을 연구합니다.

흥미롭게도, PARP-1 및 p53 mRNA의 발현 수준은 음성 대조군인 Actin mRNA보다 비교적 높습니다. 실험에 사용된 다른 음성 대조군은 템플릿이 없으며 3개의 프라임 비오틴화 스크램블 염기서열입니다. 또한, 정량화된 PARP-1 및 p53의 3개의 프라임 미번역 영역도 다양한 수준의 증폭을 보여줍니다.

이는 Actin, 템플릿 없음, 3개의 프라임 비오틴화 스크램블 염기서열과 같은 음성 대조군과 비교됩니다. PARP-1 및 p53의 이러한 증폭은 이들이 세포 miR-125b의 강력한 표적임을 나타냅니다. 일단 숙달되면, 세포의 도금에서 시작하여 비오틴 표지된 LNA 모방체의 형질 주입 및 PCR 분석으로 마무리하는 이 기술은 적절하게 수행될 경우 일주일 이내에 완료할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 포유류 세포에서 추정되는 mRNA 표적을 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 포유류 세포에서 3개의 프라임 비오틴 태그가 지정된 잠금 핵산 모방 기반 transfection을 도입함으로써 높은 특이성과 낮은 노이즈 비율로 달성할 수 있습니다. RNA, 특히 마이크로 RNA와 같은 작은 RNA로 작업하는 것은 매우 민감하고 분해되기 쉽다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 이 분석을 수행하는 동안 뉴클레아제가 없는 물, 뉴클레아제가 없는 마이크로분리 튜브 및 멸균 완충액의 사용과 같은 필요한 예방 조치를 취해야 하며, 더 나은 감도와 더 나은 결과를 얻기 위해 이 분석을 수행하는 동안 새로 준비된 완충액 및 시약을 고려해야 합니다.