Name: Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 생합성 바이오틴화 LNA 기반 miRNA 미믹을 활용한 mRNA 풀 다운 방법으로 세포 내 miRNA의 mRNA 표적을 검증하는 기술입니다. 이 방법은 높은 특이성과 안정성으로 microRNA 생물학 및 치료제 개발 연구에 기여합니다.

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이 작품 국립 보건원 (NIH) 보조금 DA037779 (일본)에 의해 부분적으로 지원 되었다 DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 및 MD007586 (C.D.)에. 작품 RCMI 그랜트 G12MD007586, 밴 더 빌 트 CTSA 그랜트 UL1RR024975에 의해 또한 지원 되었다 Meharry 들어가게 연구 센터 (MeTRC) CTSA 부여 (U54 NCRR/NIH, NIMHD/NIH에서 U54 그랜트 MD007593와 에이즈에 대 한 테네시 센터에서 RR026140 연구 (P30 AI110527)입니다.

1.의 3'-biotinylated 미르 transfection
참고: 살 균 층 흐름 후드 안에 다음 단계를 수행 합니다.
<ol><li>2 mL에 잘 당 종자 4 x 105–5 x 105 HEK 293T 세포 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) [10% 소 태아 혈 청 (FBS)와 펜 strep 항생제 x 1 보충 DMEM] 완료. 37 ° C, 5% CO2 하룻밤에 인큐베이터에 셀 문화.</li>
	<li>다음 날, 건강 및 가벼운 현미경 도금된 세포의 부착을 확인 합니다. 참고: 셀 준수 하 고 다음 단계로 진행 하기 전에 적절 한 형태를 달성 할 다는 것을 확인 하십시오. HEK 293T 세포 transfection 18-24 h에 대 한 일반적으로 준비가 도금 게시.</li>
	<li>살 균 1.7 mL microfuge 관에서 최소한의 필수 미디어의 200 µ L에서 biotinylated 미르의 75 picomoles 희석. 또 다른 1.7 mL microfuge 관 포함 Liposome 근거한 transfection 시 약 (8 µ L/잘) 최소한의 필수 미디어의 200 µ L에 희석이 혼합 전송. Pipetting으로 철저 하 게, 하지만, 부드럽게 혼합 하 고 transfection 단지의 형성 수 있도록 실 온에서 20-25 분 동안 품 어.</li>
	<li>부드러운 pipetting으로 6 잘 문화 판에서 오래 된 미디어를 제거 하 고 (펜 strep 항생제 x 1) 없이 갓된 완전 한 DMEM의 1.6 mL 각 잘 보충.</li>
	<li>(1.3)에서 transfection 단지 추가 drop-wise 6 잘 플레이트 잘 보정 피 펫을 사용 하 여 셀에. 접시에 걸쳐 그들의 균일 한 분포를 보장 하기 위해 단지를 추가 하는 동안 접시를 부드럽게 소용돌이 친다. 참고:이 단계는 transfection 효율을 달성 하기 위한 매우 중요 하 고 관심과 인 내와 수행 합니다.</li>
	<li>적어도 36 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 셀 문화.</li>
</ol>2. 준비 Streptavidin의 코팅 자석 구슬-난
<ol><li>Vortexing에 의해 철저 하 게 streptavidin 자석 구슬을 resuspend. 2 mL nuclease 무료 microfuge 관 30 µ L (샘플) 당 비드 서 스 펜 션의 전송.</li>
	<li>마그네틱 비드 구분 스탠드 ("자석"이) 2 분 동안에 구슬 정지를 포함 하는 튜브를 놓습니다. 구슬 자석 접촉 튜브의 측면에 그려진는 확인 한 후 조심 스럽게 제거는 micropipette를 사용 하 여 상쾌한.</li>
	<li>구슬에 구슬 워시 버퍼 (10 mM Tris Cl pH 7.5, 0.5 m m EDTA, 1 M NaCl) 100 µ L를 추가 합니다. 자석에서 튜브를 제거 합니다. 15 소용돌이 구슬 씻어 실 온에서 s.</li>
	<li>구슬 2 분에 대 한 자석에 포함 된 튜브를 배치 하 고 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>3 세척 총 2.3-2.4 단계를 반복 합니다. 마지막 세척 단계 후 자석에서 튜브를 제거 합니다.</li>
	<li>구슬에 (0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl) 솔루션을 자유롭게 RNase의 100 µ L를 추가, 15에 대 한 vortexing에 의해 잘 섞어 s, 그리고 5 분 장소 2 분에 대 한 자석에 구슬 포함 된 튜브에 대 한 실 온에서 품 어 조심 스럽게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>세 번의 총 2.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>구슬, 소용돌이 15 s에 구슬 물의 resuspension 솔루션 (0.5 M NaCl)을 추가 하 고 5 분 resuspended 구슬 2 분에 대 한 자석에 놓고는 상쾌한을 조심 스럽게 제거에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	<li>구슬에 구슬 차단 솔루션 (1 µ g / µ L BSA, 2 µ g / µ L 효 모 tRNA)의 200 µ L를 추가 합니다. 15에 대 한 부드러운 vortexing에 의해 혼합 실 온에서 s. 멀티 관 회전에 16 h (오버 나이트) 4 ° C에서 품 어.</li>
</ol>3입니다. 세포 Lysates의 준비
<ol><li>층 류 후드 내부 살 균 세포 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드러운 된다고 하 여 transfected HEK 293T 세포를 수확 한 다음 살 균 2 mL microfuge 관으로 각 샘플을 전송.</li>
	<li>1500 x g 에서 원심 분리 하 여 작은 긁힌 것된 셀 공의 5 분 Resuspend 펠 릿 살 균 PBS (인산 염 버퍼 염 분), pH 7.2 x 1에 대 한. 펠 릿 잔여 미디어의 자유를 얻기 위해 5 분 동안 1500 x g 에서 원심 분리기 다시. 바로 얼음으로 펠 릿을 포함 하는 관 급락.</li>
	<li>신선한 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼를 준비 (150 mM NaCl, 25mm Tris-Cl, pH 7.5, 5 mM DTT, 0.5 %IGEPAL, 60 U/mL Superase, Protease 억제제 x 1). 참고: IGEPAL, Superase, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 부족 세포 세포의 용 해 버퍼의 재고 미리 준비 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 재고 세포 세포의 용 해 버퍼에 권장된 최종 농도에서 위의 보충을 추가 하 고 얼음에 저장 하 여 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 신선한 배치를 준비 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 완벽 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 260 µ L microfuge 관 (즉, 각 microfuge 관 6-잘 접시의 한 우물에서 수확 하는 셀이 포함)에서 각 샘플을 추가 하 고 pipetting으로 동질적인 서 스 펜 션으로 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>동결-해 동 방법을 사용 하 여 세포를 lyse: 10-15 분-80 ° C에서 튜브를 품 어. 다음, 얼음에 밖으로 해 동을 셀 수 있습니다.</li>
	<li>원심 결과 세포 lysate 16000 x g 냉장된 벤치탑 원심 분리기 4 ° c.에 설정에서 5 분에서</li>
	<li>얼음에 살 균 1.7 mL microfuge 관에 지운된 세포 lysate를 전송. 펠 릿을 삭제 합니다. 참고: 마지막 양의 lysate 삭제 해야 합니다 ~ 240-250 µ L.</li>
	<li>1 M의 최종 농도에 5 M NaCl를에서 지운 lysate를 추가 하 고 얼음에 샘플을 유지.</li>
</ol>4. Streptavidin 자석 구슬의 준비-II
<ol><li>신선한 완전 한 풀-다운 워시 버퍼 (10mm KCl, 1.5 m m MgCl2, 10 mM Tris Cl pH 7.5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0.5 %IGEPAL, 60U/mL Superase, 및 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일)를 준비 참고: 풀-다운 워시 버퍼 IGEPAL, Superase, 및 프로 테아 제 억제 물 칵테일 부족 재고 미리 준비 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 재고 세포 세포의 용 해 버퍼에 권장된 최종 농도에서 위의 보충을 추가 하 고 얼음에 저장 하 여 완전 한 세포 세포의 용 해 버퍼의 신선한 배치를 준비 합니다.</li>
	<li>장소는 튜브를 포함 하는 준비 된 구슬 (2.9 단계) 2 분에 대 한 자석에 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>구슬에 얼음 처럼 차가운 완벽 풀 다운 워시 버퍼의 150 µ L를 추가 합니다. 15 소용돌이 s 고 30-60 미 위 2 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 실내 온도에서 품 어.</li>
	<li>3 번의 4.3 총에 대 한 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>완전 한 풀-다운 워시 버퍼의 300 µ L에 구슬 resuspend.</li>
</ol>5. 대상 mRNA-미르 단지의 풀 다운
<ol><li>(단계 3.8)에서 세포 lysate의 300 µ L를 전송 (4.5 단계)에서 구슬의 300 µ L를 포함 microfuge 관에.</li>
	<li>실 온에서 1 h nutating 믹서에 혼합물을 품 어.</li>
	<li>5 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 장소.</li>
	<li>구슬에 얼음 처럼 차가운 완벽 풀 다운 워시 버퍼의 300 µ L를 추가 합니다. 15와 동 실내 온도 및 장소 5 분에 대 한 자석에 튜브는 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한 s.</li>
	<li>5.4 단계를 두 번 더 반복 합니다.</li>
	<li>구슬 nuclease 무료 물 100 µ L에 resuspend 그리고 얼음에 품 어.</li>
</ol>6. 총 RNA 추출, cDNA 합성, 및 정량
<ol><li>(5.6 단계)에서 resuspended 구슬에서 총 RNA 추출 적절 한 메서드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 25 µ L nuclease 무료 물에서 추출 된 총 RNA를 resuspend. RNA 농도 분 광 광도 계 (260/280에서 흡 광도)를 사용 하 여 품질을 확인 합니다. 50 ng / µ L에서 RNA의 작업 재고를 준비 합니다.</li>
	<li>CDNA 합성, triplicates, 50를 사용 하 여 수행 (단계 6.1)에서 총 RNA의 ng ( 재료의 표참조) 키트는 적절 한 cDNA 합성을 사용 하 여 20 µ L (표 1)의 최종 볼륨 올리고 dT 프라이 머를 사용 하 여. 표 2에 설명 된 조건에 따라 열 사이클링을 수행 하기 위해 정량에 PCR 튜브, 로드.</li>
	<li>
(6.2 단계)에서 CDNA에 정량 수행 SYBR 녹색 화학을 사용 하 여 (재료의 표 참조):
	<ol>
<li>무 균 조건에서 96 잘 명확한 아래 접시에 triplicates 모든 정량 Pcr 반응을 수행 합니다.</li>
		<li>정량 마스터에서 반응 혼합물의 aliquot 9 µ L 믹스 ( 표 3참조)는 격판덮개의 각 음에. 다음, 1 µ L 10 µ L의 최종 볼륨을 달성 하기 위해 각 잘에 cDNA의 밀봉 내열성 PCR 플레이트 마감재를 사용 하 여 PCR 플레이트를 추가 하 고 정량에 로드</li>
		<li>표 4에 설명 된 조건에 따라 열 사이클링을 수행 합니다.</li>
		<li>스크램블된 제어의 식 수준에 각 샘플의 식 수준 (Ct 값)를 정상화. 이 값을 사용 하 여 계산 식에서 배 변화.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 및 비 금융 관심사를 선언합니다.

세포질 miRNAs의 mRNA 표적 식별이 그들의 규제 기능을 이해 중요 합니다. 여러 계산 도구는 씨앗 시퀀스 complementarity 및 대상 시퀀스19,20의 보존에 따라 목표를 예측 하 고용 된다. 이 도구는 귀중 한, 비록 그들은 가양성 및 false 네거티브의 상부를 생성할 수 있습니다. 따라서, 이러한 예측은 복잡 하 고 복잡 한 miRNA:mRNA의 풀 다운 RISC 그들의 각각 목표27,31miRNAs의 직접 바인딩 확인의 immunoprecipitation 같은 실험 방법으로 결합 됩니다. Biotinylated 미르를 이용 하는 실험적인 전략 풀 다운에 모방이 보고서 세부 정보는 mRNA를 대상. Biotin 풀 다운 높은 감도와 낮은 거짓 긍정적인 평가35</sup...

MicroRNAs (miRNAs)는 작은 비 코딩 RNAs 단백질 식1부정적인 통제. 미르의 선구자 단백질 코딩 유전자2,3의 introns 그리고 intergenic 지역 내 가장 자주 게놈의 많은 영역을 통해 클러스터에 상주합니다. MiRNA 인코딩에서 pri miRNAs의 전사를 포함 하는 miRNAs의 속 유전자4. Pri miRNAs는 순차 처리를, 그리고 단일 좌초 성숙한 miRNAs4,5를 생성 하는 세포질에서 핵에서 처음 받 다. 그 후, 성숙한 miRNAs RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 통합 하는: 대상 인식4,5, 단백질의 Argonaute 제품군의 구성원을 포함 하는 multimeric 단백질-RNA 복잡 6,7. 복잡 한 RISC에 성숙한 miRNAs는 주로 바인딩할는 3' UTR 대상 mRNAs8,,910 의 하지만 가끔 코딩 및 mRNA10,11의 5' UTR 영역에 바인딩할 수도 있습니다. . MiRNA에는 mRNA의 바인딩을 변환 입을12,,1314 및 일부 경우 mRNA 불안15결과 시퀀스. 하나의 miRNA는 많은 mRNAs를 타겟팅 할 수 있습니다, 이후 이러한 규제 분자 거의 모든 세포질 프로세스에 참여 하 고 다양 한 질병 상태16,,1718에 연루 되었습니다.
MiRNAs 세포 경로 조절 하는 방법의 자세한 이해 필요 대상 mRNAs의 식별을 합니다. 여러 생물 정보학 플랫폼 putative miRNA:mRNA 상호 작용19,20을 예측할 수 있습니다. 이러한 예측은 miRNA의 2-8 뉴클레오티드 시드 순서와 대상 mRNA4,21내 보완 시퀀스 사이의 완벽 한는 왓슨 크릭 기본 쌍에 의존 합니다. 또한, 이러한 도구 miRNA:mRNA 이중의 이차 구조를 생성,이 분자 상호 작용의 열역학 매개 변수를 계산 하 고 대상의 기능적 관련성을 향상 시키기 위해 종에 걸쳐 바인딩 사이트의 보존을 보여 예측입니다. 불행히도,이 도구는 또한 매우 높은 속도 (~ 27-70%)15,22거짓 긍정적인 목표를 예측의 한계가 있다. 가장 중요 한 것은, 이러한 철에 플랫폼 그들의 대상23miRNAs의 정식이 아닌 상호 작용을 인식 실패. 따라서, 이러한 예측 분석 기능 관련 목표를 확인 하는 실험 방법 종종 결합 됩니다.
여러 방법은 실험적으로 miRNA:mRNA 상호 작용을 확인 하기 위해 개발 되었습니다. 유전자 실험 미르 모방을 사용 하 여 스폰지와 억제제 셀에서 miRNAs의 레벨을 변경 하는 대상 유전자 식24,,2526에 규제의 효과 대 한 단서를 제공 합니다. 또한, 기자 대상 mRNA와 미르 모방의 3' UTR 영역을 포함 하는 복제의 공동 transfection 통해 분석을 기반으로 또는 세포에 억제제 miRNAs26의 규제 기능의 증거를 제공. 이러한 방법은 miRNAs에 의해 유전자 발현의 post-transcriptional 레 귤 레이 션을 공부 하는 중요 한 동안, 셀룰러 미르 레벨에서 변경의 transfection 효율 및 pleotropic 효과 이러한 유전 접근23의 주요 한계 26. 따라서, miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 조사 하는 보완 생화학 방법은 miRNAs의 세포질 기능을 더 나은 이해를 채용 합니다.
하나 널리 사용 되 miRNA와 표적 간의 직접적인 상호 작용을 공부 하 방법은 뒤에 복잡 한27,,2829,30 내 mRNA 대상의 검색 복잡 한 RISC의 immunoprecipitation . 최근, 향상 된 RISC 트랩 방법 또한 미르 대상;을 식별 하기 위해 이용 되었다 그것은 mRNA 대상의 정화와 RISC-미르-mRNA 중간체 내의 대상의 안정화 커플. 그러나,이 methodsface 일반적으로 세포질 구획31,32에 의해 차별 하는 RNA와 RNA 바인딩 단백질 사이 일반적인 상호 작용의 내재 도전. 또한, 이러한 분석 RISC 복잡 한33의 immunoprecipitation에 대 한 AGO2 단백질의 존재에 의존 하고있다. AGO2는 효율적인 miRNA:mRNA 상호 작용을 중재 하는 유일한 argonaute 하지, 다른 argonautes의 한쪽으로 치우친된 결과34발생할 수 있습니다. 따라서, 대체 전략 mRNA에 미르의 직접 바인딩 공부 필요 합니다.
이 보고서에서 우리는 miRNA 및 그 대상 간의 직접적인 상호 작용을 프로 빙에 대 한 1 단계 접근 정교한 mRNA. 첫째, 3' biotinylated 잠겨 핵 산 (LNA) 미르 모방 포유류 세포로 페는. 그런 다음, 세포 lysate에 복잡 한 miRNA:mRNA 코팅 streptavidin 자석 비즈를 사용 하 여 캡처됩니다. 상호 보완적인 miRNA에 바인딩된 mRNA 대상 정량 Pcr를 사용 하 여 정량 이다.

<table><tbody><tr><td>세포주- HEK293T</td>세포 <td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated bovine serum (Hi-FBS)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s medium (DMEM)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) (1x)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)&nbsp;</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액 (100x)</td><td>Cellgro/Mediatech</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 저축 혈청 매체</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>3198-088</td><td></td></tr><tr><td>Liopfectamine 2000 형질주입 시약</td><td>Invitrogen/ Thermofisher</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated has-miR-125b</td><td>Exiqon</td><td>339178/ID-27281622</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated 스크램블 제어</td><td>Exiqon</td><td>479997-671/ID-714884</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin 마그네틱 비드</td><td>피어스</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>효모 tRNA</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl) 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2) 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH)</td><td>시그마-알드리치</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐염(EDTA) 용액, 0.5M, pH 8.0</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>슈퍼아제</td><td>앰비온/써모피셔</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse 자유수</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>iScript-Select cDNA 합성 키트</td><td>Biorad</td><td>170-8897</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 프라이머&nbsp;</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq-Universal SYBR green supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-Spin 자석</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>12320D</td><td></td></tr></tbody></table>

biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mrna를 표적 세포 mirnas 분석 결과

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) post-transcriptionally 세포 유전자 발현을 조절 하는 작은 noncoding RNAs의 클래스는. 3' 번역된 (UTR)의 지역에 MiRNAs 바인딩 대상 mRNA 단백질 번역 억제 또는 어떤 경우에 mRNA 저하 될. 하는 3' UTR mRNA miRNA의 5' 끝에 2-8 뉴클레오티드 시드 순서에 의해 중재 대상의 miRNA의 바인딩. 세포질 규제 분자 miRNAs의 역할은 잘 설립, 기능적 관련성 대상 mRNAs의 식별 도전 남아 있다. Bioinformatic 도구 미르 바인딩에 대 한 잠재적인 대상으로 내는 3' UTR mRNAs의 시퀀스 예측 하 고용 있다. 이러한 도구는 또한 관련된 종 중에서 같은 시퀀스의 진화 보존 기능 역할을 예측 하려고 결정 하 활용 되었습니다. 그러나, 이러한 계산 방법을 종종 거짓 긍정적인 결과 생성 하 고 미르와 mRNA 간의 정식 상호 작용을 예측으로 제한 됩니다. 따라서, 그것의 mRNA 표적에 미르의 직접 바인딩을 측정 실험 절차는 상호 작용 기능을 설정 하는 데 필요한. 이 보고서에서 우리는 셀룰러 미르 미르 125b와 3' UTR의 PARP-1 mRNA 간의 직접적인 상호 작용의 유효성을 검사 하는 민감한 방법을 설명 합니다. 우리 정교한 프로토콜 있는 합성 biotinylated-미르 모방 되었다 포유류 세포로 페 하 고 미르 mRNA 복잡 한 세포 lysate에서 자석 구슬 streptavidin 입히는 내려 오게 되었다. 마지막으로, 대상 복잡 한 뽑아 다운 핵 산에서 mRNA 정량 기반 전략을 사용 하 여 계량 했다.

MiRNAs 규제 대상 mRNAs에 바인딩하여 세포 프로세스. 따라서, 식별 mRNA 표적 miRNA의 기능을 이해 하는 열쇠입니다. 여기 우리 정교한 셀룰러 miRNA의 mRNA 표적을 식별 하는 방법. 이 프로토콜은 Wani 외. 에서 적응 35 biotinylated LNA 기반 미르 모방 풀 다운을 활용의 수정 대상 mRNA. LNA 기반 oligonucleotide 모방의 사용 없이 독성 효과36,,3738수정된 ribose 링의 높은 안정성으로 인하여 대상 바인딩의 특이성을 향상 시킵니다. 우리 셀룰러 미르 미르 125b의 대상으로 PARP 1 mRNA 아래로 끌어이 방법 채택. 미르-125b 식의 최고 수준의 신경 기능<sup clas...

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

이 방법은 인실리코(in silico) 예측 mRNA 표적이 특정 세포 microRNA와 직접 상호 작용할 수 있는지 여부와 같은 mRNA 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 비오틴화된 모방체를 활용하여 표적 mRNA를 끌어내린다는 것입니다. 그리고 이러한 비오틴화된 모방체는 핵산 또는 LNA 기반 모방 화학을 가지고 있어 반응의 특이성을 향상시킬 수 있는 매우 높은 친화도를 가진 매우 안정적인 올리고뉴클레오티드의 형성에 도움이 됩니다.이 방법론의 의미는 microRNA의 생물학을 이해하는 것에서 microRNA 기반 치료에 이르기까지 확장할 수 있다는 것입니다. 이것은 주로 우리 모두가 microRNA가 세포 생물학의 모든 측면에서 중요한 역할을 한다는 것을 알고 있기 때문입니다. 따라서 microRNA의 표적을 확인함으로써 mRNA와 같은 발견과 치료에 중요한 중요한 지식을 확실히 제공할 수 있습니다.프로토콜을 시연하는 것은 우리 연구실의 대학원생인 Sabyasachi Dash입니다. 자성 비드를 스트렙타비딘으로 코팅하려면 먼저 비드를 완전히 와류로 돌려 재현탁시킵니다. 그런 다음 30마이크로리터의 재현탁된 비드를 2mm 뉴클레아제가 없는 마이크로분리 튜브에 전달합니다.자석의 마그네틱 비드 서스펜션으로 채워진 튜브를 2분 동안 그대로 둡니다. 2 분 후, 비드가 자석과 접촉하는 튜브 측면으로 당겨 질 때 마이크로 피펫을 사용하여 상층액을 제거하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 세척 버퍼를 비드에 추가합니다.세척 버퍼를 추가한 후 자석에서 튜브를 제거합니다. 그런 다음 구슬을 15초 동안 소용돌이쳐 씻습니다. 다음으로, 자석에 자석 비드가 들어있는 튜브를 2 분 동안 옮깁니다.배양이 끝나면 상층액을 피펫으로 빼내고 폐기합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 RNase freeing solution을 비드에 추가합니다. RNase 용액을 혼합하기 위해 15초 동안 비드를 소용돌이칩니다.그런 다음 실온에서 5분 동안 구슬을 배양합니다. 5분 배양 후 자석에 자성 비드가 들어 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다. 배양 후 상층액을 피펫으로 빼내고 폐기합니다.다음으로, 비드에 100마이크로리터의 재현탁액을 넣고 15초 동안 와류를 사용합니다. 볼텍싱 후 실온에서 튜브를 5분 동안 배양합니다. 5분 후 자석에 자석 구슬이 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다.2분 후 상층액을 피펫으로 빼내고 버립니다. 그런 다음 비드에 200마이크로리터의 비드 차단 용액을 추가합니다. 차단 용액에 비드를 다시 부유시키려면 실온에서 15초 동안 완전히 와류로 가열합니다.그런 다음 튜브를 섭씨 4도의 다중 튜브 회전기에 16시간 동안 그대로 두십시오. 용해물을 준비하려면 세포 스크레이퍼를 사용하여 형질 주입된 HEK293T 세포를 층류 후드 아래에서 긁어냅니다. 그런 다음 세포 현탁액을 2ml 마이크로분리 튜브로 옮깁니다.다음으로, 세포 현탁액을 1, 500g에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 pH 7.2로 유지되는 1x 인산염 완충 식염수에 세포 펠릿을 용해시킵니다. 잔류 매체가 없는 펠릿을 얻기 위해 원심분리 과정을 반복합니다.원심분리가 끝나면 펠릿을 얼음 위에 빠르게 옮깁니다. 다음으로, 신선한 세포 용해 완충액을 준비합니다. 완충액을 준비한 후 260마이크로리터의 완전한 세포 용해 완충액을 마이크로분리 튜브의 샘플에 추가합니다.균질한 현탁액을 위해 세포 펠릿을 여러 번 피펫으로 만듭니다. 세포를 용해하려면 섭씨 80도에서 10-15분 동안 튜브를 배양합니다. 그런 다음 세포를 얼음 위에 두십시오.섭씨 4도의 탁상용 원심분리기에서 5분 동안 16, 000g에서 원심분리 과정을 반복합니다. 원심분리 후 용해액이 함유된 상등액을 멸균 1.7ml 마이크로분리 튜브에 넣고 얼음 위에 옮기고 펠릿을 배출합니다. 상층액에 5몰 염화나트륨을 첨가하여 최종 농도 1어금니를 얻습니다.먼저 풀다운 세척 버퍼를 준비합니다. 비드 차단 후 하룻밤 배양 후 자석 비드가 들어 있는 튜브를 2분 동안 자석에 옮깁니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오.구슬에 150마이크로리터의 얼음처럼 차가운 풀다운 세척 버퍼를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 15초 동안 구슬을 소용돌이칩니다. 그리고 즉시 실온에서 30-60초 동안 배양합니다.1분 후 자석에 자성 구슬이 들어 있는 튜브를 2분 동안 옮깁니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 그런 다음 300마이크로리터의 완전한 풀다운 세척 버퍼에 비드를 다시 매달아 놓습니다.염화나트륨을 첨가한 후 300마이크로리터의 세포 용해물을 300마이크로리터의 비드로 채워진 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 한 시간 동안 너트 믹서에 그대로 두십시오. 한 시간 후 자석의 튜브를 5분 동안 옮깁니다.배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 다음으로, 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 완전 풀다운 세척 버퍼를 비드에 추가합니다. 버퍼를 추가한 후 실온에서 15초 동안 비드를 와류로 가열합니다.그런 다음 튜브를 자석에 5분 동안 놓습니다. 배양 기간이 지나면 상등액을 폐기하십시오. 그런 다음 뉴클레아제가 없는 물 100마이크로리터에 비드를 녹여 얼음에 보관합니다.비드에서 전체 RNA를 분리합니다. 그런 다음 25마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 분리된 RNA를 용해시킵니다. 다음으로, 분광 광도계에서 RNA의 농도를 측정합니다.마지막으로, 마이크로리터당 50나노그램에서 RNA의 작업 원료 용액을 준비합니다. 다음으로, 총 분리된 RNA 50나노그램을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 상보적 DNA를 합성합니다. 그런 다음 올리고 프라이머를 최종 부피 20마이크로리터에 추가합니다.PCR 튜브를 써모사이클러에 놓고 실행을 시작합니다. qPCR이 완료된 후 플레이트의 각 웰에 9마이크로리터의 PCR 반응 혼합물을 옮깁니다. 각 웰에 1마이크로리터의 보상 DNA를 추가하여 최종 부피 10마이크로리터를 얻습니다.다음으로, 내열 PCR 플레이트 씰러를 사용하여 PCR 플레이트를 밀봉하고 열순환기에 로드합니다. 그런 다음 thermocycler에서 프로그램을 시작합니다. miR-125b의 표적을 검증하기 위해 PARP-1 및 p53의 표적 mRNA의 발현 수준을 연구합니다.흥미롭게도, PARP-1 및 p53 mRNA의 발현 수준은 음성 대조군인 Actin mRNA보다 비교적 높습니다. 실험에 사용된 다른 음성 대조군은 템플릿이 없으며 3개의 프라임 비오틴화 스크램블 염기서열입니다. 또한, 정량화된 PARP-1 및 p53의 3개의 프라임 미번역 영역도 다양한 수준의 증폭을 보여줍니다.이는 Actin, 템플릿 없음, 3개의 프라임 비오틴화 스크램블 염기서열과 같은 음성 대조군과 비교됩니다. PARP-1 및 p53의 이러한 증폭은 이들이 세포 miR-125b의 강력한 표적임을 나타냅니다. 일단 숙달되면, 세포의 도금에서 시작하여 비오틴 표지된 LNA 모방체의 형질 주입 및 PCR 분석으로 마무리하는 이 기술은 적절하게 수행될 경우 일주일 이내에 완료할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 포유류 세포에서 추정되는 mRNA 표적을 검증하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이는 포유류 세포에서 3개의 프라임 비오틴 태그가 지정된 잠금 핵산 모방 기반 transfection을 도입함으로써 높은 특이성과 낮은 노이즈 비율로 달성할 수 있습니다. RNA, 특히 마이크로 RNA와 같은 작은 RNA로 작업하는 것은 매우 민감하고 분해되기 쉽다는 것을 잊지 마십시오.따라서 이 분석을 수행하는 동안 뉴클레아제가 없는 물, 뉴클레아제가 없는 마이크로분리 튜브 및 멸균 완충액의 사용과 같은 필요한 예방 조치를 취해야 하며, 더 나은 감도와 더 나은 결과를 얻기 위해 이 분석을 수행하는 동안 새로 준비된 완충액 및 시약을 고려해야 합니다.

biotin-based-pulldown-assay-to-validate-mrna-targets-cellular

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 다양한 생물 학적 과정에서 역할을 보여왔다. 더 miRNA - UTR의 상호 작용을 이해하기 위해서, 우리는 소설 루시페라제 유전자와 분석 시약, LightSwitch 시스템과 결합하여 3 UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

3' 미번역 영역(3'UTR)(3'LIFE)에서 기능 요소의 발광 식별은 miRNA 또는 기타 조절 요인에 의한 3'UTR의 기능 조절을 식별하는 기술입니다. 이 프로토콜은 96-well transfection 및 luciferase assay와 같은 고처리량 방법론을 활용하여 기능적 억제에 대한 수백 개의 추정 상호 작용을 스크리닝합니다.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

본 연구에서는 관심 있는 전사 인자를 표적으로 하는 작은 헤어핀(sh)RNA로 세포를 transfection한 후 공개적으로 사용 가능한 데이터, 계산 리소스 및 microRNA 어레이의 높은 처리량 데이터를 사용하여 microRNA 전사체에 대한 전사 인자의 영향을 연구하는 전략을 제안합니다.

마이크로 RNA 전 사체 (Transcriptome)의 전사 인자 종속 규정을 설명

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

이 RNA 풀 다운 메서드 오래 비 코딩 RNA (lncRNA)의 RNA 목표를 식별 수 있습니다. 집에서 만든, 설계 방지 감각 DNA oligonucleotide 프로브는 적절 하 게 고정 된 조직 또는 세포 라인에이 lncRNA에 교 잡에 따라, 효율적으로 수 있습니다는 lncRNA의 모든 RNA 대상의 캡처를.

오래 비 코딩 RNA의 RNA 표적 식별에 RNA 풀 다운 절차

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

여기에서는 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고 2) 완전히 자동화되어 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다.

미르머신: 식물 miRNA 주석을 위한 원스톱 상점

우리는 네 개의 플라스미드를 가진 시험관 내에서 세포에서 사용되는 인트로닉 마이크로RNA 생물발생 리포터 어세이를 개발하였다: 하나는 인트로닉 miRNA를 가지고 있고, 하나는 표적을 가지고 있고, 다른 하나는 조절 단백질을 과발현하기 위해, 다른 하나는 레닐라 루시페라제이다. miRNA를 처리하고, 표적 서열에 결합함으로써 루시퍼라제 발현을 조절할 수 있었다.

포유류 세포에서 인트로닉 마이크로RNA 성숙을 분석하기 위한 리포터 분석

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 생합성 바이오틴화 LNA 기반 miRNA 미믹을 활용한 mRNA 풀 다운 방법으로 세포 내 miRNA의 mRNA 표적을 검증하는 기술입니다. 이 방법은 높은 특이성과 안정성으로 microRNA 생물학 및 치료제 개발 연구에 기여합니다.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

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