막 거 대 한 소포 지역화 된 칼슘 이온 기울기에 대 한 응답에서의 개장

우리는 국부적인 칼슘 이온 구배를 사용하여 거대 소포를 조작하는 기술을 제시합니다. 이 기술의 주요 장점은 소포 표면의 완전 비접촉식 자극과 칼슘 이온과의 상호 작용에 따라 리모델링되는 지질막의 직접적인 시각화입니다. 우리의 접근 방식은 칼슘 이온 막 상호 작용의 세부 사항을 다루는 방법을 도입하여 세포 미세 환경의 변화에 따라 세포막이 재형성되는 메커니즘을 연구할 수 있는 새로운 장소를 제공합니다.

이 절차를 시작하려면 클로로포름의 지질 용액을 준비하십시오. 클로로포름에서 지질의 최종 농도는 밀리리터당 1밀리그램이고 최종 질량은 0.6밀리그램입니다. 지질 혼합물이 들어 있는 유리 바이알을 금속 호일로 감싸 주변광으로부터 내용물을 보호합니다.

금속 호일로 포장된 샘플 바이알을 유리 비커 안에 넣습니다. 클로로포름을 제거하려면 80rpm에서 7킬로파스칼 진공에 도달하는 압력으로 회전 증발기에서 3시간 동안 용매를 증발시킵니다. 건조 지질 필름은 증발 후 유리 바이알의 바닥에 형성됩니다.

600마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 건조된 지질 필름 위에 천천히 추가합니다. 완충액을 첨가한 후, 6마이크로리터의 글리세롤을 부드럽게 첨가하여 다층 소포 또는 GUV-MLV에 연결된 거대한 단층 소포가 형성되는 동안 샘플이 완전히 탈수되는 것을 방지합니다. 파라필름을 사용하여 유리 바이알을 밀봉합니다.

그리고 주변 광으로부터 보호하기 위해 금속 호일로 덮으십시오. 바이알을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날, 용액이 들어있는 유리 바이알을 실온에서 초음파 수조를 사용하여 1 분 동안 초음파 처리합니다.

파라필름을 제거하고 시각적으로 균일한 작은 지질 소포 용액이 형성될 때까지 피펫을 만듭니다. 얻어진 작은 지질 소포 용액의 30 마이크로 리터를 개별 0.5 밀리리터 플라스틱 튜브에 분취합니다. 작은 지질 소포의 동결된 현탁액의 분취액이 들어 있는 플라스틱 튜브를 실온에서 해동합니다.

최대 속도로 와류 믹서를 사용하여 1-2초 동안 튜브를 4번 소용돌이칩니다. 5마이크로리터의 작은 지질 소포 현탁액을 유리 커버 슬립의 표면에 놓고 작고 둥근 물방울을 형성합니다. 사전 세척 단계 없이 유리 커버슬립을 사용하십시오.

이제 유리 커버슬립을 진공 건조기에 20분 동안 넣습니다. 건조된 지질막을 실온에서 4분간 보관합니다. 그런 다음 재수화를 위해 건조 지질 필름 위에 50 마이크로 리터의 10 밀리 몰 HEPES 완충액을 천천히 피펫팅합니다.

GUV-MLV 복합체가 형성될 때까지 5분 정도 기다립니다. 현미경의 무대 중앙에 유리 커버슬립을 놓습니다. 그런 다음 300 마이크로 리터의 HEPES 버퍼를 피펫으로 만들고 물방울의 중심을 대물렌즈 위에 놓습니다.

50 마이크로 리터의 미리 형성된 GUV-MLV 용액을 HEPES 용액으로 옮깁니다. 드문드문 형성된 GUV-MLV 복합체가 유리 커버슬립 표면에 단단히 부착될 때까지 25분 동안 기다립니다. 마이크로피펫 홀더에 부착하는 동안 마이크로피펫이 파손되는 것을 방지하기 위해 모세관 끝을 촛불의 불꽃에 부드럽게 넣어 붕규산 유리 모세관의 가장자리를 둥글게 만듭니다.

자동 레이저 풀러를 사용하여 최소 3개의 유리 모세관을 당깁니다. 본문에 언급된 붕규산 유리 모세관을 사용하여 직경이 약 0.3미크론인 팁 개구부를 가진 마이크로피펫을 만듭니다. 피펫 팁이 막히지 않도록 사용하기 전에 0.2-0.5 미크론 주사기 필터를 사용하여 HEPES 버퍼 용액에 5 밀리몰 염화칼슘 용액을 여과하십시오.

그런 다음 Microloader를 사용하여 각 마이크로피펫에 8마이크로리터의 염화칼슘 용액을 다시 채웁니다. 마이크로피펫 홀더를 마이크로매니퓰레이터에 연결합니다. 마이크로피펫을 마이크로피펫 홀더에 단단히 장착합니다.

그런 다음 공급 튜브를 사용하여 주입 펌프와 모세관 홀더를 연결합니다. 주입 펌프를 시작한 후 주입 펌프의 설정을 20헥토파스칼 주입 압력으로 조정합니다. 또한 5개의 헥토파스칼 보상 압력을 설정합니다.

현미경을 명시야 모드로 설정합니다. 미분 간섭 대비를 위해 구성합니다. 거친 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 GUV-MLV 복합체가 포함된 액적 위에 놓습니다.

대물렌즈 위에 있는 마이크로피펫의 끝을 찾고 거친 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 물방울까지 가져옵니다. 현미경을 형광 모드로 설정합니다. 마이크로피펫 팁을 멤브레인 표면에서 3미크론 거리에 배치하는 동시에 마이크로피펫에서 염화칼슘 용액을 주입하여 MTP가 형성되도록 합니다.

GUV 표면을 따라 MTPS를 이동하려면 미세 미세 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 GUV 표면 주위로 천천히 움직입니다. 칼슘 이온 주입을 계속하면서 GUV 표면과 마이크로피펫 팁 사이의 거리를 거의 동일하게 유지합니다. 미세 주입을 중지하려면 주입 펌프를 끄십시오.

유리 커버슬립 표면에 고정된 GUV-MLV 복합체의 대표적인 형광 현미경 이미지가 여기에 나와 있습니다. GUV 표면에서 칼슘 이온의 국소 주입 시 생성된 멤브레인 세뇨관 돌출부를 이 이미지에서 볼 수 있습니다. 화살표로 표시된 대로 멤브레인 표면 주위의 마이크로피펫 팁의 이동은 칼슘 이온 공급원 방향으로 멤브레인 튜브형 돌출부의 움직임을 트리거합니다.

요약하자면, 우리는 칼슘 이온으로 국부적인 자극에 따라 막 세뇨관 돌출부를 형성하는 결과를 낳은 거대 지질 소포의 비접촉식 막 리모델링을 허용하는 기술을 제안합니다. 이 방법의 향후 응용 분야에는 합성 지질 소포에서 천연 생물학적 막으로의 전환 또는 비접촉식 미세 조작 플랫폼 개발을 목적으로 이 접근 방식을 고분자 시스템에 적용하는 것이 포함됩니다.