Name: 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 배우세요 메다카 뇌-뇌하수체 조각을 이용한 뇌세포 전기생리학 분석 방법을. Oryzias latipes에서 뇌하수체 세포의 활동 전위와 GnRH 반응을 연구하여 신경내분비 기능을 규명할 수 있습니다.

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우리 양 LourdesCarreon G 탄 메 다카 시설을 유지 하는 그녀의 도움 및 안토니 Peltier 설명 그림에 대 한 감사 합니다. 이 작품은 노르웨이의 연구 위원회, 보조금 번호 244461 (양식 프로그램) 및 248828 (디지털 라이프 노르웨이 프로그램)와 NMBU에 의해 투자 되었다.

처리 하는 모든 동물 생명 과학의 고 승인된 수 사관의 감독 하에 간호와 노르웨이 대학에서 연구 동물의 복지에 대 한 권고에 따라 수행 되었다.
1입니다. 기기 및 솔루션의 준비
참고: 모든 솔루션 살 균 해야 합니다. 주의 산도를 신중 하 게 공부 종의 extracellular 환경에 적응 해야 합니다 모든 솔루션의 osmolality (osmol/kg 물) 주어져야 한다. pH와 osmolality 조정 되어야 한다 pH 미터, 어는 점 osmometer 등 정밀 전자 장비와 각각.
<ol><li>
확인 없이 캘리포니아2 + 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL (Ca2 + 무료 EC): 150 mM NaCl, KCl, 1.3 m m MgCl2, 5mm 4mm 포도 당, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>4.38 g의 NaCl, KCl, MgCl2, 360.32 mg의 포도 당 및 초순의 450 ml HEPES의 1.19 g 61.89 mg 186.37 mg 해산 (0.055 미국 / 25 ° C에서 cm, 18.2 MOhm 저항력) H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
여분-셀룰러 솔루션 (EC)의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA와 EC)으로 여분-셀룰러 솔루션의 500 mL 확인: 150 mM NaCl, 5 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.3 m m MgCl2, 포도 당 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>NaCl의 4.38 g, KCl의 186.37 mg, CaCl2의 147.01 mg, MgCl2의 61.89 mg, 360.32 밀리 그램의 포도 당 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에는 450 ml에서 HEPES의 1.19 g 용 해.</li>
		<li>NaOH와 7.75에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 마 니 톨과 290-300 mOsm을 조정 합니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독. 50 mg BSA를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포내 솔루션 (IC)의 250 mL 확인: 110mm 코, 20 m KCl, 10mm Hepes, m 20 m m 자당.
	<ol>
<li>1.54 g 코, KCl의 327.75 mg, HEPES의 595.75 mg 및 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 450 mL에 자당의 1.712 g 용 해.</li>
		<li>(N-morpholino) 탄 sulfonic (MES) 산 7.2에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>250 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 250 mL까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		<li>osmolality 측정 하기 전에 솔루션을 믹스. 280-290 mOsm (EC 보다 낮은 10 mOsm) 자당으로 조정 됩니다. 필터 물 진공 시스템 및 0.2 µ m 필터를 사용 하 여 솔루션을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>캘리포니아2 + 및 BSA 무료 EC 2% 낮은 녹는 agarose 용액 100 mL를 만들기 (캘리포니아2 + 의 100 mL에 낮은 녹는 agarose의 2 세대 무료 EC). 전자 레인지를 사용 하 여 녹이 고 40 ° c.에 물 욕조에 녹아 agarose를 배치 그것은 진정 하자 조직에 사용 하기 전에 40 ° C를 도달할 때까지. 참고: EC, 캘리포니아2 + 무료 EC 저장 될 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 면 살 균 및 IC 솔루션-20 ° C에서 몇 달 동안. Agarose 4 ° C에서 1 주 동안 저장 될 수 있다 고 짧게 microwaving에 의해 3-5 시간을 다시 사용할 수 있습니다. 과도 한 재사용 agarose 및 소금 농도 품질의 증발 및 이어질 것입니다.</li>
	<li>
한 다리를 만들:
	<ol>
<li>열 (마약과) 2 m m 외부 직경 7.5 m m 긴 붕 규 산 유리 모 세관 그리고 안쪽 직경 (아이디) 1.16 m m는 초점에 분 젠 버너를 사용 하 여 지점 약 1/3 한쪽에서 유리 구 부를 시작할 때까지. 불꽃에서 유리를 제거 하 고 유리 (그림 2A) 약 120도의 각도 벤드를 허용.</li>
		<li>포도 당, 전자 레인지를 사용 하 여 없이 하 고는 agarose는 액체 채우기 미리 만든된 유리 주입구를 사용 하 여 모 세관 액체 유리의 끝 중 하나를 삽입 하 고 몇 분 동안 대기에 의해 강제로 하는 동안 정상적인 ec 2 %agar 녹여. 포도 당 없이 EC에서 4 ° C에서 사용까지 다리를 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>적당 한 피 펫 끌어당기는 사람을 사용 하 여 필 라 멘 트 패치 펫으로 붕 규 산 유리를 준비 합니다. 원하는 전극 저항을 얻기 위해 피 펫 끌어당기는 설명서를 참조 하십시오. 참고: 피펫으로의 테이퍼 가능한 한 짧게 해야 합니다. 짧은 피 펫 테이퍼 당기 단계 4-6을 사용 하 여 이루어집니다. 전극 저항 셀 크기에 따라 2, 6 m ω 사이 이어야 한다.</li>
	<li>
피하기 위해 패치 클램프 실험 동안 조직 운동의 borate 버퍼에서 polyethylenimine (페이)의 0.1%와 녹음 실의 표면 코트.
	<ol>
<li>Borate 버퍼 (25 m m)의 500 mL를 준비:<ol>
<li>나2B4O710 H2O 450 ml에서의 초순 H2O 자석 교 반기를 사용 하 여 유리 비 커에 4.768 g을 분해.</li>
			<li>HCl와 8.4에 pH를 조정 합니다.</li>
			<li>500 mL 부피 플라스 크에 솔루션을 전송 합니다. 500 mL과 0.2 µ m 필터 소독 물 진공 시스템을 사용 하 여 솔루션까지 초순 H2O로 부피 플라스 크를 채우십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>최종 사용을 위한 10 µ L borate 버퍼의 100 µ L에서 재고 솔루션 1%의 희석으로 페이 (49 mL 25mm borate 버퍼에 1 mL 50% 페이)와 0.1% 페이 희석 1% 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>슬라이스 소유자의 유리에 0.1% 페이의 2 개 mL를 추가 하 고 1 분 동안 품 어 코팅을 하자. 짧게 초순 H2O의 5 mL로 두 번 유리 세척 그리고 사용까지 건조 공기.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
암포 B 솔루션을 준비 합니다.
	<ol>
<li>빛 으로부터 보호 1 mL 튜브에 50 µ L 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 암포 B 가루 3 mg를 용 해 하 여 60 mg/mL 재고 솔루션을 확인 합니다. 30 최대 속도로 소용돌이 s와 15 분 균질 sonicate. -20 ° C에서 3-5 튜브에 aliquots를 저장 하 고 하루 한 약 수를 사용 합니다. 참고: 경우 암포 B 재고 솔루션은 명확 하 고 노란색 색 하지만 밀키 (여전히 노란색) 15-20 분 쥡니다 후 확인 새로운 재고 솔루션.</li>
		<li>10 mL 용량 보다 더 깨끗 한 유리 비 커에 IC의 2 개 mL를 pipetting으로 암포 b IC 솔루션을 확인 합니다. 피 펫 솔루션으로 암포 B 재고 솔루션의 8 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 혼합. 사용까지 얼음에 알루미늄 호 일 및 장소 비 커를 포장 하 고 그것에 게 모든 3 h를 갱신.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 해 부 및 Vibratome와 슬라이스
<ol><li>해 부, 전에 해 부 도구 준비 등 날카로운 하나 하나의 강한 집게가 위. 에탄올 (조직 홀더, 브러시, 집게) 도구를 청소 하 고는 사용 해 부 목적 으로만 고정된 조직 접촉 결코 다는 것을 확인. 오염을 피하기 위하여 별도 상자에 그들을 유지.</li>
	<li>1 분에 대 한 차가운 얼음 물에 물고기 안락사</li>
	<li>
후속 단계에 따라 신속 하 게 날카로운 집게 (를 사용 하 여 더 이상 3 분)와 메 다카 뇌와 뇌를 해 부.
	<ol>
<li>물고기와 함께 들고 강한 집게 심각한 눈 뒤에 2 개의 시 신경이 위로 while 또는 날카로운 집게.</li>
		<li>강력한 집게로 단계적으로 두개골 뼈를 파괴 함으로써 뒷부분에서 앞쪽 측면 두개골의 등 쪽 부분을 엽니다.</li>
		<li>강력한 집게로 한쪽에 두개골을 벗기다.</li>
		<li>심한이 위 또는 날카로운 집게와 척수.</li>
		<li>부드럽게, 척수는 집게로 잡아, 앞쪽에 후부에서 뇌를 플립 하 고 접시는 차가운 캘리포니아2 + 무료 적와 장소</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체 agarose와 1.5-2 cm3 금속 몰드를 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>바로 전에 agarose 굳은 (약 25-30 ° C)에서 부드럽게 뇌 척수는 집게로 잡아, 괜 찮 아 요 종이의 조각으로 겸 건조와 agarose에 조직을 넣어. EC는 조직 주위 왼쪽의 흔적을 희석 하 고 조직 찾으시는 agarose 견고까지 몇 초 동안 얼음에 형을 하자 agarose는 신속 하 게 혼합. 참고: 그것은 빨리이 단계에 대 한 필수적입니다. agarose은 신속 하 게 얼음에 의해 금속 금형 냉각으로 굳은 것 이다.</li>
	<li>메스 칼 날 조직을 포함 하는 agarose의 정사각형 블록을 트림 하 고 수술 (무 독성) 접착제를 사용 하 여 vibratome 견본 홀더에 접착제.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 캘리포니아2 + 무료 적으로 표본 (뇌-뇌 하 수 체) 홀더를 받는 vibratome의 베트를 채우기</li>
	<li>vibratome로 견본 홀더를 놓고는 단면에 대 한 높은 주파수와 낮은 속도 사용 하 여 150 µ m의 parasagittal 섹션을 agarose 블록을 잘라. 선택한 섹션을 수집 하 고 차가운 캘리포니아2 + 무료 적의 3 mL와 패치 클램프 기록 챔버에 배치</li>
	<li>조직 섹션에 그리드 하프 (그림 2B)를 놓습니다. 참고: 하프 것 이다 코팅 함께 조직 안정화 및 패치 클램프 기록 하는 동안 이동에서 그것을 방지.</li>
	<li>거문고 자리에 후에, 캘리포니아2 + 일반 EC 및 BSA에 Ca2 + 무료 EC 매체를 변경 합니다. 10 분에 대 한 조직의 나머지를 보자.</li>
</ol>3. 천공 패치 클램프 및 Electrophysiological 녹음
<ol><li>실험을 시작 하기 전에 다음 단계에 의해 전극 와이어 염화는: 첫째, 좋은 샌드 페이퍼 (p180)을 사용 하 여 실버 와이어 전극을 청소. 둘째, 2 mL, 70% 에탄올으로 씻어. 셋째, 2 mL, 10 분 동안 2-5% 염소에에서 와이어를 찍어. 마지막으로, 린스 2 mL, 초순 H2o.</li>
	<li>10 X 목표를 사용 하 여 대상 영역 (뇌) 현미경 단계 뇌-뇌 하 수 체 조각으로 녹음 실 에서도 찾아서 40 X 목표를 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 참고: 성공적으로 준비 되 면 거의 라운드 셀 표시 되어야 합니다. 이러한 둥근 세포는 조직에서 분리는 일반적으로 손상 된 세포입니다.</li>
	<li>2% 한 천의 다리를 통해 접지 전극을 EC 욕조에 놓습니다.</li>
	<li>40 X 목표를 사용 하 여 건강 한 세포를 찾습니다. 참고: 건강 한 셀 해야 될 단단히 조직 조각에 연결 된 및 하지 고 조각에서 분리.</li>
	<li>전압 클램프 (VC;에 앰프를 설정 그림 4A 포인트 1) 모드. 오픈 인감 테스트 창과 언론 목욕 구성 (그림 4B 포인트 1과 2. 5 mV 펄스를 사용 하 여 피 펫 저항 (그림 4B 포인트 3) 모니터링.</li>
	<li>백필 암포 b 마이크로 필러 주사기를 사용 하 여 IC 솔루션을 추가 하기 전에 항진균 무료 IC 솔루션 패치 피 펫의 끝 ( 그림 3참조).</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 패치 피 펫에 약간 긍정적인 공기 압력을 추가 합니다. 참고: 이것은 팁의 오염을 방지 하는 패치 피 펫에서 작은 액체 흐름.</li>
	<li>일단 목욕, 패치 피펫은 저항을 평가 하 고 아무 입자 (그림 4C) 피 펫의 끝에 연결 된 ㄴ 다는 것을 확인 키를 누릅니다. 참고: 테이프의 작은 조각은 비디오 녹화 형태 보기의 필드를 표시 하는 모니터에 부착 되어. 이것은의 위치 셀 기준으로 패치 피펫으로 쉽게 때 목표 하지 셀에 초점을 맞추고 있습니다.</li>
	<li>Micromanipulators를 사용 하 여 셀 아래로 패치 피 펫 가이드. 참고: 피펫으로 작은 입자는 피 펫의 끝에 연결 된 수를 찾아 깨끗 한는 다는 것을 확인 하십시오. 저항에 급격 한 변화는 피 펫 팁에 갇혀 입자의 결과 영향을 수도 있습니다.</li>
	<li>때 몇 가지 피 펫을 재조정 미크론 셀 위에 그림 5와 같이 피 펫의 끝 셀 셀의 중간에서 1/3를 터치 것입니다. 셀을 만질 때 압력을 놓고 인감을 만들기 위해 부드러운 흡입을 적용. 참고: 패치 피 펫에서 시간 성공적인 목욕을 입력 인감을 가능한 한 짧게 유지 되어야 한다. 1-1.5 분 이상 목욕으로 피 펫 누설의 끝을 도달 하는 암포 B를 피하기 위하여.</li>
	<li>즉시 패치 클램프 소프트웨어 (그림 4 D 포인트 1) 패치 창으로 전환 하 고-50,-60 mV (그림 4D 포인트 2) 사이의 지주 잠재력 합니다. 제로 아웃 빠른 정전 용량 유리 피 펫 (그림 4D 점 3)으로 구성.</li>
	<li>패치 클램프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 1과 2)에 셀 창으로 전환 하 고 액세스 저항, Ra, 창에 표시 됩니다 모니터링을 시작 합니다. 충분 한 액세스 후 앰프 소프트웨어 (4E 그림 포인트 3)에서 막 용량 밖으로 0. 참고: 충분 한 액세스 10 ~ 30 분 (4E 그림 포인트 2) 걸릴 수 있습니다. 현재 클램프 녹음에 대 한 좋은 액세스 20 M 미만 이어야 합니다.</li>
	<li>전류 클램프, IC, 앰프 소프트웨어 창 (그림 4 층 포인트 1)에서 전환 합니다. 3.12은 같은 값을 앰프 소프트웨어 (4 층 그림 포인트 2, 3) -클램프 창에서 빠른 용량 성 전류를 조정 합니다. 막 잠재력 (4 층 그림 포인트 1)를 확인 합니다. 참고: 중요 한 것은, 막 잠재력은 얕은 경우 (-35 위의 일반적인 mV) 세포를 손상 될 수 있습니다. 녹음/녹화를 취소 하 고 새 셀을 찾을.</li>
	<li>건강 한 세포를 찾는 후 (막-40 아래 잠재적으로 조직에 단단히 부착 된 mV), 제조 업체의 프로토콜 33,34에 설명된대로 실험 녹음을 시작.</li>
</ol>

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저자 공개할 게 없다

뇌-뇌 하 수 체 조각에 패치 클램프 기법을 사용 하 여 electrophysiological 녹음 주의 최적화가 필요 합니다. 특히 teleosts에서에서 라이브 셀 조사 수행을 위한 최적화 되 프로토콜 대부분 포유류 시스템 기반 프로토콜을 사용 하 여 발행물의 제한 됩니다. 이와 관련, 그것은 중요 한 사실을 pH 및 osmolality 같은 여러 생리 적 매개 변수 종류가 뿐만 아니라 종속, 하지만 또한 매우 여부 유기 체에 살고 땅에 또는 물에 의존. 물고기, 그것은 또한 필요한 계정, 바다 또는 민물 환경에서 사는 경우입니다. 예를 들어 CO2 부분 압력 물고기 포유류에 1.7-3.4 mmHg pCO2 물고기와 포유류 36에서 40-46 mmHg pCO2 레벨에 비해 훨씬 낮습니다. 이에 따라, 우리는 7.75 37,38</s...

뇌 하 수 체는 척추 동물 시상 아래 위치 하 고 광학 chiasm에 후부 키 내 분 비 기관 이다. 그것은 생성 하 고 특정 세포 유형에서 6 ~ 8 호르몬을 secretes. 뇌 하 수 체 호르몬 두뇌와 주변 장기 사이의 중간을 구성 하며 다양 한 성장, 재생산, 그리고 항상성의 규칙을 포함 하 여 필수적인 생리 적 프로세스를 드라이브 합니다. 유사한 신경 세포는 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포는 활동 전위를 자발적으로 발사 하는 기능으로 전기 고르기 1. 이 활동 전위의 역할은 종속 셀. 포유류의 뇌 하 수 체의 여러 세포 유형에서 활동 전위 수 상승 세포내 캘리포니아2 + 2호르몬 지속적인된 출시에 대 한 충분 합니다. 또한,는 뇌 세포 3,4,,56막 잠재력에 영향을 미치는 뇌에서 stimulatory와 금지 정보를 받습니다. 일반적으로, 물질로 입력은 흥분을 증가 하 고 자주 세포내 상점에서 캘리포니아2 + 의 출시를 포함 뿐만 아니라 발사 주파수 7증가. 셀 이온 채널 구성 활용 방법과 뇌에서 이러한 입력된 신호에 맞게 이해 이해 호르몬 합성 및 릴리스의 열쇠입니다.
패치 클램프 기술 Sakmann 및 정치학자 8,,910 에 의해 1970 년대 후반에 개발 되었고 더 해 밀 11, 개선 셀 electrophysiological 속성의 상세한 조사를 허용 하 고 단일 이온 채널 아래로 또한, 기술은 공부 하는 전류와 전압에 대 한 사용할 수 있습니다. 오늘, 패치 클램핑 셀의 electrophysiological 속성을 측정 하기 위한 황금 표준입니다. 단단한 물개 패치 클램프 기술의 4 개의 주요 구성 되어 개발된 11; 셀 연결 된 내부, 외부 아웃을 전체 셀 패치. 3 첫 번째 구성 단일 이온 채널 수사를 위해 일반적으로 사용 됩니다. 4, 다음 셀 연결 구성에 대 한 세포 막에 구멍 하위 대기 압력을 사용 하 여 이루어집니다. 이 구성에는 또한 12전체 세포 이온 채널 구성의 조사 수 있습니다. 그러나,이 기술의 한 가지 제한 세포질 분자는 패치 피 펫 솔루션 13 그림 1(A), 따라서 공부 셀의 전기 및 생리 적인 응답에 영향을 미치는 희석 하는. 사실, 그 분자의 일부 신호 변환 또는 다른 이온 채널의 규칙에서 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다. 이 방지 하려면 린다 우와 페르난데스 14 방법을 개발 기 공 형성 화합물 패치 피 펫에 추가 됩니다. 셀 연결 된 구성에 따라 화합물 패치 아래 플라즈마 막으로 통합 하 고 천천히 cytosol (그림 1B)와 전기 접촉을 만드는 막 구멍. Nystatin 15 와 암포 B 16, 같은 여러 다른 antifungals 또는 사포닌 베타-escin 17,18 같은 계면 활성 제를 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물 생성 여러차례 양이온 및 Cl- 고분자 및 캘리포니아2 + 15와 같은 더 큰 이온의 cytosolic 레벨을 유지 하면서는 cytosol와 패치 피펫으로 사이 보급 수 있도록 충분히 큰 모 공 16.
구멍이 패치를 사용 하 여의 전에 잠재적으로 높은 직렬 저항입니다. 직렬 저항 (Rs) 또는 액세스 저항 결합 된 저항 지상 기준으로 패치 피 펫 이다. 패치 클램프 기록 하는 동안 Rs 막 저항 병행에서 될 것입니다 (Rm). Rm 그리고 Rs 전압 분배기로 병렬 작업에. 높은 Rs, 전압 기록에서 오류를 주는 Rs 이상 떨어질 것 이다. 오류 기록 큰 해류와 더 큰 될 것입니다. 또한, 전압 분배기 주파수 의존 따라서 시간적 해상도 영향을 미치는 로우-패스 필터 만들기 이기도 합니다. 사실상 구멍이 패치 항상 수 없습니다 크고 빠른 해류의 같은 전압 문이 나+ 전류 (에 대 한 자세한 읽기 참조 19참조). 또한, Rs 패치 클램프 기록, 다시 기록 된 전류에 변화를 선도 하는 동안 달라질 수 있습니다. 따라서, 가양성 Rs 약물 응용 프로그램 하는 동안 변경 하는 경우에 발생할 수 있습니다.
슬라이스 조직에 전기 생리학 20뇌 뉴런의 electrophysiological 특성 연구 앤더슨 연구소에 의해 처음 도입 되었다. 기술은 더 그대로 환경에서 세포-세포 통신 및 셀 회로 서 단일 셀의 상세한 수사에 대 한 방법을 포장. 뇌 조각을 만들기 위한 유사한 기술 Guérineau 그 외 여러분 에 의해 1998 년에 도입 되었다 그러나 21., 그것은 그의 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스 준비 teleost 22패치 클램프 연구 성공적으로 사용 되었다 2005 년 전에. 이 연구에서 저자는 또한 구멍이 패치 클램프 기록의 사용을 보고 했다. 그러나, 지금까지, 대부분의 뇌 세포의 electrophysiological 조사 실시 되었습니다 포유류, 그리고 teleost 물고기 1,,222,23 포함 하 여 다른 척추 동물의 소수에서 . Teleosts에 거의 모든 연구에 수행 기본 해리 셀 24,25,26,,2728,29,30 .
현재 신문에서 우리 모델 물고기 메 다카에서 건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각의 준비를 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 접근 기본 천연된 세포 배양에 비해 몇 가지 장점을 나타냅니다. 첫째, 세포 해리 세포 문화 조건에 비해 상대적으로 보존된 환경에 기록 됩니다. 둘째, 슬라이스 준비 공부는 해리 셀 문화 조건에 불가능-셀 통신 22, 중재 하는 간접 경로 수 있습니다. 또한, 기 공 형성 요원으로 암포 b 천공된 전체 셀 패치 클램프 기법을 사용 하 여 얻은 조직 조각에 electrophysiological 녹음을 수행 하는 방법을 보여 줍니다.
메 다카는 작은 민물고기 아시아, 주로 일본에서 발견 이다. 메 다카의 유전학, 발생 학, 생리학 광범위 하 게 연구 100 년 31, 그리고 그것은 많은 실험실에서 일반적으로 사용 되 연구 모델. 이 종이에 특별 한 중요성의 teleost 물고기에 시상 하 부-뇌 하 수 체 복합물의 독특한 형태학 조직 이다: 포유류와 조류 hypothalamic 뉴런 릴리스 그들의 신경-호르몬 뇌 하 수 체 내 분 비 세포를 조절 하는 반면 중간 예 하의 포털 시스템으로 hypothalamic 뉴런 teleost 물고기 32에서 뇌 하 수 체의 내 분 비 세포의 직접적인 긴장 투영이입니다. 따라서, 물고기, 잘 보존 된 뇌-뇌 하 수 체 네트워크에 뇌 세포와 특히 어떻게 뇌 세포의 electrophysiological 특성을 조사할 수 있는 특별 한 중요성의 이다 신중 하 게 실시 뇌-뇌 하 수 체 부 러 뜨 리 그들의 흥분을 제어 함으로써 캘리포니아2 + 항상성.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgical glue</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond 티슈 접착제</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 블레이드</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>금속 금형</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>스틸 하프</td><td>워너 악기</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>초순수 LMP 아가로스</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>패치 피펫</td><td>셔터 기기</td><td>BF150-110-10HP</td><td>붕규산염(필라멘트 포함) O.D.:1.5mm, I.D.:1.10mm</td></tr><tr><td>현미경 Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>소프트웨어</td></tr><tr><td>디지타이저 Digidata 1550A1</td><td>분자 장치</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>증폭기 Multiclap 700B 헤드스테이지 CV-7B</td><td>분자 장치</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH trifluoroacetate salt&nbsp;</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>기공 형성 항생제</td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI 솔루션</td></tr><tr><td>마이크로파일러 주사기</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>유리 한천 다리</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>붕규산염(필라멘트 포함): 2.0mm, I.D.: 1.16mm Fire polished</td></tr><tr><td>Micro-Manager 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>오픈 소스 현미경 소프트웨어</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS 카메라</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>Elma</td><td>D-7700 단일</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-포도당</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>수크로오스</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-만니톨</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-산</td><td>시그마</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 teleost 물고기에 뇌 세포의 electrophysiological 조사에 대 한

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

뇌 세포의 electrophysiological 조사 다 척 추가 있는 종, 하지만 거의 teleost 물고기에 실시 되었습니다. 이 중, 분명 대다수 해리 1 차 셀에 수행 되었습니다. 어떻게 teleost 뇌 세포에 대 한 우리의 이해를 개선, 더 많은 생물학 관련 환경에서 작동,이 프로토콜에는 작은 민물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 가능한 뇌-뇌 하 수 체 슬라이스를 준비 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌-뇌 하 수 체 조각 만들기, pH 및 모든 솔루션의 osmolality 25 ~ 28 ° c.에 사는 민물 물고기의 체액에서 발견 하는 값을 조정 했다 조각 준비, 다음 프로토콜 electrophysiological 녹음 천공된 전체 셀 패치-클램프 기술을 사용 하 여 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 패치 클램프 기술 전례 없는 시간적 해상도와 감도, 단일 이온 채널 아래로 그대로 전체 세포에서 전기적 특성의 조사를 수 있도록 강력한 도구입니다. 세포내 환경 그대로에서 패치 피 펫 전극 솔루션에 의해 희석되는 cytosol에서 규제 요소를 방지를 유지에 구멍이 패치는 고유 합니다. 대조적으로, 전통적인 전체 셀 녹화를 수행할 때 메 다카 뇌 세포 신속 하 게 활동 전위를 발사 하는 그들의 기능을 잃고 관찰 되었다. 다양 한 기 공 기술을 사용할 수 있는, 중이 프로토콜 암포 B. 살 균 제를 사용 하 여 패치 막의 천공을 달성 하는 방법을 보여 줍니다.

이 프로토콜 어디 대상 세포 (Lh 생산 gonadotropes) 한 메 다카 유전자 변형 라인 [Tg (lhb-hrGfpII)]를 사용 하 여 뇌 하 수 체 (gonadotrope) 셀에서 안정적인 electrophysiological 녹음을 달성 하는 방법의 단계 프로토콜을 보여 줍니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 됩니다.
처음, electrophysiological 조사 전체 셀 구성을 사용 하 여 실시 했다. 그러나, 자발적인 활동 전위 되지 공부 셀에서 관찰 되었다. 셀의 하위 집합에서 활동 전위-50,-60 mV (그림 6) 사이 휴식 잠재력에서 작은 현재 주사 (5-9 pA)를 사용 하 여 발생 수 있습니다. 이 활동 전위를 빨리 마칠 수 있어 졌고 약 4-6 분 후 트리...

설명 하는 최적화 된 프로토콜을 electrophysiological 녹음으로 패치 클램프 기술을 사용 하 여 뇌 세포의 뒤에 가능한 뇌-뇌 하 수 체 조직을 조각, teleost 물고기 메 다카 (Oryzias latipes)를 사용 하 여 만들기는 구멍이 패치 구성입니다.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

이 방법은 신경 내분비학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 뇌하수체 세포는 어떻게 소통하고 뇌에서 방출 인자에 반응합니까? 이 기술의 주요 장점은 이 첫 번째 1차 세포 배양과 비교하여 이 절차를 통해 보다 온전한 환경에서 세포를 조사할 수 있다는 것입니다.이 방법은 Medaka에서 황체 형성 호르몬 생산 세포의 전기적 특성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 약간의 조정만으로 다른 세포 유형이나 다른 물고기 종에도 사용할 수 있습니다. 에탄올이 살균된 강력한 집게가 든 안락사된 텔레오스트 물고기를 해부 현미경으로 들고 날카로운 집게로 눈 뒤의 두 시신경을 절단하고 두개골 뼈를 후방에서 전방으로 부러뜨립니다.집게를 사용하여 두개골을 벗겨내고 척수를 절단합니다. 겸자로 척수를 부드럽게 잡으면 뇌가 후방에서 전방 방향으로 뒤집히고 장기를 얼음처럼 차갑고 칼슘이 없는 여분의 세포 매체로 채워진 접시에 넣습니다. 다음으로 1 점, 5 내지 2 입방체 센티미터 금속 홀드에 액체 아가로스를 채우고 얼음 위에 곰팡이를 놓습니다.아가로스가 굳기 직전에 집게를 사용하여 척수로 뇌를 부드럽게 집어 올리고 실험지로 집게를 말린 다음 뇌를 아가로스에 넣습니다. 그런 다음 아가로스를 빠르게 혼합하여 조직에 남아 있는 여분의 세포 매체의 흔적을 희석하고 필요에 따라 곰팡이 내에서 뇌의 방향을 조정합니다. 아가로스가 응고되면 메스 날을 사용하여 조직 주위의 정사각형 아가로스 블록을 자르고 수술용 접착제를 사용하여 샘플을 비브라톰 표본 홀더에 부착합니다.비브라톰 홀더의 큐벳을 얼음처럼 차갑고 칼슘이 없는 엑스트라 셀룰러 배지로 채우고 홀더를 비브라톰에 놓습니다. 고주파 및 저속을 사용하여 아가로스 블록을 절단하여 150마이크로미터 부심상 절편을 만들고, 선택한 절편을 3밀리리터의 얼음처럼 차갑고 칼슘이 없는 추가 세포 용액이 들어 있는 패치 클램프 기록 챔버에 넣습니다. 성형된 아가로스에 너무 오래 방치하면 조직이 건조해지고 절단되기 전에 공기에 대한 접근이 제한되기 때문에 뇌가 아가로스에 추가되면 신속하게 움직이는 것이 중요합니다.모든 절편을 얻었을 때, 조직 절편에 격자 하프를 놓고 칼슘이 없는 여분의 세포 배지를 소 혈청 알부민이 보충된 칼슘을 함유한 여분의 세포 배지로 교체합니다. 그런 다음 조직을 10분 동안 그대로 두십시오. 패치 클램프를 설정하려면 뇌 뇌하수체 절편이 있는 기록 챔버를 패치 클램프 기록 현미경 스테이지에 놓고 10X 대물렌즈를 사용하여 뇌하수체를 찾습니다.2%한천 브리지를 통해 접지 전극을 추가 세포 매체 수조에 놓고 40X 대물렌즈를 사용하여 건강한 세포를 찾습니다. 설정 ampliifier를 vol로 설정tage clamp 모드를 선택하고 씰 테스트 창을 엽니다. 수조 구성을 선택하고 5mV 펄스를 사용하여 피펫 저항을 모니터링합니다.마이크로필러 주사기를 사용하여 Amphotericin B가 보충된 세포 내 용액을 패치 피펫의 뒤쪽 부분에 추가하기 전에 패치 피펫의 끝을 항진균성 세포 내 배지로 다시 채웁니다. 1ml 주사기를 사용하여 패치 피펫에 약간 양의 공기압을 가하여 피펫 팁의 오염을 방지하고 패치 피펫 저항성을 평가합니다. 피펫 끝에 입자가 부착되지 않은 경우 미세 조작기를 사용하여 패치 피펫을 세포로 안내합니다.피펫이 셀에서 몇 미크론 위에 있을 때 피펫 끝이 셀 중앙에서 거리의 1/3 거리에 닿도록 피펫을 재조정합니다. 세포를 만지려면 압력을 해제하고 부드럽게 흡입하여 밀봉을 만듭니다. 패치 피펫 내의 양압으로 인해 세포가 약 1분 후에 항진균 용액이 누출될 수 있으므로 기가씰을 신속하게 적용하는 것이 중요합니다.씰이 제자리에 있으면 즉시 패치 클램프 소프트웨어의 패치 창으로 전환하고 유지 전위를 음의 50밀리볼트에서 음의 60밀리볼트 사이로 조정하십시오. 유리 피펫으로 구성된 빠른 커패시턴스를 제로화하고 셀 창으로 전환하여 액세스 저항 모니터링을 시작하며, 충분한 액세스 후 증폭기 소프트웨어에서 멤브레인 커패시턴스를 제로화합니다. 전류 클램프로 전환하고 I-Clamp 창에서 피펫의 빠른 용량성 전류의 올바른 값을 조정하고 결과 멤브레인 전위를 확인합니다.그런 다음 세포가 막 전위가 음의 40mV 미만인 조직에 단단히 부착된 상태에서 제조업체의 프로토콜에 따라 실험 기록을 시작합니다. 활동 전위는 음의 50 밀리 볼트와 음의 60 밀리 볼트 사이의 휴지 전위에서 5-9 피코 암페어 전류 주입을 사용하여 뇌하수체 세포의 하위 집합에서 트리거 될 수 있습니다. 이러한 활동 전위는 빠르게 소모되며 약 4-6분이 지나면 트리거된 활동 전위를 더 이상 달성할 수 없습니다.암포테리신 B를 사용하여 천공된 패치 구성으로 전환하면 기록된 세포의 약 50%에서 자발적 활동 전위를 관찰할 수 있으며 최대 1시간의 기록 후에도 관찰할 수 있는 런다운 없이 이러한 세포의 95%에서 활동 전위를 트리거할 수 있습니다. 생식선 자극 호르몬 방출 호르몬 1, 천공 패치 구성에서 세포로 분출된 퍼프는 이위상 반응을 나타내며, 그 동안 세포는 반응의 첫 번째 단계에서 과분극화되어 내부 저장소에서 칼슘 방출을 초래한 다음 세포의 탈분극이 뒤따르고 두 번째 단계에서 활동 전위 발사 빈도를 1에서 2헤르츠에서 3헤르츠로 증가시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 용액은 사용 중인 실험 유기체(이 경우 Medaka)의 생리학에 맞게 조정되어야 하며 이 값은 다른 온도에서 사는 종에 따라 다르기 때문에 pH에 특히 주의를 기울여야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을...

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

여기 우리는 전기 생리학 및 Ca2 + 이미징에 적합 한천 - 임베디드 망막 조각의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 하나 하나 presynaptic 신경 터미널 직접 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 망막 microcircuits의 리본 형태의 시냅스를 공부하실 수 있습니다.

패치 - 클램프 커패시턴스 측정 및 CA 2 +</sup망막 조각의 단일 신경 터미널에서> 영상

이 비디오에서는, 우리는 복잡한 신경 회로를 유지하는 뇌 전체 준비에서 확인 된 하나의 뉴런에서 전기 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성선 자극 호르몬 분비 호르몬 (GnRH의) 신경 세포가 유전자 손상 뇌의 준비 식별을위한 형광 단백질로 태그 된 유전자 변형 물고기를 사용합니다.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

절차는 막 전위 또는 현재 및 세포 내 칼슘 농도의 변화를 동시에 기록하는 것으로 설명됩니다. 시교차상핵 뉴런은 전체 세포 패치 클램프 구성에서 패치 클램프 전극을 사용하여 칼슘 지시자 bis-fura-2로 채워집니다.

시교차상핵 뉴런(Suprachiasmatic Nucleus Neuron)의 동시 전기생리학적 기록과 칼슘 이미징(Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons)

이 논문은 성인 제브라 피쉬는, 고정 삽관 및 녹음 및 손상 동물에서 신경 활동의 조작을 허용하는 생체 전기 생리학 실험에 사용 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

여기 우리가 준비 하 고 유지 하는 메 다카 (Oryzias latipes)에서 기본 뇌 세포 배양 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜에 최적화 된 조건을 고려 온도, osmolality, pH 등의 중요 한 매개 변수 흉내 낸 함으로써 생리 적으로 더 의미 있는 결과 물고기의 생리 적 조건에 의해.

물고기 Pituitaries에서 높은-품질 기본 세포 배양의 준비

여기에서, 우리는 측방 geniculate 핵을 포함하는 급성 두뇌 조각의 준비를 위한 프로토콜 및 망막 생성 성 및 코르티코겐iculate 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사를 제시합니다. 이 프로토콜은 동일한 급성 뇌 슬라이스에서 높은 방출 및 낮은 방출 확률로 시냅스를 연구하는 효율적인 방법을 제공합니다.

망막 생성 및 코르티코제네틸레이트 시냅스 기능의 전기 생리학적 조사

이 기사에서는 픽스 쳐에 희석 한 DiI의 심장 관류에 의해 텔 레 ost 물고기의 혈관을 라벨링 하기 위한 빠른 프로토콜을 설명 하고, 송사리를 모델로 하 고 뇌 및 뇌 하 수 체 조직에 초점을 맞추고 있습니다.

텔 레 Ost 뇌와 뇌 하 수 체에 있는 혈관의 라벨링은 DiI와 함께 심장 관류를 사용 하 여

자유롭게 수영하는 금붕어의 뇌에서 세포 외 신경 신호를 기록하기위한 새로운 무선 기술이 제시됩니다. 기록 장치는 두 개의 테트로데스, 마이크로 드라이브, 신경 데이터 로거 및 방수 케이스로 구성됩니다. 데이터 로거와 커넥터를 제외한 모든 부품은 맞춤 제작됩니다.

자유롭게 수영 물고기에서 이동 식 Tetrodes에 의해 뉴런의 무선 전기 생리적 기록

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

배우세요 메다카 뇌-뇌하수체 조각을 이용한 뇌세포 전기생리학 분석 방법을. Oryzias latipes에서 뇌하수체 세포의 활동 전위와 GnRH 반응을 연구하여 신경내분비 기능을 규명할 수 있습니다.

건강 한 뇌-뇌 하 수 체 조각 Teleost 물고기에 뇌 세포의 Electrophysiological 조사에 대 한

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