차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

이 방법은 BEST1 돌연변이의 분자 메커니즘 및 베스트로피노병증의 병리학에 대한 이온 채널 관련 망막 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간으로부터 RPE 세포를 직접 얻는 어려움을 피할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 RPE 세포가 연구 목적과 세포 대체 요법 모두에 사용될 수 있기 때문에 Best 질병을 포함한 bestrophinopathies의 치료로 확장됩니다.

hPSC 배양액이 포화도에 도달하면 배양 배지를 6웰 플레이트의 웰당 4ml의 분화 배지로 교체합니다. 2주간의 배양 후, 분화 배지에 human activin-A 100나노그램을 보충하고, 보충된 배지를 일주일에 3회 14일 동안 교체합니다. 29일째에는 색소화된 RPE 세포 클러스터가 나타날 때까지 8-10주 동안 비보충제 분화 배지로 전환합니다.

색소가 형성된 RPE 세포를 분리하려면 먼저 개별 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너의 화염 위에 수평으로 잡고 피펫의 얇은 부분 길이의 약 2/3 아래로 잡습니다. 가열된 유리가 부드러워지면 두 끝을 빠르게 당겨 피펫의 새 끝 부분에 마이크로 스크래퍼와 같은 팁을 형성합니다. 뽑은 피펫에 70% 에탄올을 뿌리고 세포 배양 후드에서 자연 건조시킵니다.

피펫이 준비되면 PBS로 분화 배양의 각 웰을 세척하고 콜라겐분해효소 마이크로리터당 1단위가 보충된 0.05% 트립신 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 20-30분 후 6웰 플레이트의 웰당 2밀리리터의 섭씨 37도 RPE 배지로 분해를 중지하고 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다. 당겨진 피펫을 사용하여 착색된 RPE 클러스터를 부드럽게 두드립니다.

세포가 웰 바닥에서 분리되는 즉시 20마이크로리터 마이크로피펫을 사용하여 해리된 세포를 RPE 배지가 포함된 새로운 세포 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 약 5, 000 RPE 세포가 12-well 플레이트의 각 웰에 추가되면 새로운 RPE 배지로 최종 부피를 최대 2ml까지 가져오고 착색된 조약돌 모양의 성숙한 RPE 세포의 단층이 관찰될 때까지 6-8주 동안 분리된 hPSC-RPE 세포를 배양합니다. 패치 클램프 24-72시간 전에 착색된 단층 세포를 PBS 2밀리리터로 세척한 다음 PBS를 제거한 후 0.05% 트립신 1밀리리터와 콜라겐분해효소 마이크로리터당 1단위를 섭씨 37도에서 8분 배양 기간 동안 12웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포에 추가합니다.

세포가 분리되기 시작하면 1ml 마이크로피펫을 사용하여 웰 바닥에서 세포를 부드럽게 씻어내고 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 섭씨 37도의 트립신-콜라겐분해효소 용액 1ml를 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 더 배양한 다음 웰 바닥에 남아 있는 세포를 씻어내고 세포 현탁액을 동일한 15ml 원뿔형 튜브에 결합합니다.

섭씨 37도의 건조 수조에서 8분 동안 세포를 배양한 다음 1밀리리터 마이크로피펫을 사용하여 세포를 10-15회 부드럽게 분쇄합니다. 세포를 두 번 더 배양 및 분쇄한 후 5ml의 섭씨 37도 RPE 배지를 단일 세포 현탁액에 첨가하고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 10-20% 포화도에서 커버 슬립이 있는 사전 코팅된 플레이트에 파종하기 위해 적절한 부피로 펠릿을 재현탁하고 표준 프로토콜에 따라 전체 세포 패치 클램프를 수행합니다.

성공적인 분리 후, 계대 제로 집단에 있는 세포의 90% 이상이 성숙하여 시그니처 RPE 세포 형태를 나타내야 합니다. hPSC-RPE 기반 Disease-in-a-dish 접근법을 사용하면 각 환자 특이적 BEST1 돌연변이의 단백질 발현, 막 수송 및 이온 채널 기능을 종합적으로 특성화하여 RPE 병리학적 메커니즘을 밝히기 위한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 일부 BEST1 돌연변이는 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있으므로 잘 확립된 다른 RPE 마커도 확인해야 합니다.

인간 만능 줄기 RPE 세포 분화는 인간 만능 줄기 세포주와 돌연변이 유형에 따라 3개월에서 6개월이 소요되며, 분화된 인간 만능 세포의 분리는 적절하게 수행될 경우 2시간 내에 완료될 수 있습니다. 패치 클램프를 위해 세포를 분할하려고 시도하는 동안 과도한 세포 사멸을 방지하기 위해 세포를 매우 부드럽게 분쇄하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 3D RPE 세포 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 RPE 세포의 정점 및 기저막의 이온 수송이 BEST1 돌연변이에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 망막 퇴행성 질환 분야의 연구자들이 환자 유래 RPE 세포의 생리학적 표현형과 병리학적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 만능 줄기 세포를 망막 색소 상피 세포로 분화하는 방법과 전체 세포 패치 클램프를 위해 RPE 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.