Name: 차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 망막 색소 상피 세포로 분화하는 방법을. BEST1 돌연변이와 bestrophinopathy 병리 메커니즘을 연구하고 세포 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

1입니다. RPE에 hPSC의 차별화
<ol><li>유지 하 고 이전18을 설명 하는 통행 hPSCs. 참고: 모든 셀 (를 포함 하 여 hPSCs와 hPSC-RPEs) 성장과 분화 프로토콜의 기간 내내 5% CO2 에서 37 ° C에서 성장 된다.</li>
	<li>
차별화, 전에 미리 코팅된 6-잘 접시에 confluent hPSCs 분할.
	<ol>
<li>플레이트 코트, 지하실 멤브레인 매트릭스 1 시간 약에 대 한 얼음에 녹여, 1시 50분에 4 ° C DMEM 매체에서 liquidized 매트릭스를 일시 중단 하려면 희석, 각 음을 800 µ L 코팅 혼합물을 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>코팅 작업이 완료 되 면 혼합물을 발음 하 고 즉시 우물에 1.5-2 mL 매체를 추가 합니다.</li>
		<li>오래 된 문화 판에서 hPSCs 해제, 실 온에서 5 분에 대 한 PBS 플러스 0.5 m m EDTA와 셀을 품 어 하 고 솔루션, 발음 문화 매체와 작은 수 풀에서 셀 resuspend.</li>
		<li>새로운 접시에 ~ 20 %confluency 종자 세포. 참고:-20 ° C에서 100 µ L aliquots에 지하실 멤브레인 매트릭스를 저장 하 고 한 약 수를 사용 하 여 6 잘 플레이트 코트. 코팅에 대 한 시간 또는 하룻밤 실 온에서 37 ° C에서 4 h까지 확장할 수 있다. 일시 중단 하 고 3-5 셀 보다는 단일 세포의 작은 수 풀으로 hPSCs 씨앗에 중요 하다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포는 성장 전체 confluency 때 차별화 매체 (4 mL/음)와 문화 매체를 대체 (표 1, activin-A). 문화, 14 일에 대 한 변화 하는 매체 (4 mL/잘) 3 배 / 주. 참고: hPSC 플레이트 밀도 복식 약 마다 24 h. 중요 한 세포 죽음 차별화 절차의 시작으로 예상 된다. 죽은 세포와 우물에서 파편의 집계는 중간 변경 시 맨 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
	<li>하루 28 일 15에서에서 100 ng/mL 인 activin-A (표 1, 인간 activin-A)와 차별화 매체를 보충. 매체 (4 mL/잘) 변경 3 x / 주.</li>
	<li>Activin-A 보충 주 29 (표 1, 인간 activin-A)에 시작을 중지 합니다. 안료 hPSC-RPE 클러스터 (그림 1A-B)이 나타날 때까지 8-10 주에 대 한 차별화 매체에 경작 하는 셀을 계속. 참고: 클러스터 색소 세포의 볼 수 있습니다 셀 문화 접시에 작은 어두운 점으로 (그림 1A-B, 톱) 육안에 의해. 서명 조약돌 모양으로 개별 안료 세포는 현미경 20 X (그림 1A-B, 아래) 볼 수 있습니다.</li>
</ol>2. 격리와 차별화 된 RPE 세포의 문화
<ol><li>차별 매체를 제거, PBS로 한 번 씻어, 0.05 %trypsin 플러스 각 음에 콜라의 1 U / µ L의 1 mL를 추가 20-30 분 제거 트립 신/콜라에 대 한 37 ° C에서 품 어 고 부드럽게 6 잘 플레이트의 각 음에 미리 따뜻하게 RPE 매체의 2 개 mL를 추가 (< c0 > 표 2). 참고: 다각형 트립 신/콜라 치료 하기 전에, hPSC-RPE 세포의 형태를 모니터링 하는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 충분 한 소화 후 라운드 되 고.</li>
	<li>
당겨 유리 펫 파스퇴르 분 젠 버너를 사용 합니다.
	<ol>
<li>두 손으로 잡고 오래 (9 인치) 파스퇴르 피 펫 수평, 그래서 양쪽 끝에 분 젠 버너 위에 피 펫의 얇은 부분의 길이를 약 2/3.</li>
		<li>일단 유리는 불꽃에서 부드러운 되 고, 신속 하 게 당겨 두 끝 떨어져, 마이크로 스 크레이 퍼 같은 팁은 피 펫 (그림 2)의 새로운 끝에 형성 되도록 합니다.</li>
		<li>여러 "셀 기구"를 만드는 데 여러 번 반복 합니다. 가져온된 펫 살 균에 대 한 70% 에탄올 스프레이 하 고 셀 문화 후드에 그들을 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
현미경, 마이크로 "셀 스 크레이 퍼"를 사용 하 여 부드럽게 분리 접시에서 안료 hPSC-RPE 클러스터를.
	<ol>
<li>부드럽게 탭 (긁어 하지 않습니다) 직접 색소 세포에는 플 로트 것입니다 최대 문화 매체에 일단 그들이 우물의 바닥에서 해리.</li>
		<li>즉시 사용 하 여 20 µ L micropipette 부드럽게 해리 hPSC-RPE 세포를 흡입 하 고 RPE 중간24미리 코팅된 6 잘 플레이트에 그들을 전송.</li>
		<li>미리 코팅 12-잘 접시의 단계 2.3.1–2.3.2 필요에 따라 여러 번 반복 하 여 각 5 ~ 103 셀 (~ 10% confluency 20 X 현미경 관찰) 배를 수집 합니다. 2 mL에 매체의 최종 볼륨을 가져와. 참고: 해리 hPSC-RPE를 방지 하기 위해 부동에서 셀, 하지 마십시오 플레이트의 움직임을 분리 과정에서 천연된 셀 매체에 떠 있지만 여전히 로컬 집중 유지 되도록.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RPE 매체 안료 단층 (그림 1C)을 형성 있도록 또 다른 6-8 주 동안에 12-잘 접시에 문화 새로 격리 hPSC-RPE 세포 (P0)</li>
	<li>3 매체 변경 x / 주. 매체를 변경할 때 기존 매체의 약 1/3 볼륨에 각 잘 두고 신선한, 미리 데워 진 RPE 매체의 2/3 볼륨 추가. 이 단계에서 12-잘 접시에 각 잘 RPE 매체의 2 mL을 사용 (따라서, 중간의 1.3 mL 때마다를 교환). 참고: P0 hPSC-RPE 세포의 단층 지붕, 셀 적극적으로 체액을 운반 하 고 단단한 접속점25에 의해 정박 제안 양식 수 있습니다. 따라서, 돔 형성 RPE 상태 성숙의 지표 이다.</li>
</ol>3. RPE Immunoblotting 운명 유효성 검사
<ol><li>확인 hPSC-RPE 세포 lysate 가수분해 억제 물 보충 포유류 단백질 추출 버퍼를 사용 하 여 칵테일. 소화 세포 파편을 삭제 하도록 4 ° C에서 15 분 13000 x g 에서 원심 분리 하기 전에 30 분 동안 얼음에 세포 lysate를 품 어. Lysate의 총 단백질 농도 측정 합니다.</li>
	<li>변성 40 75 ° C에서 Laemmli SDS 샘플 버퍼에 총 단백질의 µ g 단백질을 분리 하는 10 분에 대 한 샘플에 15 분 및 염료 앞에 도달 될 때까지 다음 150 V 90 V의 정 전압에서 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 젤의 하단.</li>
	<li>100 V 1 h 10% 메탄올 보충 사전 냉각된 트리 스-글리신 버퍼에 니트로 막에 단백질을 전송 합니다.</li>
	<li>0.1% 비 이온 세제 (TBST)와 실 온에서 1 h 5% 비 지방 건조 우유 염 분 Tris 버퍼에 막을 차단 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 블로킹 버퍼에 하룻밤 희석 주 항 체를 막 품 어. 다음과 같이 RPE 특정 마커 단백질을 대상으로 하는 항 체 희석: RPE65, 1:1, 000; CRALBP, 1:1, 000; BEST1의 1:1, 000 Β-말라 로드 컨트롤을 검색 하는 1:10,000에서 β-걸에 대 한 항 체 희석.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 3 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>마우스로 fluorophore 활용된 염소 항 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 IgG 이차 항 체 희석 1:10,000 막 품 어.</li>
	<li>각 세척에 대 일 분으로 TBST 4 시간 막 씻으십시오.</li>
	<li>이미징 시스템 (그림 3)는 적외선을 사용 하 여 단백질을 감지 합니다.</li>
</ol>4. 검사 Immunostaining에 의해 BEST1 Subcellular 지 방화
<ol><li>2 mL PBS의 hPSC-RPE 세포를 한 번 세척 하 고 실 온에서 45 분 동안 4% paraformaldehyde 2 mL에 수정.</li>
	<li>두 번, 2 mL의 PBS로 세척 하 고 2 mL PBS의 0.1% 비 이온 계면 활성 제 및 2% 당나귀 세럼 45 분 비 특정 바인딩 사이트 차단와 함께 셀을 품 어.</li>
	<li>BEST1 항 체 (1: 200 희석) 실 온에서 2 h에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>셀 2 mL PBS 3 번을 씻는 다. 함께 품 어 fluorophore 활용 보조 IgG (1:1, 000) 실 온에서 1 h.</li>
	<li>씻어 2 mL PBS 3 번 언바운드 이차 항 체를 제거 하.</li>
	<li>Confocal 현미경 검사 법 (그림 4)에 의해 스테인드 세포를 관찰 합니다.</li>
</ol>5. 녹음 캘리포니아2 +-hPSC-RPE 전체 셀 패치 클램프에 의해에 종속 Cl- 전류
<ol><li>패치 클램프 전에 24-72 h (조약돌 모양의 안료)는 완전히 confluent 잘 (12-잘 접시)에 성숙한 P0 hPSC-RPE 세포의 분할. PBS와 중간, 세척 한 번 발음 하 고 우물에 0.05 %trypsin 플러스 1 U / µ L 콜라의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 사전 사용 하기 바로 전에 37 ° C에 트립 신/콜라 따뜻한.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C에서 품 어. 참고:이 단계 후 hPSC-RPE 세포는 여전히 부착 연결.</li>
	<li>1 mL micropipette 부드럽게 세척 접시, 떨어져 세포를 사용 하 여 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 소화 혼합물에 셀을 전송. 잔여 세포를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 결합을 미리 데워 트립 신/콜라의 1 mL와 잘을 씻는 다. 참고: hPSC RPE 세포는이 시점에서 여전히 큰 덩어리에서. 활기찬 pipetting으로 셀 덩어리를 휴식 하지 마십시오. 일부 덩어리 1 mL 팁의 내부 벽에 충실 수 있습니다.</li>
	<li>8 분 동안 37 ° C 건조 욕조에 원뿔 튜브를 품 어.</li>
	<li>10-15 회 소화 믹스 1 mL micropipette 위아래 부드럽게 피 펫을 사용 합니다. 참고: 셀 덩어리 훨씬 작은 하지만 여전히 표시 된다. 활기찬 pipetting 하지 마십시오.</li>
	<li>위의 두 단계를 반복 합니다. 참고: 셀의 대부분 pipetting 후 단일 셀에 있어야 한다. 여전히 사용할 수 있습니다 몇 가지 작은 세포 덩어리 수 있습니다. 선택 사항: 추가 5 분 뒤에 부드러운 pipetting 37 ° C에서 원뿔 튜브 품 어. 37 ° C에서 트립 신/콜라에 총 시간 30 분 (8 + 8 + 8 + 5 = 29)을 넘지 말아야 한다.</li>
	<li>소화 셀을 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브를 미리 데워 RPE 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 수집을 5 분 동안 200 x g 에서 회전 합니다. 10-20 %confluency 미리 코팅된 35mm 요리에 다시 일시 중단 하 고 씨 셀 (예를 들어, 100% 10 %confluency 대 한 5 개의 35mm 요리 12-잘 접시에 confluent). 참고: 항상 피할 활기찬 pipetting 원심 분리 후에 상쾌한에 명백한 어두운 세포 파편에 의해 표현 되는 중요 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. 잘 분리 된 단일 셀 시드 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다.</li>
	<li>수행 하는 전체 셀 패치 클램프18,26,,2728,29,30,31위에서 설명한 대로. 취득 단계 잠재력의 가정에서 현재 추적 (-100 + 100 0의 지주 잠재력에서 뮤직 비디오 mV) (그림 5). 참고: 내부 및 외부 솔루션의 조리법에 대해서는 표 3 과 표 4, 각각.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

HPSCs는 RPE BEST1에 대 한 올바른 세포 계보에 질병을 일으키는 돌연변이와 차별화 하는 질병--요리에 접근에 대 한 가장 중요 한 절차가입니다. 따라서, 각 분화 실험 후 결과 hPSC RPE 세포 확인 되어야 합니다 신중 하 게 그들의 성숙 상태에 대 한 RPE 특정 형태학 및 단백질 마커16,,1718. 클론 유물을 최소화 하려면 동일한 환자에서 여러 hiPSC 클론 또는 동일한 돌연변이와 여러 hESC 클론 사용 해야 가능.
HiPSC와 hESC 라인을 모두 동일한 프로토콜 RPE에 분화 될 수 있다. hiPSCs 또는 BEST1 유전자에 돌연변이 없이 BEST1 환자 또는 건강 한 기증자의 피부 섬유 아 세포에서 각각 재설정 될 수 있습니다. BEST1 돌연변이 베...

그것은 적어도 5 망막 퇴행 성 질환 BEST1 유전자1,2,3,4,,56 유전자 변이 의해 발생 하는 문서화 되었습니다. , 7 , 8, 200, 여전히 증가에 이미 보고 된 돌연변이의 숫자와 함께. 이러한 BEST1-관련된 질병, 일컬어 bestrophinopathies, 진보적인 시력 손실과 심지어 실명, 원인과 현재 효과적인 치료법 없습니다. BEST1, 즉 BESTROPHIN1의 단백질 제품 (BEST1)는 캘리포니아2 +-활성화 된 Cl- 채널 (CaCC) 눈5,6, 망막 안료 상피 (RPE)에서 구체적으로 표현 8,9. BEST1의 중요 한 것은, 임상 표현 형-관련된 질병은 빛 자극, 라이트 피크 (LP) electrooculogram10,11; 측정 이라고 감소 시각적 반응입니다 LP는 RPE12,,1314CaCC에 의해 중재 될 여겨진다. 더 나은 BEST1 돌연변이의 병 적인 메커니즘을 이해 하 고 잠재적인 치료 쪽으로 작동, 돌연변이 BEST1 채널 endogenously 인간의 RPE 세포에 표현 공부를 필수적입니다.
그러나, RPE 취득 라이브 환자에서 직접 셀 아니다 매우 실용적인. 네이티브 RPE 세포 인간의 시신과 태아의 생 검에서 수확 수 있습니다, 비록 어려운 접근성이이 소스에는 크게 과학 연구를 제한 합니다. 따라서, 그것은 대체 RPE 자사 인간의 눈을 중요입니다. 이 전화 기능 RPE 세포 이제 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs), 배아 줄기 세포 (hESCs)를 포함 하 여에서 분화 될 수 있다 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs), 후자로 줄기 세포 기술에 있는 최근 전진에 의해 응답 되어 기본 피부 섬유 아 세포 기증자16,,1718에서 프로그래밍에 의해 생성 되 고. 자체-갱신 및 hPSCs의 pluripotency hiPSCs의 환자의 특이성 및 게놈 수정 잠재력 (예를들면, CRISPR에 의해) hESCs의 다양 한 요리에 질병 모델을 제공 하는 동안 RPEs, 생성 하는 신뢰할 수 있는 소스를 확인 하는 중요 한 것은, 원하는 BEST1 돌연변이.
hPSC-RPE 쥐 RPE 모델에 몇몇 이점이 있다: 1) BEST1 녹아웃 마우스 어떤 망막 이상19, 생쥐와 인간; 사이 BEST1 RPE에의 다른 유전 요구의 가능성을 높이 나타나지 않습니다 2)의 3% 인간 RPE 세포는 쥐20; 35% 달리 binucleate 3) hiPSC-RPE potentiates 임상 헌 이식 망막의 치료 장애21. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델은 여전히 라이브 시스템에 RPE 생리학과 병리학 공부를 위한 불가결 하 고 hiPSC의 종양 가능성을 간과할 수 없습니다.
여기 절차 RPE 차별화 프로토콜 연구 및 임상 목적을 위해 사용 될 수 있는 유용 하 고 비교적 간단한 hPSC을 설명 합니다. 이 프로토콜 니코틴 (비타민 B3)를 사용 하 여 더 치료 activin-a에 의해 RPE로 분화를 유도 신경 조직에 hPSCs의 증가 니코틴 치료가 보여왔다 색소 세포 (RPE로 차별화의 기호)를 증가 시킬 가능성이 셀22차별화의 apoptotic 활동을 약하게 하 여. 결과 hPSC RPE 세포 네이티브 인간의 RPE 세포22로 동일한 키 마커, 조약돌 형태학 및 세포 기능을 표시합니다. 따라서, 연구 설정에서 결과 hPSC RPE 세포는 immunoblotting, immunostaining, 및 자세한 실험 절차는 또한 제공 하는 전체 셀 패치 클램프를 포함 한 다운스트림 기능 분석에 적합 합니다. 임상, RPE 세포 줄기 세포에서 파생 된 동물 연구와 인체 실험23황 반 변성의 이식 치료를 위한 큰 잠재력을 보여왔다.

<table><tbody><tr><td>녹아웃(KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO 혈청 대체품</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>인간 액티빈-A</td><td>페프로테크</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (변형)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 보충제</td><td>시그마-알드리치</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>글루타민-페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>하이드로 코르티손</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>트리 요오도 - 티로닌</td><td>: 시그마 - 알드리치</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>: 5850</td><td></td></tr><tr><td>마트리겔</td><td>코닝</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER 포유류 단백질 추출 시약</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP 항체</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 패치 클램프 앰프</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>패치마스터</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: best1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

병 적인 메커니즘 BEST1 공부에 대 한 좋은 vivo에서 모델의 부족 때문에 주로 애매 남아 있지만 인간의 BEST1 유전자에 200 개 이상의 유전자 변이 발견 되었고 망막 퇴행 성 질환에 연결, 그리고 생리 적인 조건 하에서 그것의 돌연변이입니다. BEST1 인코딩하는 이온 채널, 즉 BESTROPHIN1는 기능 (BEST1), 망막 안료 상피 (RPE); 그러나, 네이티브 인간의 RPE 세포에 매우 제한 된 접근성 과학 연구에 대 한 큰 도전을 나타냅니다. 이 프로토콜 BEST1 질병 유발 돌연변이 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)에서 유도 분화에 의해 베어링 인간의 RPEs를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이 이렇게 연구자 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 다양 한 실험 분석에 대 한 hPSC RPEs의 지속적인 소스를 있으며 따라서에 대 한 매우 강력한 접시에 질병 모델을 제공 합니다 hPSCs 자동 재생으로 BEST1-망막 조건 관련. 특히,이 전략은 RPE (patho) 생리학과 RPE에 기본적으로 표현 하는 관심의 다른 유전자 연구에 적용할 수 있습니다.

가장 기술적으로 도전적인 단계는 차별화 된 P0 hPSC-RPE 인구의 높은 순도 달성 하는 것을 목표로 수동 격리 합니다. 성공적인 격리 후 &gt; 90% 셀 P0 인구에서 성장 하 고 서명 RPE 형태학 (그림 1C) 표시를 성숙. 비 RPE 또는 P0 인구에 미숙한 RPE 세포의 작은 부분의 존재 거의 불가피 하지만 간섭 하지 않습니다 다운스트림 실험으로 안료와 조약돌 모양의 hPSC-RPE 세포의 수는 압도 대다수입니다.
HPSC-RPE 기반으로 질병에서 요리 방식으로 각 환자 별 BEST1 돌연변이 종합적 특징이 vivo에서 그것의 단백질 식 (immunoblotting, ...

여기 선물이 베어링 환자 파생 된 돌연변이 인간 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 분화 하는 프로토콜. 돌연변이 세포 라인 immunoblotting, 면역 형광 검사, 패치 클램프 등 기능 분석에 대 한 사용할 수 있습니다. 이 질병에서 요리 방법 circumvents 네이티브 인간의 RPE 세포를 얻기의 어려움.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

이 방법은 BEST1 돌연변이의 분자 메커니즘 및 베스트로피노병증의 병리학에 대한 이온 채널 관련 망막 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간으로부터 RPE 세포를 직접 얻는 어려움을 피할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 의미는 RPE 세포가 연구 목적과 세포 대체 요법 모두에 사용될 수 있기 때문에 Best 질병을 포함한 bestrophinopathies의 치료로 확장됩니다.hPSC 배양액이 포화도에 도달하면 배양 배지를 6웰 플레이트의 웰당 4ml의 분화 배지로 교체합니다. 2주간의 배양 후, 분화 배지에 human activin-A 100나노그램을 보충하고, 보충된 배지를 일주일에 3회 14일 동안 교체합니다. 29일째에는 색소화된 RPE 세포 클러스터가 나타날 때까지 8-10주 동안 비보충제 분화 배지로 전환합니다.색소가 형성된 RPE 세포를 분리하려면 먼저 개별 9인치 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너의 화염 위에 수평으로 잡고 피펫의 얇은 부분 길이의 약 2/3 아래로 잡습니다. 가열된 유리가 부드러워지면 두 끝을 빠르게 당겨 피펫의 새 끝 부분에 마이크로 스크래퍼와 같은 팁을 형성합니다. 뽑은 피펫에 70% 에탄올을 뿌리고 세포 배양 후드에서 자연 건조시킵니다.피펫이 준비되면 PBS로 분화 배양의 각 웰을 세척하고 콜라겐분해효소 마이크로리터당 1단위가 보충된 0.05% 트립신 1밀리리터를 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 20-30분 후 6웰 플레이트의 웰당 2밀리리터의 섭씨 37도 RPE 배지로 분해를 중지하고 플레이트를 현미경 스테이지에 놓습니다. 당겨진 피펫을 사용하여 착색된 RPE 클러스터를 부드럽게 두드립니다.세포가 웰 바닥에서 분리되는 즉시 20마이크로리터 마이크로피펫을 사용하여 해리된 세포를 RPE 배지가 포함된 새로운 세포 배양 플레이트의 개별 웰로 옮깁니다. 약 5, 000 RPE 세포가 12-well 플레이트의 각 웰에 추가되면 새로운 RPE 배지로 최종 부피를 최대 2ml까지 가져오고 착색된 조약돌 모양의 성숙한 RPE 세포의 단층이 관찰될 때까지 6-8주 동안 분리된 hPSC-RPE 세포를 배양합니다. 패치 클램프 24-72시간 전에 착색된 단층 세포를 PBS 2밀리리터로 세척한 다음 PBS를 제거한 후 0.05% 트립신 1밀리리터와 콜라겐분해효소 마이크로리터당 1단위를 섭씨 37도에서 8분 배양 기간 동안 12웰 플레이트의 각 웰에 있는 세포에 추가합니다.세포가 분리되기 시작하면 1ml 마이크로피펫을 사용하여 웰 바닥에서 세포를 부드럽게 씻어내고 세포 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. 섭씨 37도의 트립신-콜라겐분해효소 용액 1ml를 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 8분 더 배양한 다음 웰 바닥에 남아 있는 세포를 씻어내고 세포 현탁액을 동일한 15ml 원뿔형 튜브에 결합합니다.섭씨 37도의 건조 수조에서 8분 동안 세포를 배양한 다음 1밀리리터 마이크로피펫을 사용하여 세포를 10-15회 부드럽게 분쇄합니다. 세포를 두 번 더 배양 및 분쇄한 후 5ml의 섭씨 37도 RPE 배지를 단일 세포 현탁액에 첨가하고 원심분리로 세포를 펠릿화합니다. 10-20% 포화도에서 커버 슬립이 있는 사전 코팅된 플레이트에 파종하기 위해 적절한 부피로 펠릿을 재현탁하고 표준 프로토콜에 따라 전체 세포 패치 클램프를 수행합니다.성공적인 분리 후, 계대 제로 집단에 있는 세포의 90% 이상이 성숙하여 시그니처 RPE 세포 형태를 나타내야 합니다. hPSC-RPE 기반 Disease-in-a-dish 접근법을 사용하면 각 환자 특이적 BEST1 돌연변이의 단백질 발현, 막 수송 및 이온 채널 기능을 종합적으로 특성화하여 RPE 병리학적 메커니즘을 밝히기 위한 중요한 정보를 얻을 수 있습니다. 일부 BEST1 돌연변이는 단백질 발현에 영향을 미칠 수 있으므로 잘 확립된 다른 RPE 마커도 확인해야 합니다.인간 만능 줄기 RPE 세포 분화는 인간 만능 줄기 세포주와 돌연변이 유형에 따라 3개월에서 6개월이 소요되며, 분화된 인간 만능 세포의 분리는 적절하게 수행될 경우 2시간 내에 완료될 수 있습니다. 패치 클램프를 위해 세포를 분할하려고 시도하는 동안 과도한 세포 사멸을 방지하기 위해 세포를 매우 부드럽게 분쇄하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 3D RPE 세포 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 RPE 세포의 정점 및 기저막의 이온 수송이 BEST1 돌연변이에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다.개발 후 이 기술은 망막 퇴행성 질환 분야의 연구자들이 환자 유래 RPE 세포의 생리학적 표현형과 병리학적 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 만능 줄기 세포를 망막 색소 상피 세포로 분화하는 방법과 전체 세포 패치 클램프를 위해 RPE 세포를 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

우리는 형태, 생리, 극성, 그리고 성인 기본 조직의 단백질과 유전자 발현 패턴을 전시 인간 태아의 망막 색소 상피 세포 (hfRPE) 세포의 culturing 합류 monolayers에 대한 재현성 방법을 제공합니다. 이 작품은 여러 가지 안과 질환의 동물 모델로 확장되었습니다.

망막 안료 상피 생리학과 Pathophysiology 연구를위한 실험 모델

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

이 프로토콜 pluripotent 줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하 여 성장 인자와 작은 분자의 조합 분화 줄기 세포의 미 숙 RPE로 14 일에 성숙, 기능 RPE 3 개월 후.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

이 프로토콜의 목표는 노인 또는 병에 걸리는 인간 Bruch의 막에 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 경작을 설명. 이 메서드는 손상 된 세포 외 매트릭스에 RPE 세포 행동 공부에 적합.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

비인간 영장류 (NHP)는 해부학적 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 망막 세포 치료법을 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 원고는 NHP 눈의 망막 색소 상피 세포의 피하 학적 이식 방법과 황반 조작과 관련된 수술 내 합병증을 방지하기위한 전략을 설명합니다.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 단계적으로 분리하기위한 단순화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에는 마우스 눈의 핵 제거 및 해부, RPE 세포의 분리, 파종 및 배양이 포함됩니다.

일차 마우스 망막 색소 상피 세포의 분리

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

마우스 모델은 망막 색소 상피(RPE)의 생물학을 조사하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 마우스가 일련의 RPE 병리를 개발할 수 있다는 것이 확인되었습니다. 여기에서는 빛, 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 마우스의 RPE 병리를 설명하고 정량화하는 표현형 프로토콜을 설명합니다.

연령 관련 황반변성의 마우스 모델에서 망막 색소 상피 병리를 평가하고 정량화하기 위한 프로토콜

여기에서는 생리학적 산소 상태에서 mRNA의 5' 캡을 결합하는 번역 시작 인자를 분석하기 위한 인간 세포 배양 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 아가로스 연결 m7GTP 캡 아날로그를 사용하며 캡 결합 인자 및 이들의 상호 작용 파트너를 조사하는 데 적합합니다.

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

학습하세요 인간 다능성 줄기세포에서 망막 색소 상피 세포로 분화하는 방법을. BEST1 돌연변이와 bestrophinopathy 병리 메커니즘을 연구하고 세포 치료법 개발에 활용할 수 있습니다.

차별화, 유지 보수, 및 인간 망막 안료 상피 세포의 분석: BEST1 돌연변이 대 한 접시에 질병 모델

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