Name: 정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 학습하세요 인간 유도만능줄기세포(iPSC)에서 망막 오가노이드와 색소상피세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 망막 질환의 재생의학 연구와 줄기세포 치료 개발에 중요한 도구를 제공합니다.

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저자는 그들의 중요 한 독서에 대 한 여기에 설명 된 방법 및 G. Gagliardi M. Garita의 설치 하는 동안 그들의 입력에 대 한 Goureau의 팀의 일원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), 망막 프랑스 협회와 기술 이전 회사 SATT Lutech. 그것은 또한 Investissements d'Avenir 프로그램 (ANR-11-IDEX-0004-02) 내에서 ANR에서 지 원하는 LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65)의 프레임에서 수행 되었다.

이 문서에 설명 된 프로토콜 인 라 드 비전의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인 드 라 비전 현재 프랑스 규칙에 따르면 인간의 표본 조작을 허용 되었습니다. 표본 처리는 "위원회 회의 드 보호 des Personnes (CPP) Ile-de-France V의" 윤리적인 승인 후 헬싱키의 신조에 따라 환자 데이터 보호 및 국가 규정을 따른다.
1입니다. 문화 미디어 및 요리 준비
<ol><li>
문화 미디어
	<ol>
<li>IPSC 매체, 피더 무료 조건16pluripotent 줄기 세포 문화에 전념 화학적으로 정의 된 매체를 사용 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 매체의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>사용 기저 iPSC (Bi) 매체는 iPSC 화학적으로 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 또는 변형 시키는 성장 인자 Beta (TGFß) 없이 매체를 정의합니다.</li>
		<li>1% n 2 보충 (BiN2 매체), 보충 하는 양방향 매체의 500 mL를 준비, 페니실린과 스의 10 mg/mL의 10 단위/mL.</li>
		<li>Proneural n 2 기반 매체 (ProN2 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산, 1% n 2 보충, 페니실린, 10 단위/mL 고 10 mg/mL 스의 구성의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>Proneural B27 기반 매체 (ProB27 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산의 구성 준비, 2 %B27 보충, 페니실린의 10 단위/mL와 10 mg/mL의 스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 선박 준비
	<ol>
<li>
인간의 iPSC 문화에 대 한
		<ol>
<li>1 x PBS에 vitronectin의 5 μ g/mL를 포함 하는 vitronectin 솔루션의 10 mL를 준비 합니다. 1 x PBS의 10 ml, 해 동된 vitronectin 재고 솔루션 (100 x) 100 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>0.5 µ g/c m2에 해당 하는 6 cm 문화 접시 당 vitronectin 솔루션의 2 개 mL를 배포 합니다. 실 온 (RT)에서 1 시간을 위해 그것을 품 어. 포부 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 vitronectin 솔루션을 제거 합니다.</li>
			<li>6 cm 접시 당 iPSC 매체의 4 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>사용 하기 전에 30 분의 최소 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 요리를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPSC 파생 RPE (hiRPE) 세포 문화에 대 한</li>
		<li>만능 줄기 세포 자격 매트릭스 또는 기판에 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 웰 스 코트. 충분 한 매트릭스 또는 기판 전체 성장 표면 영역을 커버를 추가 합니다. 예를 들어 잘 24-잘 접시와 T-25 cm2 플라스 크에 매트릭스의 3 mL 당 매트릭스의 300 µ L를 넣어.</li>
		<li>37 ° c.에서 1 h의 최소 코팅된 문화 혈관을 품 어 진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 매트릭스를 제거 합니다.</li>
		<li>24-잘 접시에 잘 당 ProN2 매체의 1 mL을 추가 하 고 따뜻하고 매체 equilibrate 30 분의 최소 인큐베이터에 문화 선박을 반환 합니다. T-25 cm2 플라스 크, 단계 5.2 참조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유지 보수 및 확장의 인간의 Ipsc
<ol><li>
인간의 Ipsc의 유지 보수
	<ol>
<li>15 mL 튜브에서 iPSC 매체의 3 mL를 준비 하 고 사용 하기 전에 15 분의 최소 RT에서 그것을 유지. 1.2.1에 설명 된 대로 코팅된 6 cm 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>액체 질소 탱크 나는-150 ° C 냉동 고에서 인간의 Ipsc의 극저온 샘플 30 37 ° C에서 물 욕조에 부 화에 의해 해 동 s.</li>
		<li>신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병 소독. 실시간에서 미리 예 열 하는 iPSC 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에는 cryotube에서 해 동된 인간의 Ipsc를 전송</li>
		<li>원심 분리기 튜브 110 x g에서 3 분에 대 한 포부는 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>IPSC 2 mL 피 펫을 사용 하 여 6 cm 문화 vitronectin 코팅 접시에서 매체의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 다시 접시에 셀을 전송. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: 10 µ M에 Y-27632 등 록 억제제 apoptosis를 줄이기 위해 6 cm 문화 요리에서 iPSC 매체에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간의 Ipsc의 뿌리고
	<ol>
<li>고전적인 7 일 후에 문화는 70-80% 합류에 인간의 iPSC를 전달 합니다.</li>
		<li>1.2.1 단계에서 설명한 대로 뿌리고 6 cm 요리 준비. Confluent Ipsc와 요리에서 iPSC 매체를 제거 하 고 실시간에서 6 분 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가 참고: 보육 시간 iPSC 클론에 따라 달라 집니다. 시작으로 6 분 외피를 보십시오.</li>
		<li>진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 솔루션을 제거 하 고 iPSC 매체의 2 mL 미리 따뜻하게 실시간 Resuspend에서 iPSC 식민지 1000 µ L 피 펫과 그들을 5-10 x 위아래로 pipetting 추가. 주의: 과도 한 pipetting에서 단일 셀 분리를 하지 마십시오.</li>
		<li>새로운 6 cm 문화 접시에 resuspended 세포 덩어리의 30 ~ 200 µ L를 전송 합니다. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: resuspended 셀 덩어리를 뿌리고에 필요한 양의 iPSC 클론에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 망막 Organoids 세대
<ol><li>그림 1A 에서 도식화 식민지 60-70% 합류 (그림 1B)에 도달 하는 프로토콜에 따라 iPSC 차별화를 시작 합니다.</li>
	<li>6 cm 접시 당 Bi 매체의 4 mL를 준비 합니다. 37 ° c 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
	<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 BiN2 중간, 37 ° c.에 이전 예 열 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>그림 1C 와 같이 긴급 자체 형성 망막 organoids neuroepithelium 싹에 의해 식별 -1E. 참고:이 초기 망막 organoids, 시 컵에 그들의 발달 단계에서 해당 수동으로 다운스트림 실험에 대 한 격리 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 망막 Organoids의 성숙
<ol><li>D28에서 6 잘 플레이트 포함 ProB27 매체 10 ng/mL FGF2의 처음 보충의 4 mL/잘 준비 (그림 1A). 참고: 추가 FGF2 즉시 미디어 판에 추가 됩니다. 주의: FGF2 필터링 하지 않습니다.</li>
	<li>6 cm 요리에서 망막 구조를 수동으로 복구 합니다. 이렇게 하려면 그림 1E, 같이 neuroepithelial 새싹 주위 바늘 수직 강선을 만드는 구조를 분리 하 고 부드럽게 바늘 긁는 organoids을 분리 합니다.</li>
	<li>10-15 organoids 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 ProB27 매체를 포함 하는 6 잘 플레이트의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 ProB27 매체에 부동 문화 조건에서 망막 organoids를 유지. 매체의 2-3 일 마다 변경 합니다. 참고: D35까지 FGF2와 organoids을 취급 합니다.</li>
	<li>D35에 매체의 절반을 제거 하 고 신선한 prewarmed ProB27 매체 FGF2 없이 37 ° C에 추가.</li>
	<li>매체의 절반 그림 2에서 같이 망막 세포 유형의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
</ol>5. 세대 및 증폭의 인간의 iPSC 파생 RPE (hiRPE) 셀
<ol><li>
인간 hiRPE 세포의 생성
	<ol>
<li>차별화에 관여는 Ipsc 식민지 그림 3A에서도식화 하는 프로토콜에 따라 60-70%의 합류를 도달할 때.</li>
		<li>쌍방향 매체의 6 cm 접시 당 4 mL를 준비 하 고 37 ° c.에 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
		<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 이전 37 ° c.에 따뜻하게 BiN2 매체에 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>D28에 이전 그림 3A에서 같이 37 ° C에서 예 열 신선한 ProN2 매체에 매체를 변경 합니다. 참고:이 단계는 4 단계에서 설명한 organoid 따기 후 해질 수 있다.</li>
		<li>2-3 일 마다 ProN2 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>그림 3B에서와 같이 D42에서 안료 패치의 관측에 의해 긴급 hiRPE 세포를 식별 합니다. 참고: hiRPE 세포의 염색 D35 iPSC 클론에 따라 D56 사이 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 세포의 증폭
	<ol>
<li>D42에 이전 단계 1.2.2에서에서 설명한 대로 매트릭스와 코팅 잘 당 ProN2 매체의 1 mL를 포함 하는 24-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 15 분 동안 접시를 놓습니다.</li>
		<li>6 cm 접시에서 hiRPE 패치를 수동으로 복구 합니다. 패치를 격리 하려면 안료 상피 주위 바늘 수직 줄무늬를 확인 하 고 부드럽게 바늘 긁 적 하 여 시트를 분리 합니다. 10 안료 패치 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 24-잘 접시의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
		<li>매체를 변경 하기 전에 ProN2 매체는 셀 문화 인큐베이터에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 hiRPE 패치 하십시오. 0 (hiRPEp0)으로이 hiRPE 셀 통로 note. 매체 ProN2 매체와 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
		<li>셀 confluent 때 hiRPEp0 세포를 전달 합니다.<ol>
<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 각 잘 1 x 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 1 mL로 씻어.</li>
			<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 버리고 0.25 %trypsin 당 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 비활성화 된 트립 신을 ProB27 매체의 800 µ L를 추가 합니다. 참고: 트립 신 활동을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
			<li>HiRPE 셀의 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 해리. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거 하는 추가 세척을 할 수 있습니다.</li>
			<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend 셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
			<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 1 (hiRPEp1)로이 hiRPE 셀 통로 note.</li>
		</ol>
</li>
		<li>계속 hiRPE 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPEp1 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 망막 Organoids 및 hiRPE 셀의 cryopreservation
<ol><li>
전체 망막 organoids에 대 한
	<ol>
<li>5 ~ 20 망막 organoids 전송 피펫으로 사용 하 여 선택 하 고 극저온 유리병에 넣어. 튜브의 하단에 organoids를 건드리지 않고 1000 µ L 피 펫과 초과 모든 매체를 제거 하 고 차가운 cryopreservation 매체의 250 µ L 추가 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>고정 4 h. 전송의 최소-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에서 튜브-150 ° C 냉장고 또는 액체 질소 탱크 장기 저장을 위해 냉동된 튜브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀에 대 한
	<ol>
<li>통로 1에 셀 confluent 때 hiRPE 세포 분열. 참고: hiRPEp0 셀의 cryopreservation 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>T-25 cm2 플라스 크 진공 포부 시스템을 사용 하 여에서 중간 발음 하 고 그것을 씻어 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 3 mL 1 x.</li>
		<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 제거, 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 트립 신 활동을 ProB27 매체의 5 mL를 추가 합니다. 참고: 비활성화 트립 신을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>10 mL 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 hiRPE 셀의 시트를 분리. 셀 카운터와 셀을 계산 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: 추가 세척 ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거를 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>진공 포부를 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 cryopreservation 매체의 250 µ L에 2 백만 세포를 세포를 resuspend.</li>
		<li>극저온 유리병 당 세포 현 탁 액의 250 µ L를 전송 합니다. 최소 4 h-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에 튜브를 고정 합니다.</li>
		<li>-150 ° C 냉동 고 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 탱크에 냉동된 튜브를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 해빙 망막 Organoids 및 hiRPE 세포의
<ol><li>
전체 망막 organoids의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProB27 매체 (2 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 저온 유리병 포함 37 ° C에서 물 욕조에 망막 organoids 30 s. 소독 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 신중 하 게 저온 유리병을 녹여.</li>
		<li>유리병을 열고 미리 데워 진된 ProB27 매체의 1 mL를 추가 합니다. 전송 피 펫 1.5 mL 튜브에는 organoids를 전송.</li>
		<li>튜브의 하단에 망막 구조를 건드리지 않고 pipetting으로 매체를 부드럽게 제거 합니다. 워시는 organoids 1 1 mL와 함께 더 많은 시간 미리 데워 진된 ProB27 매체의.</li>
		<li>전송 피펫으로와 organoids를 발음 하 고 미리 예 열 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에 equilibrated ProB27 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 1에 넣어. 참고: 6 잘 플레이트의 당 10-15 망막 organoids를 배치 합니다.</li>
		<li>매체의 절반 그림 2에 설명 된 대로 그들의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProN2 매체 (8 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 해 동 hiRPEp1 세포의 극저온 샘플 37 ° C에 물 목욕으로 외피에 의해 30 s. 소독에 대 한 신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병.</li>
		<li>튜브를 열고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 1 mL를 추가 하 고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 110 x g에 5 분 동안 원심.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 이 단계에서 2 (hiRPEp2) 통로 note.</li>
		<li>계속 hiRPEp2 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPE 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다. 참고: 2 주 후에 문화, 8-10 백만 hiRPE 셀 추가 실험에 대 한 수집할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
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</ol>

Sacha Reichman, 올리비에 Goureau, 그리고 호세 알랭 Sahel 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허 발명에 있습니다.

이 프로토콜 RPE 세포 및 망막 organoids, 망막 RGCs 및 대뇌, 이종와 피더 조건에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 방법을 설명 합니다. 여기 좋은 제조 관행 (GMP) 과정, 재배 하는 방법 호환 RPE 세포, RGCs, 그리고 줄기 세포 기반 요법 및 약물의 개발에 대 한 대뇌 iPSC 파생 된 망막 세포의 큰 생산 수 발견은 망막 퇴행 성 질환의 미래 처리를 위한 접근 한다. 전체 망막 organoids 또는 hiRPE 셀의 cryopreservation는 또한 가장 큰 장점은 수립 중간 세포 은행에 줄기 세포 기반 치료에서 차후 사용을 위해 중요 한 단계를 제공 합니다.
차별화의 특정 단계에서 큰 주식 종류의 특정 망막 세포의 생산 미래 임상 번역에 필요한 것입니다. 이와 관련, CD73 포지티브 포토 리셉터 일어나 3 개월에서 세대 이식 호환 셀 인구18, 동결 해 동 망막에서 이러한 미 성...

망막 중앙 신경 시스템 (CNS)의 중요 한 부분이 이며 자발적으로 외상 성 부상이 나 질병에 따라 다시 생성 제한 된 용량을 하고있다. 따라서, 연령 관련 황 반 변성 (AMD), 망막 화 (RP), 녹 내장, 당뇨병 성 망막 증 등 확실 한 망막 세포 손실의 원인이 퇴행 성 병 리는 일반적으로 돌이킬 수 없는 실명으로 이어질. 퇴 화 된 망막 구조를 손상 또는 분실 된 세포를 대체 하는 것을 목표로 하는 줄기 세포 기반 요법 가장 유망한 접근1,,23중 하나는 주요 도전 이다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 세포로 만능 줄기 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 문화, 무한정 확장 될 수 있고 그들은 모든 종류를 생산 하는 잠재력을가지고. 망막 개발에 대 한 우리의 이해에 생체 외에서 의 개선 발전 인간의 iPSC 차별화 망막 organoids7,,89의 세대에서 결과 대 한 프로토콜 10,,1112. 망막 신경 절 세포 (RGCs), 대뇌, 그리고 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 포함 하 여 주요 망막 세포의 모든 인간의 ESCs와 Ipsc4,5, 에서 성공적으로 분화 된 6. Eiraku 그 외 여러분 에 의해 개발 된 SFEB (embryoid 몸 같은 집계의 혈 청 무료 문화) 방법에 따라 13, 망막 organoids의 자기 형성 ESC 또는 iPSC 파생 embryoid 몸 같은 집계 정의 된 세포 외 매트릭스 구성 요소7,10,14에서 얻을 수 있습니다. 하지만 이러한 프로토콜 치료 접근 또는 약물 검사에 대 한 많은 호환 되지 않습니다 항상 셀의 큰 생산 단계를 요구 하는 복잡 한. 따라서, 인간의 망막 세포를 생산 하는 방법의 선택이 중요 하 고 메서드가 확장 가능한, 강력 하 고 효율적인 필요.
우리 우리의 이전 게시15을 기반으로, 여기, 부착 인간의 Ipsc 급지대와 이종 조건에 재배에서 망막 organoid 자기 형성을 통해 망막 세포의 간단 하 고 효율적인 생성에 대 한 각 단계 설명 해 서. 부착 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에서 시작 해 서,이 프로토콜만 간단한 연속 매체 4 주에 iPS 파생 RPE (hiRPE) 세포와 neuroretinal 구조 둘 다의 생성을 허용 하도록 변경 해야 합니다. 수동 격리 후 hiRPE를 확장할 수 있습니다. 있으며 망막 구조 망막 조상 세포 vivo에서 인간 일치 순차적으로 모든 망막 세포 유형으로 분화 할 수 있는 organoids를 부동으로 경작 될 수 있습니다. retinogenesis입니다. 마지막으로, 연구 발전 또는 임상 번역, 우리 그들의 phenotypic 특성 및 기능에 영향을 주지 않고 전체 망막 organoids 및 hiRPE 세포의 장기 저장 수 cryopreservation 메서드를 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>비트로넥틴(VTN-N) 재조합 인간 단백질, 절단된</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td>코팅</td></tr><tr><td>CTS 비트로넥틴(VTN-N) 재조합 인간 단백질, 절단된</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>코팅</td></tr><tr><td>필수 8 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>매체</td></tr><tr><td>필수 6 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>매체</td></tr><tr><td>CTS(세포 치료 시스템) N-2 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>보충제 CTS</td></tr><tr><td>N-2 보충제(100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>보충제</td></tr><tr><td>B-27 보충제(50X), 무혈청</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>보충제</td></tr><tr><td>CTS B-27 보충제, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td> 보충제 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>매체</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>보충제</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>항생제</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC 인증, 즉시 사용 가능, 감소 성장 인자 기저막 매트릭스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>매트릭스</td></tr><tr><td>부드러운 세포 해리 시약</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>해리 솔루션</td></tr><tr><td>Cryostem 동결 매체</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D</td><td>동결 보존 매체</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2) 동물 무료</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Xeno</td></tr><tr><td>무료 AGANI 바늘 23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td>바늘</td></tr><tr><td>플라스크 25 cm&sup2; 조직 배양 처리된</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>T-25 cm&sup2;</td></tr><tr><td>24웰 플레이트 조직 배양 처리된</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>24웰 플레이트</td></tr><tr><td>6웰 플레이트 조직 배양 처리된</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>6웰 플레이트</td></tr></tbody></table>

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 ipsc 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

만능 줄기 세포에서 특수 세포의 생산 재생 의학에 대 한 새로운 접근을 개발 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 사용은 어디 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 이해 하 고 실명을 싸울 중요 한 단계를 앞으로 표시 neurodegenerative 질병 연구, 망막 dystrophies를 포함 하 여 특히 매력적 이다. 이 논문에서는, 우리 생성, 성숙, 망막 organoids cryopreserve을 간단 하 고 확장 가능한 프로토콜을 설명 합니다. 변화 하는 매체에 따라,이 방법의 주요 장점은 여러 방지 이며 Ipsc의 가이드 차별화에 필요한 일반적으로 시간이 많이 걸리는 단계. 부착 인간의 iPSC 문화에 정의 된 미디어의 연속적인 변화에 의해 망막 개발의 초기 단계를 흉내 낸,이 프로토콜 자체 neuroretinal 구조에 망막 안료 상피 (RPE) 세포 형성의 동시 발생을 사용 하는 4 주에 재현 하 고 효율적인 방식 으로입니다. 성인 인간의 망막에 7 망막 세포 유형으로 Rpc의 차별화를 활성화 부동 문화 상태에서 더 성숙 망막 조상 세포 (Rpc)을 포함 하는 이러한 구조 쉽게 격리 될 수 있습니다. 또한, 우리 망막 organoids의 cryopreservation 빠른 방법 및 RPE 세포 장기 저장에 대 한 설명합니다. 함께 결합, 여기에 설명 된 방법을 생산 하 고 인간의 iPSC 파생 된 망막 세포 또는 조직 모두 기본 및 임상 연구에 대 한 은행 유용 있을 것입니다.

급지대 무료 조건16 에서 인간의 iPSC 차별화에 대 한 첫 번째 단계는 자기 갱신 기계 자발적인 차별화 (그림 1A)를 장려 하기 위해 양방향 매체를 사용 하 여 종료입니다. 다음, Bi 매체 보완에 D2, 신경 및 망막 혈통으로 차별화 Ipsc 셀 가이드는 N2 보완. 이 프로세스 리드 D28 주위에 neuroretinal 꽃 봉 오리의 모습 (그림 1C - 1E). 자기 형성 neuroretinal 구조 그림 1E 에서 볼 수 있듯이 바늘을 사용 하 여 격리 될 수 있습니다 및 ProB27 매체 (그림 1 층)을 사용 하 여 부동 문화 조건에서 망막 organoids의 성숙 수 있...

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

이 방법은 인간 유도 만능 줄기세포 또는 iPS 세포에서 다른 망막 세포 유형의 생성과 같이 망막 영역에서 만능 줄기 세포의 분화에 관한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배양 배지의 연속적인 변화에 의해서만 배아를 형성에 통과시켜 망막 오가노이드 생성에 부착 가능한 인간 iPS 세포를 직접 사용할 수 있다는 것입니다. 실험실 엔지니어인 Amelie Slembrouck-Brec은 망막 오가노이드를 생성 및 분리하는 방법을 시연할 예정이며, 실험실 엔지니어인 Celine Nanteau는 망막 색소 상피 또는 RPE 세포 생산을 위한 전략을 시연할 예정입니다.이 회로도에 따라 iPS 세포 분화를 시작하며, 이는 콜로니가 60-70%의 합류점에 도달할 때 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 6cm 접시당 4ml의 기초 iPS 배지를 준비하고 배지를 섭씨 37도까지 데웁니다. 그런 다음 iPS 세포 배지를 기저 iPS 배지로 변경합니다.이번에는 Day Zero로 기록하십시오. 2일차에 기저 iPS 배지의 배양액을 이전에 섭씨 37도에서 예열된 기저 iPS N-2 배지로 전환합니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.신경 상피 새싹에 의한 창발 세포 형성 망막 오가노이드를 식별합니다. 28일째에 처음에는 FGF2 1밀리리터당 10나노그램을 보충한 Pro B-27 배지당 4밀리리터를 포함하는 6웰 플레이트를 준비합니다. 6cm 접시에서 망막 구조를 수동으로 복구합니다.이를 위해서는 신경 상피 새싹 주위에 바늘로 수직 줄무늬를 만들어 구조를 분리하고 바늘로 부드럽게 긁어 오가노이드를 분리합니다. 1,000마이크로리터 피펫을 사용하여 10-15개의 오가노이드를 흡입하고 Pro B-27 배지가 들어 있는 6웰 플레이트의 단일 웰로 옮깁니다. 망막 오가노이드를 Pro B-27 배지의 부유 배양 상태로 유지하며, 5%이산화탄소를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 사용합니다.2-3일마다 배지의 절반을 교체하십시오. 28일차에 배지를 이전에 섭씨 37도에서 예열된 새로운 Pro N-2 배지로 변경하고 2-3일마다 Pro N-2 배지를 계속 교체합니다. 42일째에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 매트릭스로 미리 코팅되고 웰당 1ml의 Pro N-2 배지를 포함하는 24웰 플레이트를 준비합니다.사용하기 전에 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 5% 이산화탄소로 15분 동안 놓습니다. 6cm 접시에서 인

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

다음 프로토콜은 녹아웃 완료 세럼 교체 피더 - 프리 미디어 (KSR - FF)를 사용하여 피더 무료 문화 인간 유도 Pluripotent 줄기 (IPS) 셀을 적응을위한 지침을 제공합니다. 일단 지속적인 유지 보수를위한 지침도 제공되며, 적응.

완료 녹아웃 세럼 교체 피더 - 무료 매체를 사용하여 인간의 IPS 세포 피더 - 자유 적응력, 문화와 Passaging

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

줄기세포 유래 망막 색소 상피(RPE) 세포는 망막 변성을 위한 세포 기반 치료, 질병 모델링 및 약물 연구를 포함한 여러 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 여기에서는 줄기세포에서 RPE를 재현성 있게 유도하기 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

이 프로토콜의 목표는 다양한 세포외 기질(ECM) 코팅 조건을 비교하여 차등 코팅이 유도만능줄기세포(iPSC)의 성장 속도에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 특히, 우리는 iPSC 배양의 최적 성장을 얻기위한 조건을 설정하는 것을 목표로합니다.

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

여기서 우리는 다양한 인간 다능성 줄기 세포주에 적합한 최적화된 망막 오르간성 유도 시스템을 설명하여 높은 재현성과 효율성을 가진 망막 조직을 생성합니다.

인간 다능성 줄기 세포에서 3D 망막 조직의 파생을 위한 망막 오르간로이드 유도 시스템

이 프로토콜은 hiPSC를 안구 클러스터로 분화하고 부착 및 현탁 배양 시스템을 모두 포함하는 단순화된 배양 조건을 사용하여 신경-망막 오가노이드를 생성하는 효율적인 방법을 설명합니다. RPE 및 각막 상피와 같은 다른 안구 세포 유형도 망막 배양의 성숙한 안구에서 분리할 수 있습니다.

Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells에서 망막 오가노이드 생성

이 프로토콜은 재프로그래밍 인자를 포함하는 마트리겔 및 센다이 바이러스 벡터의 조합을 사용하여 공급자가 없는 조건에서 인간 말초 T 세포에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하는 방법을 설명합니다.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

이 작품은 신경 능선을 통해 인간 만능 줄기 세포에서 색소, 성숙한 멜라닌 세포를 생산하고 공급이없는 25 일간의 프로토콜을 사용하여 중간 단계 멜라닌하는 체외 분화 프로토콜을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

학습하세요 인간 유도만능줄기세포(iPSC)에서 망막 오가노이드와 색소상피세포를 생성하는 방법을. 이 기술은 망막 질환의 재생의학 연구와 줄기세포 치료 개발에 중요한 도구를 제공합니다.

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

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