Name: 정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 배우세요 TRPV1 이온 채널의 정제 및 분광 분석 방법을. EPR과 DEER 기술을 활용하여 막 단백질의 구조적 변화와 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리는 EPR 및 사슴 분석기에 대 한 액세스를 제공 하기 위한 박사 H. Mchaourab와 박사 T. 로젠바움 전장 시스테인-덜 TRPV1 플라스 미드를 제공 하기 위한 매우 감사.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
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저자는 공개 없다.

표현과 포유류 막 단백질의 정화에 대 한 현재 기술 분 광 연구14,15,,1642단백질의 충분 한 양을 얻을 수 만들었습니다. 여기, 우리 표현, 정화, 다시 구성, TRPV1에 분 광 분석을 수행 하는 이러한 기술을 적응 시켰다.
프로토콜에 중요 한 단계 중 아래는 TRPV1에 대 한 트러블 슈팅을 수행한 우리 하 고는 다른 단백질을 위해 조정 될 수 있습니다. 0.5-1 mg/mL 단백질 세제 정화;의 생성 하는 템플릿을 생성 하려면 DNA 시퀀스 수정 미만 0.5 mg/mL 단백질의 생성 하는 템플릿, 돌연변이 당 해야 할 것 이다 곤충 세포 문화 6 리터 이상 성장 이후 도전적. 단백질 해야 집중 될, 이상 2 mg/mL, 스핀 라벨 효율 증가...

단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM)의 최근 발전, 포유류 이온 채널 구조는 특별 한 속도로 얻은 되었습니다. 특히, 일시적인 수용 체 잠재력 vanilloid 1 (TRPV1) 같은 polymodal 이온 채널의 구조 연구를 제공 추가 활성화 메커니즘1,2,3, 의 이해 4 , 그러나 5., 막 환경에 포함 된 이온 채널에 대 한 동적 정보는 그들의 polymodal 제어 및 약물-바인딩 메커니즘을 이해 하는 데 필요한.
전자 상자성 공명 (EPR) 및 이중 전자-전자 공명 (사슴) spectroscopies 이온 채널6,7,,89 에 대 한 가장 확실 한 기계적 모델의 일부를 제공합니다 , 10 , 11 , 12 , 13. 이러한 접근의 간결한 검사에 주로 제한 되었습니다 및 archeal 이온 채널을 때 박테리아에 overexpressed 세제 정화 단백질 많은 양의 얻을. 곤충과 포유류 세포 기능 및 구조 특성화14,,1516진 핵 막 단백질 생산의 개발, 그것은 지금 생화학 얻을 수 분 광 연구에 대 한 세제 정화 단백질의 금액.
EPR 및 사슴 신호 단백질에서 단일-시스테인 잔류물에 연결 된 paramagneticspin 레이블 (SL) (즉, methanethiosulfonate)에서 발생 한다. 스핀-레이블을 보고 세 가지 유형의 구조 정보: 모션, 각, 및 거리. 이 정보는 잔류물 단백질 내 매장 하거나 막 또는 apo에 ligand 바인딩 상태13,17,,1819수성 환경에 노출 되는 수 있습니다. 고해상도 구조 (사용 가능한 경우)의 맥락에서 EPR 및 사슴 데이터 제공 가역 제어 전환 (즉, 폐쇄, 오픈, 모니터링 하는 동안 그들의 네이티브 환경에서 동적 모델을 파생에 대 한 제약 조건의 컬렉션 응, 그리고 desensitized). 또한, 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-그들 확인 하기 어려울 수 있습니다 유연한 지역 2 차 구조는 단백질20내의 위치 할당을 이러한 환경 데이터 집합을 사용 하 여 얻을 수 수 있습니다. 이온의 게이팅에 대 한 귀중 한 정보 채널3,,2122,,2324, 를 제공 하는 곳을 알아내는-EM 구조 지질 nanodiscs에서 25; 그러나, 분 광 방법 구조적 하는 상태에서 (예를 들어, 열 변경) 곳을 알아내는-그들을 사용 하 여 결정 하기 어려울 수 있습니다 동적 정보를 제공할 수 있습니다.
EPR와 사슴, 단백질 기능의 부족을 포함 하 여 모든 시스테인 잔류물 (특히 풍부한 포유류 채널에서), 낮은 단백질 수확량, 단백질 불안정성을 제거 하는 정화 동안 고 스핀 라벨링 후 구현 하 많은 어려움을 극복 한다 그리고 단백질 집계 세제 또는 리. 여기, 우리는 이러한 중요 한 장벽을 극복 하 여 포유류 감각 수용 체에 대 한 사슴 및 EPR 스펙트럼 정보를 얻은 프로토콜 설계. 여기 목적은 식, 정화, 라벨, 및 기능 최소화 시스테인-덜 쥐 TRPV1의 재구성 (eTRPV1) 분 광 분석에 대 한 구성에 대 한 방법론을 설명 하는 것입니다. 이 방법론은 그 막 단백질 이황화 결합을 형성 하는 시스테인을 포함 하는 또는 시스테인 잔류물의 제거에도 불구 하 고 그들의 기능을 유지 하는 것에 적합 합니다. 프로토콜의이 컬렉션은 다른 포유류 이온 채널의 분 광 분석에 대 한 적응 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>QuikChange Lightning Site-Directed 돌연변이 유발 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올(이소프로판올)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>알부민 소 혈청(BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>아밀로스 수지</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>대두에서 아솔렉틴</td><td>시그마</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 흡착제&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 피펫(3.5'')(난모세포 삽입)</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 피펫(난모세포 기록)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린(디소듐)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin 시약</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 타입 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-말토오스 일수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM(n-docecyl-B-D-말토피라노사이드)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>고포도당 매체(Dulbecco' 의 변형된 독수리' s 매체)</td><td>시그마</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>일회용 PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus 플라스미드 DNA 미니 준비 키트</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch PCR Cleanup Kit</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관 (25 &micro; l)</td><td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>유리 플라스크 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG(이소프로필-티오-B-갈락토시드)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신 설페이</td>트 <td>피셔 사이언티픽</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>피셔 케미컬</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수, 밀러</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴 헤미설페이트</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagents</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) 메틸 Methanethiosulfonate</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic Acid F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>밀폐형 모세관</td><td>VitroCom</td><td>특별 주문</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM(곤충 세포 배지)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 </td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>대두 극성 지질 추출물</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin Hydrochloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus 난모세포</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Blue Competent Cells</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX 스테인 프리 캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 발현 벡터</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac 역량 세포</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal 모세관 실란트</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI 모델 3130XL 유전자 분석기</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipete</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

정화 및 분 광 분석에 대 한 trpv1의 재구성

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal 이온 채널 transduce 다른 성격의 여러 자극에 allosteric 변화; 이러한 동적 conformations 확인 하 고 크게 불명 하 게 남아 도전입니다. 주 작동 근 바인딩 사이트의 구조적 특징 및 여러 이온 채널의 활성화 메커니즘에 단일 입자 cryo 전자 현미경 검사 법 (cryo-EM) 발산 빛의 최근 발전, 무대는 그들의 게이팅의 깊이 있는 동적 분석에 대 한 설정 분 광 방법을 사용 하 여 기계 장치입니다. 이중 전자-전자 공명 (사슴)와 전자 상자성 공명 (EPR) 분 광 기술을 대량으로 순화 될 수 있는 간결한 이온 채널 연구에 주로 제한 되었습니다. 대량의 기능과 안정적인 막 단백질에 대 한 요구 사항을 이러한 방법을 사용 하 여 포유류 이온 채널 연구를 방해 했다. EPR 및 사슴 이기는 하지만 낮은 해상도에서 엑스레이 결정학 또는 곳을 알아내는-EM 얻으려면 어려울 수 있습니다, 구조 결정 및 모바일 단백질 영역의 동적 변화를 포함 하 여 및 가역 게이팅 모니터링 많은 장점을 제공합니다 (즉, 폐쇄, 오픈, 응, 그리고 desensitized) 전환. 여기, 우리는 기능성 세제 solubilized 일시적 수용 체 잠재적인 양이온 채널 인도의 V 회원 1 (TRPV1) 사슴 및 EPR 분광학에 대 한 분류 수 밀리 그램을 얻기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

최소한의 시스테인-덜 TRPV1 구성 (eTRPV1) 및 단일-시스테인 돌연변이의 기능 특성
분 광 연구 향한 첫 번째 단계 엔지니어 및 시스테인-덜 단백질 구조 (그림 2A) 기능 및 단백질의 생 화 확 적인 금액을 산출 하는 특성입니다. eTRPV1는 Ca2 + 이미징 및 TEVC (그림 2B-C)에 의해 결정 된 대로 작동 합니다. 또한, eTRPV1 EPR 및 사슴 실험 (0.5-1 mg Sf9 셀의 리터 당)에 대 한 세제 정화 단백질의 충분 한 양을 제공 한다26. 소개 하는 특정 단백질 영역에서 단일 시스테인 그들의 기능에 영향을 수 있습니다. <strong ...

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

여기 실험실에서는 분광법(spectroscopic approach)을 사용하면 일시적 수용체 전위 이온 채널 제품군의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다고 생각합니다. 예를 들어 폴리모달 활성화와 관련된 동적 정보 변경을 결정하는 것입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 전자 상자성 공명 및 이중 전자 전자 공명 epitroscopy를 위한 밀리그램의 순수하고 기능적인 잔류 이온 채널을 허용한다는 것입니다.이 방법은 3B1의 열 및 광 독립적 게이팅과 호환되는 구조적 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 예를 들어 3B2와 같은 다른 트립 채널에도 적용할 수 있습니다. 온라인 도구를 사용한 디자인 돌연변이 유발 프라이머로 이 절차를 시작하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR 반응을 준비하고 혼합물을 스핀합니다. 튜브를 thermocycler에 넣고 텍스트 프로토콜에 나열된 PCR 매개변수를 사용하여 PCR 돌연변이 유발을 수행합니다. 그런 다음 2 마이크로 리터의 DPN1 효소를 반응에 첨가하고 혼합합니다.섭씨 37도에서 30분 동안 반응을 배양합니다. 다음으로, 75마이크로리터의 해동된 E.Coli 수용 세포와 10마이크로리터의 DPN1 처리된 PCR 혼합물을 사전 냉각된 14ml 멸균 튜브에 첨가하여 변형을 수행합니다. 부드럽게 섞은 후 얼음 위에서 30분 동안 반응을 배양합니다.튜브를 섭씨 42도에서 45초 동안 유지한 다음 즉시 얼음 위에 2분 동안 놓습니다. 카르베니실린이 함유된 LB 한천 플레이트에 혼합물을 플레이트하고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 군체를 수확하고 하룻밤 동안 준비한 후 10분 동안 8000배 G에서 하룻밤 배양을 스핀다운합니다.그런 다음 시중에서 판매되는 미니 준비 키트의 지침에 따라 DNA를 추출합니다. 재조합 bacmid를 생성하려면 100마이크로리터의 DH10bac E.Coli 수용 세포를 7.5나노그램의 재조합 donor 벡터로 변환합니다. 벡터는 기능적 최소 시스테인이 없는 쥐 TRPV1, 약칭 eTRPV1 및 단일 시스테인 돌연변이를 포함합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 파종하고 배양한 후, 파란색 콜로니에는 관심 삽입물이 없으므로 직경이 2mm인 흰색 콜로니를 선택합니다. 실체 현미경을 사용하여 흰색 군체에 파란색 반점이 없는지 확인합니다. 최소 3개의 단일 콜로니를 수확하여 4밀리리터가 보충된 LB 배지가 들어 있는 14ml 멸균 튜브로 옮깁니다.세포를 섭씨 37도에서 250RPM으로 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양액 1.5ml를 취하여 재조합 bacmid DNA를 분리합니다. 재조합 바큘로바이러스를 생성하려면, 2mm의 곤충 세포 배지에 100만 개의 SF9 세포를 플레이트화합니다.세포가 최소 45분 동안 부착되도록 합니다. 1ml의 새 배지로 한 번 세척한 후 세척 배지를 제거하고 DNA transfection 시약 혼합물을 세포에 추가합니다. 섭씨 27도에서 교반 없이 5시간 동안 세포를 배양합니다.배양 후 형질주입 혼합물을 제거하고 0.5%의 소 태아 혈청을 함유한 2ml의 곤충 세포 배지로 교체합니다. 그런 다음 섭씨 27도에서 5일 동안 세포를 배양합니다. 세포 배양 배지를 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.섭씨 4도에서 15분 동안 8000배 G로 튜브를 회전시켜 바이러스 스톡의 첫 번째 통과를 분리합니다. 상층액을 깨끗한 15ml 원심분리기 튜브에 옮기고 즉시 섭씨 4도에서 보관하십시오. 2세대 바이러스 스톡의 경우, 2%FBS를 함유한 1밀리리터당 100만 개의 SF9 세포에서 곤충 세포 배지의 25ml 현탁액 배양을 125ml 플라스크에 피펫팅합니다.25마이크로리터의 P1 바이러스를 25ml의 배양액에 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 27도에서 72시간 동안 배양합니다. P2 바이러스 스톡을 수확하려면 배양물을 새로운 50ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 15분 동안 8000배 G로 원심분리합니다.상층액을 새 50ml 튜브로 옮기고 즉시 섭씨 4도에서 보관하십시오. 1리터 배양액에 P2 바이러스 스톡 1ml를 추가하고 섭씨 27도에서 72시간 동안 배양합니다. 1리터 곤충 세포 현탁액 배양액을 4500G에서 섭씨 4도에서 20분 동안 회전시켜 수확합니다.세포 펠릿의 무게를 잰다. 약 6-9g으로 예상됩니다. 프로테아제 억제제가 있는 상태에서 25ml의 얼음 저온 완충액 A에 세포 펠릿을 재현탁합니다.세포 덩어리를 분해하여 균일한 현탁액을 얻고 섭씨 4도에서 20분 동안 회전합니다. 수동 또는 고압 균질기를 사용하여 세포를 부수십시오. 섭씨 4도에서 20분 동안 8000배 G로 원심분리하여 세포 파편을 제거한 후, 상등액을 회수하여 다시 100, 000배 G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리한다.원심분리 후, 상등액을 버리고 프로테아제 억제제가 보충된 총 20ml의 얼음 저온 완충액 B에 멤브레인 펠릿을 현탁시킵니다. 20 밀리리터의 멤브레인 현탁액을 50 밀리리터 튜브에 분주하십시오. 단백질 정제를 수행하려면 튜브당 3ml의 DDM을 첨가하십시오.튜브를 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전시킵니다. 100에 표본을 원심 분리하기 후에, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 시간 G, 상등액을 모으고 청결하고, 젖은 아밀로스 수지의 1 밀리리터를 추가하십시오. 혼합물을 섭씨 4도에서 2시간 동안 회전시킵니다.그런 다음 단백질 아밀로스 혼합물을 중력 흐름 크로마토그래피 컬럼에 로드합니다. 단백질 결합 아밀로스 수지를 얼음 저온 완충액 C의 10배 부피로 세척한 다음, 20 밀리몰 맥아당이 보충된 최대 5 밀리리터의 얼음 저온 탈기 완충액 D까지 0.5 밀리리터 분획으로 10 베드 부피의 얼음 저온 완충액 D.Elute eTRPV1 단백질을 세척합니다. 섭씨 4도에서 세척 및 용출을 수행합니다.100킬로달톤 차단 원심 필터 장치를 사용하여 라벨링을 위해 분획을 2에서 2.5mg 사이로 농축합니다. 다음으로, DMSO의 100밀리몰 스톡 용액에서 농축된 단백질에 10배 이상의 MTSSL 스핀 라벨을 추가합니다. 30분마다 두 번씩 반복합니다.반응을 실온의 어두운 곳에서 1시간 30분 동안 유지한 다음 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 그런 다음 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로 제어되는 버퍼 E에서 평형을 이룬 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 eTRPV1에 스핀 라벨을 로드합니다. eTRPV1 사합체를 함유하는 분획을 수집합니다.진공 상태에서 회전 증발기를 사용하여 10mg의 아솔렉틴을 섭씨 40도에서 1시간 동안 건조시킵니다. 아솔렉틴 리포솜을 만들려면 1ml의 완충액 F를 추가하고 15분 동안 또는 샘플이 균질해질 때까지 혼합물을 초음파 처리합니다. DDM을 최종 농도인 2밀리몰에 첨가하여 리포좀을 불안정하게 만들고 실온에서 30분 동안 배양합니다.DDM 긴요한 균류 농도에 혼합물을 조정한 후에, 원본 의정서에서 선발된 것과 같이, 완충기 F.Remove를 가진 단백질 리포좀 혼합물의 양을 두배로 실온에 온화한 교반을 가진 1 시간 간격으로 비극성 폴리스티렌 흡수성 구슬의 3개의 부분 표본을 연속적으로 추가해서 세제. 혼합물을 컬럼 필터에 로드하여 비드를 제거하고 프로테오리포좀 혼합물을 울트라 원심분리 튜브로 옮깁니다. 100, 000 시간 G에 표본을 4 섭씨 온도에 1 시간 동안 분리기.상등액을 버리고 펠릿을 30마이크로리터의 버퍼 F에 재현탁한 다음 분광 측정 및 분석을 수행합니다. 첫 번째 체크포인트는 발현 및 정제 프로토콜을 수행하기 전에 단일 시스테인 돌연변이의 기능 분석입니다. 여기서, 야생형 TRPV1, eTRPV1 및 돌연변이를 발현하는 hek293 세포는 형광 칼슘 이미징을 사용하여 캡사이신 유발 반응에 대해 분석되었습니다.두 번째 체크포인트는 재구성 및 분광 분석을 진행하기 전에 크기 배제 크로마토그래피를 통해 스핀 표지된 단일 시스테인 돌연변이의 생화학적 특성을 규명하는 것입니다. 세 번째 체크포인트는 분광 분석을 수행하기 전에 재구성된 스핀 표지된 단일 시스테인 돌연변이의 기능적 특성화입니다. A702C로 표시된 스핀을 포함하는 프로테오리포좀으로 미세 주입된 Xenopus 난모세포의 두 전극 전압 클램프에 의해 결정된 전류 전압 관계는 pH5로 도전하고 캡사제핀에 의해 차단되었습니다.마지막으로, 연속파 EPR에 의해 결정된 스핀 표지 eTRPV1 돌연변이의 이동성을 얻을 수 있습니다. 1차 파생 스펙트럼은 DDM 용액에서 스핀 표지된 시스테인 돌연변이에 대해 표시되고 아졸렉틴 리포좀에서 재구성됩니다. 세제에서 스핀으로 표지된 eTRPV1 돌연변이의 거리와 이동성도 DEER에 의해 결정되었습니다.스핀으로 표시된 돌연변이 E651C의 사슴 에코 및 거리 분포가 표시됩니다. 이 동영상을 시청한 후에는 분광 분석을 위해 포유류 이온 채널을 발현, 미화 및 재구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 시스테인 잔류물을 제거할 때 단백질 기능이 부족하고, 단백질 수율이 낮으며, 정제 및 스핀 라벨링 후 단백질 불안정성, 세제 또는 리포좀의 단백질 응집으로 인해 어려움을 겪을 것입니다.개발 후 이러한 프로토콜을 통해 TRPV1 폴리모달 게이팅을 위한 기계론적 모델을 탐색하기 위한 거리 및 동적 변화를 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

우리는 ATP - 문이 P2X2 수용체의 전체 길이 C 터미 너스에 바인딩 뇌 단백질을 식별하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 모든 P2X 수용체에 대한 확장 및이 방법의 체계적인 응용 프로그램은 P2X 수용체 신호의 더 나은 이해로 이어질 것으로 예상된다.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.

효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

이종 발현 시스템을 통해 공부하는 이온 채널은 생물 의학 연구의 핵심 기술이되고있다. 이 논문에서는, 유도 성 프로모터의 조절하에 일시적인 형질 감염을 수행함으로써 엄격하게 제어 이온 채널 표현을 달성하는 시간 효율적인 방법을 제안한다.

유도 성 과도 형질을 통해 제어 이온 채널 식

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

INAD 단백질 복합체의 조립 메카니즘에 기초하여, 이 프로토콜에서, 내인성 초파리 TRP 채널을 정제하기 위해 변형된 친화성 정제 플러스 경쟁 전략이 개발되었다.

내인성 초파리 일시적인 수용체 잠재적 채널의 정제

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

배우세요 TRPV1 이온 채널의 정제 및 분광 분석 방법을. EPR과 DEER 기술을 활용하여 막 단백질의 구조적 변화와 활성화 메커니즘을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

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