Name: Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 배우세요 와이드필드 형광 현미경을 사용하여 부드러운 실리콘 기판의 영률을 측정하는 방법을. 이 기술은 기계생물학 연구에서 세포가 기판 강성에 반응하는 것을 연구하는 데 활용됩니다.

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우리 감사 마가렛 Gardel 아낌없이 고분자의 사용을 허용. 우리 인정이 작업을 사용 하는 NIH (1R15GM116082)에서 지원 합니다.

1입니다. 부드러운 실리콘 기판의 제작
<ol><li>1.75 g A 구성 요소 및 B 구성 요소의 1.75 g으로 무게 (A:B = 1:1) 부드러운 실리콘 엘라 스토 머 키트 (폴리스 티 렌)를 사용 하 여 트레이 무게.</li>
	<li>A 구성 요소 무게 트레이에 B 구성 요소에 추가 하 고 적절 한 주걱 스틱을 사용 하 여 5 분 동안 함께 그들을 섞는다.</li>
	<li>35 mm 페 트리 접시 위의 혼합물을 추가 합니다. 몇 분 동안 배양 접시에 걸쳐 균등 하 게 확산 혼합물을 허용 한다. 참고: 페 트리 접시 지름과 부드러운 실리콘의 양을 부드러운 실리콘 두께 결정 합니다. 여기, 두께 약 3.5 m m; 될 것입니다. 토론 섹션에서 고무 두께 선택 하는 것에 대 한 더 많은.</li>
	<li>모든 기포를 제거 하려면 15 분 동안 진공 챔버에, 뚜껑 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 미리 70 ° c 뜨거운 접시가 열</li>
	<li>핫 플레이트에는 70 ° C에 도달 하면, 유리 슬라이드에 놓고 유리 슬라이드에 실리콘 혼합물으로 페 트리 접시를 놓습니다. 실리콘을 하자 30 분 동안 70 ° C에서 치료. 로 페 트리 접시 녹아 있습니다 핫 플레이트에 직접 폴리스 티 렌 접시를 배치 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 부드러운 실리콘에 형광 Microbeads 커플링
<ol><li>(발견된 페 트리 접시)에 치유 부드러운 실리콘 깊은 UV 챔버 (185 및 254 nm의 빛 파장의 깊은 UV 램프와 인클로저)에 배치 합니다. 부드러운 실리콘 샘플 (UV 램프에서 ~ 5-10 cm) 5 분에 대 한 깊은 자외선 노출.<ol>
<li>실리콘 깊은 자외선에 노출 되는, 아래 단계 2.2-2.6와 함께 진행 합니다. 깊은 자외선 노출 후 샘플을 검색 하기 전에 적어도 5 분 동안 깊은 UV 챔버를 드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한편, 19 mg microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)의 밖으로 무게 하 고 그것에 이온된 수 (DI) 물 500 μ를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 떨고 하 여 EDC를 분해.</li>
	<li>별도 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 11 mg N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo NHS)의 밖으로 무게, 디 물 500 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 떨고 sulfo NHS를 해산. 그런 다음, 단일 microcentrifuge 튜브에 EDC sulfo NHS 솔루션 결합.</li>
	<li>이 EDC/sulfo NHS 솔루션 (1 %w / v 재고 농도)와 30 μ 0.44 μ m 직경 빨간색 (또는 필터 큐브 형광 현미경에서 사용할 수에 따라 다른 형광 색)의 수정 카복실산 형광 microbeads을 추가 합니다.</li>
	<li>EDC/sulfo NHS/비드 혼합물에 추가 하는 콜라겐의 0.02 m g (쥐 꼬리, 0.02 M 초 산에 4 mg/mL의 재고 농도)에서 나 약 0.02 mg/mL의 농도를.</li>
	<li>EDC/NHS/구슬/콜라겐 소용돌이 나 구슬 결합 하기 전에,에 걸쳐 균등 하 게 분산은 되도록 짧게 혼합물.</li>
	<li>플라스틱 EDC/NHS/구슬/콜라겐의 1 mL 나 혼합물 parafilm 다른 얕은, 평면 뚜껑 (작은 직경)의 상단에 배치의 조각에. 반전이 혼합물에 부드러운 실리콘 페 트리 접시는 부드러운 실리콘 표면 혼합물을 연결 하지만 아래 작은 페 트리 접시의 뚜껑의 표면을 직접 만지지 않는다. 거꾸로 페 트리 접시 스페이서의 양쪽에서 하나 또는 두 개의 유리 슬라이드를 사용 하 여 거꾸로 페 트리 접시, 인상. 참고: 그림 1 단계 2.7를 수행 하는 방법을 볼 수를 참조 하십시오.</li>
	<li>알루미늄 호 일 샘플을 커버 하 고 30 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 제거 하 고 그것을 똑바로 설정 (실리콘-쪽).</li>
	<li>접시에 PBS (pH 7.4)의 2 개 mL를 추가 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 부드러운 실리콘 표면 세척. 몇 분 동안 앉아 보자. PBS에서 aspirate 그리고 2 mL의 PBS로 다시 실리콘 세척. 실리콘 추가 대 한 치료는 하루에 대 한 하자. 그 이유로 장소 부드러운 실리콘 샘플 PBS에서 37 ° C에서 하룻밤.</li>
</ol>3. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 영역 들여쓰기와 실리콘 강성 측정
<ol><li>부드러운 실리콘 페 트리 접시를 검색 하 고 실리콘 표면 액체 표면 아래 몇 mm을 PBS의 1 mL 이상 포함 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>날카로운된 핀셋을 사용 하 여, 부드러운 실리콘에 5 1 m m 지르코늄 구체 indentors 드롭. 액체 매체에 구체를 담가 그리고 실리콘 레이어 및 다른 indentors의 위치에서 적어도 5 indentor 직경의 가장자리에서 그들을 드롭. 참고: 액체 표면 위에 떨어졌다 구체 실패할 수 있습니다 액체 매체 (부동 소수점) 입력 액체 매체의 표면 장력 때문.</li>
	<li>기본 페 트리 접시를 통해 이미지 수 있도록 현미경 스테이지에 부드러운 실리콘 페 트리 접시를 놓습니다.</li>
	<li>10 X 목표 단계 이미지를 사용 하 여 (건조 10 X 같은 나 0.30의 객관적인), 찾아서 초점으로 구체 indentor를가지고.</li>
	<li>부품의 단계 이미지는 indentor의 전부를가지고 고이 이미지를 저장. 타일 스캔을 사용 하 여 사용 가능한 경우. 어떤 눈에 보이는 결점에서 indentor 있으면 삭제 하 고 다른 indentor 바꿉니다.</li>
	<li>프레임의 왼쪽된 가장자리는 적어도 ~1.5 R indentor 센터에서의 거리를 라이브 단계 영상에서 indentor의 가장자리의 왼쪽에 이동 합니다. 센터는 indentor의 그대로 오른쪽 이미지 프레임의 오른쪽 가장자리 근처에 표시 됩니다 확인 하십시오. 단계 이미지 하 고 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>빨간 형광 채널에 대 한 조명 현미경 광원을 전환 합니다. X-및 y-좌표 변경 ( x-indentor 센터 내에서 하지만 프레임의 오른쪽 가장자리 근처의y 위치), 초점 (Z 감소) 아래로 구체 indentor의 센터 아래 빨간 형광 microbeads까지 그냥 초점 이동 합니다.</li>
	<li>(영상 프레임의 왼쪽된 가장자리) 근처 indentor 멀리 실리콘의 상위 계층에 microbeads 초점 이동까지 모든 z-0.5 µ m의 증가 대 한 이미지와 z 스택을 가져가 라.</li>
	<li>샘플에 다른 indentors와 3.4-3.8 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>4. 실리콘의 강성 (탄성 계수)를 계산
<ol><li>ImageJ, 선 도구에 클릭을 사용 하 여 indentor의 위상 이미지를 열고 픽셀에서 indentor의 직경을 측정 합니다. 클릭 한 채로 indentor 가장자리에 지점에 커서를 정반대로 반대 지점에 가장자리에 고 길이 픽셀 커서를 해제 하기 전에 ImageJ 메인 윈도우의 상태 표시줄에 표시 합니다.<ol>
<li>분석을 클릭 하 여 길이 단위를 픽셀로 설정 되어 있는지 확인 | 설정 규모 길이의 단위를 확인 하 고.</li>
		<li>객관적인 확대 및 CCD 카메라 픽셀 크기에 의해 μ m indentor의 반경 픽셀 단위 변환 (μ R = R x μ m에 CCD 카메라 픽셀 크기 (픽셀)에서 / 객관적인 확대).</li>
	</ol>
</li>
	<li>열고 microbead 이미지의 빨강 채널 z-스택 (해당 되는 경우는 microbeads는 빨간색 형광) ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 | 가져오기 | 이미지 시퀀스 고 스택의 모든 이미지를 선택 하 고 스택의 열을 확인 을 클릭 합니다. 참고: f 1에서 indentor 센터에서 microbeads 최상의 가능한 초점 이며 F2 프레임 번호는 프레임의 왼쪽된 가장자리 근처 (구슬 중심에서 R ~1.5의 지역)에서 microbeads에 있는 최상의 가능한 초점 프레임 번호입니다. Z-두 프레임 간의 차이 들여쓰기 깊이 δ.<ol>
<li>ImageJ에서 선 도구를 사용 하 여, 이미지에 잘 정의 된 microbead에서 선을 그립니다. 클릭 분석 | 프로필을 플롯 구슬에서 다른 프레임을 선택 하는 동안 업데이트 된 라인 스캔 강도를 라이브 버튼을 클릭 하십시오. 초점에서 프레임으로 최대 강도의 높은 가치를 제공 하는 프레임을 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>Z-z-스택 프레임 사이 증가 0.5 μ m 이므로, δ로 μ m에서 들여쓰기 깊이 계산 (F2-F1) = 0.5 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(마이너스 반대 부 력 힘), 그것의 무게 때문 indentor 여 즉 젤에가 해지는 힘을 계산, 들여쓰기 강제 F, 중력 때문에 가속도 x indentor-액체 매체의 밀도 (밀도) x indentor의 볼륨으로. 방정식 F 를 사용 하 여 = (4/3) x (ρindentor -ρ중간) x (R3) x 3.142 g R 은 indentor의 반지름 x ρindentor indentor, ρ매체 의 밀도 액체 매체의 밀도 이며 g 는 중력 (9.81 m/s2) 때문에 가속도. SI 단위의 F (N)를 오른쪽에 모든 수량을 표현 한다.</li>
	<li>영의 계수 (E) 수정된11 헤르츠 모델12 방정식을 사용 하 여 실리콘의 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> 장소: c =; 뒤에 헤르츠 모델 식을 수정 하는 수정 계수 v = (비압축 자료7에 관해서는 0.5로 찍은); 실리콘 젤의 Poisson의 비율 F = 들여쓰기 힘; R = indentor 반경; 그리고 Δ = 들여쓰기 깊이. 전자 실바에서를 SI 단위로 오른쪽에 모든 수량 표현<ol>
<li>보정 계수 c 3을 다음과 같이 계산 합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> 장소: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; 그리고 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. 이 수정 계수는 부드러운 실리콘 (있는 경우) 아래는 페 트리 접시 (또는 뻣 뻣 한 실리콘)을 잘 준수 하는 경우에 사용 하기 위해 특별히 주목 한다.</li>
		<li>H 양의 실리콘 추가 페 트리 접시 지름에 따라 부드러운 실리콘 층의 높이 계산 합니다. 또는, 직접 단계 영상에 의해 실리콘 층의 위쪽 및 아래쪽 표면의 z 좌표를 결정 하 여 h를 구하는 (작은 불순물 중 표면에 초점에와 서). 큰 h에 대 한 유의 (h2 &gt; Rδ), 보정 계수 c 1에 가깝다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 indentor 단계 4.1-4.4 반복 합니다. 영의 계수는 실리콘 샘플에 대 한 평균 탄성 계수를 각 indentor에서 얻은 평균.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

영역 들여쓰기 메서드는 쉽게 구현할 수, indentor의 선택과 부드러운 실리콘 샘플의 두께에 주의 지불 한다. 영의 계수를 계산 하는 데 사용 하는 방정식 조건11의 세트에서 유효 하 고 이들은 일반적으로 실리콘 샘플의 두께 indentor 반지름의 > 10% 일 때 만족 하 고 < indentor 반지름 x 13 ~. 우리는 발견 실리콘 두께 5-10 x의 indentor 반경 했다 좋은 선택, 어떤 점에서 샘플 두께 너무 높은 (즉, 객관적인 작동 거리 되지 않는다 제한) 계산된 강성 했다 또한 너무 민감한는 실리콘 두께의 정확한 값입니다. 구형 indentor의 선택 또한 들여쓰기 깊이 δ indentor 반지름의 < 10%로 서 실리콘 두께의 < 10% 되도록 해야 합니다. 염두에 두고 이러한 고려 하 여 다른 물자 및 직경의 indentors 부드럽고 엄격한 실리콘의 강성을 측정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 들여쓰기 깊이의 결정이이 프로토콜의 가장 중요 ...

부드러운 조직에 세포의 강성은 kilopascal 범위1, 누구의 강성은 몇 배나 더 높은 조직 문화 요리 달리 마이크로-환경에 거주. 세포 외 기질 단백질 코팅 부드러운 기판에 초기 실험 기판 강성 영향 어떻게 세포 이동으로2,3아래 기질을 보여주었다. 사실, 기판 강성 근본적으로 영향을 퍼지는 생 화 확 적인 신호를 유사한 방식으로 셀 기능4 . (세포 외 기질 단백질 코팅) polyacrylamide 젤은 (물 permeating) hydrogels mechanobiology 연구5대 문화 기질 세포로 광범위 하 게 사용 되었습니다. 입니다 (PDMS), 가장 일반적인 실리콘 (polysiloxane), 널리 사용 되었습니다 뻣 뻣 한 실리콘으로 megapascal 범위 강성과 마이크론 스케일 제조6. 더 최근에, 소프트 실리콘 기판 더 순수 관련 kilopascal 범위에서 경직 된 mechanobiology 연구7,8셀 문화 기판으로 고용 되었습니다.
여러 가지 방법은 유연한 기판, 원자 힘 현미경 검사 법, 스트레칭, 유동성, 및 들여쓰기 영역을 사용 하 고 둥글게 밀고 microindentors9 시 전체 샘플의 거시적인 변형 등의 강성을 측정 하는 데 사용 되었습니다. . 각 기술에는 그것의 자신의 이점 및 불리, 구체와 들여쓰기만 widefield 형광 현미경에 액세스 해야 하는 특히 단순 하지만 상당히 정확한 방법입니다. 금속 구체와 들여쓰기 hydrogels 이전 작업3,,910의 강성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다. 셀 운동 기판 강성의 중요성을 설명 하는 초기 작업 히드로 기판 강성3를 결정 하는이 방법을 활용. 더 최근에, confocal 현미경 검사 법 또한 우아한 특성10에 대 한 사용 되었습니다.
여기, 우리 제시 부드러운 실리콘 기판 준비 단계별 프로토콜 형광 구슬 커플링 (과 콜라겐과 같은 세포 외 기질 단백질 나) 상단 표면에 단지 단계 들여쓰기 구와 최고 표면 사용 하 여 이미징 및 형광 이미징, 각각, 그리고 마지막으로 실리콘 기판의 영의 계수를 계산 하기 위해 이미지를 분석. 이 방식으로 준비 하는 부드러운 실리콘 기판 견인 힘 현미경 실험에 대 한 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 기반으로 (배양 접시) 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용은 또한 mechanobiology 연구를 외부 뻗 기를 사용 하 여 수 있습니다. 보증, 어디 가능한 합병증 방지에 필요한 실용적인 고려 사항 또한 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>&nbsp; Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td><td>-20°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>써모 사이언티픽&nbsp; Pierce Sulfo-NHS crosslinker</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>4&deg에 보관; C</td></tr><tr><td>카르복실 형광 분홍색 입자, 0.4-0.6 &마이크로; m, 2mL</td><td>스페로텍, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>4°C에 보관; C,</td></tr><tr><td>1.0mm 산성 세척 지르코늄 비드</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>오존 진공 청소기가 있는 딥 UV 챔버</td><td>Novascan Technologies, Inc.를</td> 동결하지 마십시오.<td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>광시야 형광 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 I, 쥐 꼬리</td><td>Corning</td><td>354236</td>에서 <td>재고 농도 = 4 mg/ml; 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>공용</td><td>도메인 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

widefield 형광 현미경을 사용 하 여 mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

인간의 신체에서 부드러운 조직 일반적으로 kilopascal (kPa) 범위에 강성을 있다. 따라서, 실리콘 및 히드로 유연한 기판 경작 조건 비보에 부분적으로 모방 하는 실제 microenvironment에서 셀에 대 한 유용한 기판 될 입증 되었습니다. 여기, 우리가 영의 계수 등방성 선형 탄성 기판 mechanobiology 연구에 일반적으로 사용의 특성화에 대 한 간단한 프로토콜 제시. 준비 하는 페 트리 접시 또는 뻣 뻣 한 실리콘에 부드러운 실리콘 기판, 형광 구슬 실리콘 기판의 윗 표면 코팅,는 형광 이미징 (중력)에 의해 상면을 밀리미터 단위 구체를 사용 하 여 프로토콜 구성 들여쓰기 실리콘에 구슬 표면 형광 현미경을 사용 하 여 및 실리콘 기판의 영의 계수 계산 결과 이미지를 분석 합니다. 기판의 상면 (형광 구슬) 뿐만 아니라 응용 세포 외 기질 단백질 커플링 실리콘 기판을 셀 도금 및 견인 힘 현미경 실험을 사용 하 여 후속 연구에 쉽게 사용할 수 있습니다. 부드러운 실리콘 베이스로 페 트리 접시 대신 뻣 뻣 한 실리콘의 사용을 외부 뻗 기를 포함 하는 mechanobiology 연구를 사용 하 여 수 있습니다. 이 프로토콜의 구체적인 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 widefield 형광 현미경,이 절차에 필요한 주요 장비입니다. 우리는 다른 탄성 계수의 부드러운 실리콘 기판의 영의 계수를 측정 하 여이 프로토콜을 보여 줍니다.

위에서 자세히 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여, 우리 준비 35 mm 페 트리 접시에에서 부드러운 실리콘, 30 분 동안 70 ° C에서 그것을 치료 하 고 형광 microbeads 결합 (및 콜라겐 나) 개요로 서 그림 1에 표시 된 위쪽 표면에. 깊은 UV 기판13커플링 최종 단백질에 대 한 이전 사용 되었습니다. (나) 경화 조건 여기에 사용 되는이 부드러운 실리콘 및 (II) 들여쓰기 측정 관련 소프트 실리콘 하루의 과정을 통해 조금 더 치료 예상 대로 다음날에 수행 됩니다.
실리콘 표면의 구형 들여쓰기를 특성화 하는 다양 한 매개 변수는 그림 2A에 표시 됩...

Kilopascal 범위에 있는 강성과 기판은 순수 관련 마이크로 환경 강성을 세포의 반응을 유용 합니다. Widefield 형광 현미경을 사용 하 여, 소프트 실리콘 젤의 영의 계수는 들여쓰기를 사용 하 여 적합 한 영역을 확인할 수 있습니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

이 방법은 기계생물학, 세포 이동 및 1세대의 주요 현상을 연구하는 데 사용되는 기질을 분류하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 장비인 광시야 현미경을 사용해야 한다는 것입니다. 이 방법은 실리콘 polyacrylamide 젤의 Young의 계수, 뿐 아니라 연약한 등방성 선형 탄력 있는 물자의 무엇이든 측정하기 위하여 적용될 수 있습니다.이 방법으로 제조되고 특성화 된 기판은 뻣뻣한 실리콘베이스를 사용한 자체 스트레칭 실험에도 사용할 수 있습니다. 연질 실리콘 엘라스토머 키트에서 성분 A와 B를 각각 약 1.75g씩 가중한 후 연질 실리콘 기판을 제작하려면 성분 A의 계량된 부분 대부분을 B 성분 폴리스티렌 계량 트레이에 추가하고 적절한 애플리케이터 스틱을 사용하여 두 성분을 5분 동안 함께 혼합합니다. 혼합물을 35mm 페트리 접시에 옮기고 기질이 몇 분 동안 페트리 접시 전체에 고르게 펴지도록 합니다.그런 다음 페트리 접시를 진공 챔버에 15분 동안 넣어 기포를 제거하고 핫 플레이트를 예열합니다. 핫플레이트가 섭씨 70도에 도달하면 핫 플레이트에 유리 슬라이드를 놓고 페트리 접시를 유리 면에 놓습니다. 그런 다음 실리콘을 섭씨 70도에서 30분 동안 경화시킵니다.부드러운 실리콘을 형광 구슬과 결합하려면 경화된 실리콘을 UV 램프에서 5-10cm 떨어진 깊은 UV 챔버에 놓고 샘플을 5분 동안 깊은 자외선에 노출시킵니다. 실리콘을 처리하는 동안 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 500마이크로리터의 탈이온수에 19mg의 EDC를 녹입니다. 그리고 화학 물질을 용해시키기 위해 튜브를 와류로 만듭니다.다음으로, 두 번째 1.5 밀리리터 튜브에 500 마이크로리터의 탈이온수를 11 밀리그램의 설포-NHS에 추가합니다. 그리고 화학 물질을 용해시키는 와류. 그런 다음 EDC 및 sulfo-NHS 용액을 단일 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다.이제 30마이크로리터의 플루오로-4 복합 카르복실레이트 변형 마이크로 비드의 적절한 현탁액과 0.02mg의 쥐꼬리 콜라겐 1을 혼합물에 추가합니다. 잠시 와류를 일으킨 후, 두 번째 더 작은 직경의 뚜껑에 파라필름 조각을 놓고 EDC-NHS 비드 콜라겐 1 혼합물 1ml를 파라필름에 옮깁니다. 부드러운 실리콘이 들어있는 페트리 접시를 혼합물 위에 뒤집고 두 개의 유리 슬라이드로 양쪽의 접시를 지지하여 부드러운 실리콘 표면이 아래의 더 작은 직경의 뚜껑 표면에 직접 닿지 않고 비드 용액과 접촉하도록 합니다.그런 다음 실온에서 30분 동안 샘플을 알루미늄 호일로 덮고 실리콘을 세척당 2밀리리터의 PBS로 두 번 세척하고 실리콘을 섭씨 37도에서 2밀리리터의 신선한 PBS로 하룻밤 동안 똑바로 경화시킵니다. 다음 날 아침, 뾰족한 핀셋을 사용하여 실리콘 층의 가장자리에서 최소 1밀리리터의 PBS 아래에 있는 부드러운 실리콘에 5mm 지르코늄 구 압입기를 드리우고 다른 압입력의 위치에서 최소 5개의 압입기 직경을 떨어뜨립니다. 다음으로, 연질 실리콘 접시를 광시야 현미경 스테이지에 놓고 10x 대물렌즈를 사용하여 눈에 띄는 결함이 없는 전체 압흔의 위상 이미지를 얻습니다.이미지를 저장한 후 형광 마이크로 비드를 시각화하기 위한 적절한 형광 채널을 선택합니다. 인덴터 중심이 프레임의 오른쪽 가장자리 근처에 있는 상태에서 구 인덴터의 중심 아래에 있는 형광 마이크로 비드가 초점에서 벗어날 때까지 z 좌표를 줄입니다. 그런 다음 이미징 프레임의 왼쪽 가장자리 근처에 있는 실리콘의 상단 레이어에 있는 마이크로 비드가 들어왔다가 초점이 벗어날 때까지 0.5마이크로미터 z-증분마다 이미지가 있는 z-스택을 획득합니다.실리콘 강성을 계산하려면 먼저 ImageJ에서 인덴터 위상 이미지를 열고 분석을 클릭하여 스케일을 설정하고 길이 단위를 확인하여 길이가 픽셀로 설정되어 있는지 확인합니다. 선 도구를 사용하여 들여쓰기 가장자리의 한 점을 길게 클릭하고 커서를 정반대쪽 가장자리의 점으로 이동하여 들여쓰기의 지름을 측정하고 커서를 놓기 전에 ImageJ 주 창의 상태 표시줄에서 길이를 픽셀 단위로 확인합니다. 그런 다음 파일 메뉴를 열고 이미지 시퀀스 가져오기를 선택하여 형광 마이크로 비드 이미지의 z 스택에 있는 이미지를 선택할 수 있도록 하고 확인을 클릭하여 스택을 엽니다.라인 도구를 사용하여 하나의 이미지에서 잘 정의된 마이크로 비드를 가로질러 선을 그리고 실시간으로 플롯 프로파일 분석을 클릭하여 다른 프레임을 선택하면서 비드 전체에서 업데이트된 라인 스캔 강도를 얻을 수 있습니다. 그런 다음 최대 강도의 가장 높은 값을 제공하는 프레임을 초점이 맞는 프레임으로 선택할 수 있습니다. x-y 프레임 위치에서 촬영한 실리콘의 상단 표면에 있는 마이크로 비드의 형광 이미지는 인덴터 아래 영역을 프레임의 맨 오른쪽에 배치합니다.그런 다음 프레임의 맨 왼쪽에 있는 영역이 들여쓰기에서 멀리 떨어진 영역으로 선택됩니다. 단일 마이크로 비드에서 측정된 이 대표적인 강도 라인 스캔 세트에서 초점은 0.5마이크로미터의 z 단위로 다양합니다. 그런 다음, 인-포커스 이미지에 해당하는 z-값은 가장 높은 최대 강도를 갖는 라인 스캔에 해당하는 z-값을 기반으로 객관적으로 선택될 수 있습니다.여기서, 다양한 A:B 성분 혼합 비율에 대한 실리콘의 Young's modulus는 방금 설명된 방법을 기반으로 얻어졌습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 부드러운 실리콘 기판을 준비하고, 형광 비드를 컵에 넣고, 광시야 형광 현미경을 사용하여 기판의 강성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 글로벌 또는 지역화된 스트레인 응용 프로그램에 대한 응답으로 하나의 살아있는 자기편 세포에서 유도된 핵 및 cytoskeletal deformations을 측정하기 위해 두 개의 독립적인, 현미경 기반의 도구를 제시한다. 이러한 기술은 핵 강성 (즉, deformability)을 확인하고 핵과 cytoskeleton 세포 사이에 강제로 전송을 탐사하는 데 사용됩니다.

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

여기 셀 강성을 측정 할 수있는 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법의 일반적인 원리는 세포 표면에 micropipette를 통해 적용 잘 정의 된 부정적인 압력에 대한 응답으로 막 변형을 측정하는 것입니다. 이 방법은 기판에 연결된 세포의 biomechanical 속성을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.

기판에 연결된 전지의 Micropipette의 열망은 셀 강성을 추정하기 위해

이 논문은 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 microindentation을 통해 살아있는 세포의 기계적 특성을 특성화 할 수있는 프로토콜을 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

여기에서는 멀티웰 플레이트 형식의 폴리아크릴아미드 겔을 빠르고 효율적이며 저렴하게 준비할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 특수 장비가 필요하지 않으며 모든 연구 실험실에서 쉽게 채택할 수 있습니다. 경직성 의존적 세포 반응을 이해하는 데 중점을 둔 연구에 특히 유용할 것입니다.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

우리는 원자력 현미경을 사용하여 마우스에서 대동맥을 분리하고 탄성 계수를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

의 강성 측정<em&gt; 전의 VIVO</em원자 힘 현미경을 사용하여&gt; 마우스 대동맥

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

우리는 최근에 당뇨병과 관련된 망막 기능 장애에 대한 새로운 패러다임으로 망막 모세 혈관 경직을 확인했습니다. 이 프로토콜은 망막 내피 배양에서 마우스 망막 모세혈관과 내피하 기질을 분리하는 단계를 자세히 설명한 다음 원자력 현미경을 사용한 강성 측정 기술에 대해 설명합니다.

Isolation of Mouse Retinal Capillaries and Subendothelial Matrix for Stiffness Measurement Using Atomic Force Microscopy

여기에서는 공압식으로 작동되고 고해상도 현미경 검사와 호환되는 다목적 등축 스트레칭 장치를 제시합니다.

고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

골드에 긴 사슬 alkane thiols의 형성에서 자기 조립 monolayers은 (샘스) 단백질 패턴 및 셀 감금의 형성을위한 잘 정의된 기판을 제공합니다. 와 backfilling 다음 polydimethylsiloxane (PDMS) 스탬프를 사용하여 hexadecanethiol의 Microcontact 인쇄 글리콜 - 종료 alkane thiol 모노머는 스탬프 hexadecanethiol 지역에 단백질과 세포 adsorb 패턴을 생산하고 있습니다.

단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

배우세요 와이드필드 형광 현미경을 사용하여 부드러운 실리콘 기판의 영률을 측정하는 방법을. 이 기술은 기계생물학 연구에서 세포가 기판 강성에 반응하는 것을 연구하는 데 활용됩니다.

Widefield 형광 현미경을 사용 하 여 Mechanobiology 연구에 대 한 부드러운 실리콘 기판의 강성 측정

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