Name: 효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 학습하세요 TET2 단백질 정화 및 LC-MS/MS 기반 활성 분석 방법을 통해 후성유전학 연구를 진행하는 방법을. 이 프로토콜은 E.coli에서 단일 단계 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 90% 이상의 순도로 TET2 효소를 정화하고, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 활성을 정량 분석합니다.

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이 연구는 미국 국방부의 아이디어 상 (W81XWH-13-1-0174), Aplastic 빈 혈 및 MDS 재단 보조금의 형태로 의해 투자 되었다 그리고 mm은 저자 UMRB 그랜트 감사 Mohit Jaiswal Subhradeep Bhar pDEST14 벡터에 TET2의 초기 복제에 대 한.

1. 복제 및 태그 인간 TET2 Dioxygenase의 정화
<ol><li>앞에서 설명한22으로 사이트별 재조합 기술을 사용 하 여 pDEST14 대상 벡터에 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 복제. 참고: 이전 연구 C 터미널 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843) 도메인은 최소한의 촉매로 활성 도메인21,23증명 하고있다. PDONR221 벡터를 사용 하 여 태그 TET2 dioxygenase 도메인을 표현 하기 위하여 빛나는 Dalgarno 및 Kozak 시퀀스는 PCR (표 1) 중 앞으로 뇌관에 통합 했다.</li>
	<li>세균성 변환에 대 한 추가 태그가 인간 TET2 dioxygenase (TET2 1129-1936 년, Δ1481-1843)의 화학적으로 유능한 대장균 100 µ L 포함 하는 재조합 pDEST14 식 벡터의 1 µ L BL21 (DE3) 셀 1.7 mL 튜브에. 30 42 ° C에서 열 충격 이어서 적어도 15 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 물 욕조에 s.<ol>
<li>열 충격 후 즉시 다시 최소 2 분의 얼음에 셀을 계속. 이것 다음, 셀에 catabolite 억압 (S.O.C 미디어) 슈퍼 최적의 국물의 250 µ L를 추가 합니다. 통에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 세균 세포를 품 어.</li>
		<li>부 화, 후 pipetting으로 1 분 취소 70% 상쾌한 9000 x g에서 튜브 centrifuging 여 셀 아래로 회전 하 고 미디어를 통해 왼쪽에 펠 릿을 녹.</li>
		<li>Luria 국물 (파운드) 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 하에 세포 현 탁 액을 확산. 16 h 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
	</ol>
</li>
	<li>하나의 고립 된 식민지를 선택 하 고 50 mL 튜브에 파운드-암 피 실린 미디어의 10 mL에 접종. 하룻밤을 위해 통에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 이 어 50 mL 튜브에서 문화의 100 µ L를 사용 하 여 미디어 파운드-암 피 실린의 100 mL를 접종 하. 기본 문화권으로 사용 하 여 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 다음 날, 주 문화의 각 6 mL를 사용 하 여 접종 15 플라스 크, 각 포함 600 mL 파운드-암 피 실린 미디어. 자, 180 rpm에서 통에 37 ° C에서 15 플라스 크를 품 어. 참고: 변환 된 클론을 확인에 대 한 격리 된 플라스 미드 DNA와 DNA 시퀀싱 또는 제한 소화를 수행 합니다.</li>
	<li>세균성 문화의 밀도 확인 하는 분 광 광도 계를 사용 하 여 그것의 OD600 을 측정 합니다. 문화에는 OD600에서 0.8의 밀도 도달 하면, 각 플라스 크에 1 M (600 mL에 0.5 m m의 최종 농도) IPTG의 300 µ L와 TET2 단백질의 표현을 유도 하 고 16 h 17 ° c.에 대 한 문화를 더욱 성장</li>
	<li>16 h 후 원심 분리기 병 세균성 문화를 전송 합니다. 원심 45 분 사용에 대 한 5250 x g에 TET2 효소를 표현 하는 세균성 문화 TET2 정화에 대 한 세균 펠 릿. 얼음 또는 4 ° c.에 모든 나머지 단백질 정화 단계를 수행 하는 참고:</li>
	<li>50mm MES의 100 mL에서 세균 펠 릿 resuspend (2-(N-morpholino) ethanesulfonic 산) 버퍼, pH 6 및 전력 20 60 s 냉각 간격에서 5 × 30 s sonicate.</li>
	<li>회전 45 분에 대 한 5250 x g에서 lysate 수용 성 TET2 효소를 포함 하는 상쾌한을 수집 하 고 0.45 μ m 통과 FPLC 시스템에 로드 하기 전에 필터링 합니다. 참고:이 실험에서 TET2 효소 매우 안정 하지만 필요한 프로 테아 제 억제 물 칵테일 포함 1 mM benzamidine-HCl, 1 mM phenylmethylsulphonyl 불 (PMSF), 그리고 0.5 m m 1,10-o-phenanthroline lysate를 셀에 추가할 수 있습니다. TET2 효소의 저하를 방지 합니다. 로이 다음 양이온 교환 크로마토그래피를 방해할 수 있습니다 칵테일 억제제에 EDTA 또는 EGTA를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>FPLC 열에 강한 양이온 교환 수 지의 30 mL 팩. 10 침대 양의 워시 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6) 0.3 mL/min FPLC 시스템을 사용 하 여 일정 한 유량으로 열 equilibrate</li>
	<li>로드는 명확히 미리 equilibrated 열에 ∼10 침대 양의 워시 버퍼를 통해 흐름 취소 될 때까지 세척 lysate.</li>
	<li>TET2 elute 0-100을 사용 하 여 15 침대 볼륨에서 차입 버퍼 (50mm MES 버퍼, pH 6, 1 M NaCl) 워시 버퍼에서 그라데이션 % 다음 2 침대 볼륨 100% 차입 버퍼에서 개최. 참고: 셀 열 모든 차입 분수와 함께 로드 전후 lysate의 샘플 (100 µ L 각)를 수집 하 고 10 %SDS-PAGE 해결에 분석.</li>
	<li>포함 하는 TET2 단백질 분수 풀, 동결 건조, 분해 효소 팔레트 10 mL 물에-80 ° c.에 게</li>
</ol>2. TET2 Dioxygenase에 의해 5mC 산화
<ol><li>3 µ g (25-메 르 이중 좌초 DNA, 표 2) 기판의와 3 중에서 모든 demethylation 반응을 수행 합니다.<ol>
<li>순화 TET2 효소의 100 µ g 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µ M FeSO4, 2mm 2OG 포함 하는 전체 반응 버퍼의 50 µ L에 추가 (2-oxoglutarate/α-ketoglutarate), 그리고 2 mM 하는데 1 h2137 ° C에서 품 어와.</li>
		<li>500 mM EDTA의 5 µ L와 TET2 촉매 산화 반응을 끄다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TET2 반응, 냉각 후 올리고 정화 열을 사용 하 여 TET2 반응 혼합물에서 DNA를 분리 하 여 LC-MS/MS 분석에 대 한 샘플을 준비 합니다.<ol>
<li>침묵과 반응의 55 µ L를 올리고 바인딩 버퍼의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>이 따라 400 µ L 100% 에탄올의 혼합물에 추가 합니다. 이 혼합 올리고 바인딩 열을 통해 전달 합니다.</li>
		<li>750 µ L 워시 버퍼와 바운드 DNA를 세척 하 고 20 µ L 물에 elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소화 DNase의 2 대와 고립 된 DNA 나 고 S1 nuclease 12 h 37 ° C에서 60 단위 개별 nucleoside monophosphates를 생산 하.</li>
	<li>소화, 다음 샘플에서 종 아리 장 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (CIAP)의 2 대를 추가 하 고 또한 nucleosides를 nucleoside monophosphates에서 터미널 인산 염 그룹을 제거 하려면 37 ° C에 12 h에 대 한 품 어.</li>
	<li>모든 nucleosides, 아래에 설명 된 LC-MS/MS 방법을 사용 하 여 특히 수정 된 cytosines 계량.</li>
</ol>3. 양적 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발
<ol><li>[5-메 틸-2-deoxycytidine (5mdC), 5-hydroxymethyl-2-deoxycytidine (5hmdC), 5-formyl-2-deoxycytidine (5fdC), 및 5-카-2-deoxycytidine (5cadC)] 모든 수정된 시 토 신 nucleosides의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 하 고 정상적인 DNA 기초 (아데닌, thymine, 구 아닌, 시 토 신) LC-MS/MS 방법의 개발을 위한 HPLC 급 물.</li>
	<li>재고 솔루션을 한 번에 하나씩 일으키는 nucleoside 종속 MS/MS 매개 변수 최적화, EMS에 10 µ L/min 흐름 속도에 질량 분석기에서 스캔 모드. 다음 매개 변수 최적화: 양적 최적화 자동 각 DNA nucleoside 사용에 대 한 잠재적인 (DP), 입구 잠재력 (EP), 충돌 셀 입구 잠재적인 (CEP), 충돌 에너지 (CE), 및 충돌 셀 출구 잠재적인 (CXP) Declustering 소프트웨어의 기능입니다.</li>
	<li>25% 용 매 B 용 매 A는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0) 및 용 매 B는 10 m m 염화 아세테이트 (pH 4.0)와 20% 이기 0.3 mL/min의 유량과 그라디언트를 사용 하 여 재고 솔루션의 주입 10 µ L 여 소스 종속 MS/MS 매개 변수를 최적화 합니다. 다음 매개 변수 최적화: 커튼 가스 (CUR): 10-50, 온도: 0-600 ° C, 가스 흐름 1 (GS1): 0-50, 가스 흐름 2 (GS2): 0-50, Collisionally 활성화 분리 (CAD): 낮은-중간-높은, 이온 스프레이 전압 (IS): 4000-5500 설명서를 사용 하 여 각 DNA nucleoside에 대 한 FIA (흐름 주입 분석) 모드에서 소프트웨어의 양적 최적화 기능.</li>
	<li>모든 8 개의 DNA nucleosides, 별도로 수행 다음 그라디언트를 사용 하 여 액체 착 색 인쇄기: 0% 용 매 B (0-2 분), 0-20% 용 매 B (2-5 분), 20-60% 용 매 B (5-9 분), 60-0% 용 매 B (9-10 분)와 다음 0.3의 흐름 율에 5 분에 대 한 용 매 A와 equilibrate C18 열에 mL/min (입자 크기: 5 µ m, 기 공 크기: 120 Å).</li>
	<li>위에서 언급 한 액체 크로마토그래피 그라데이션 (단계 3.4)와 결합 하 여 최적의 MS/MS 매개 (3.2 및 3.3 단계)를 사용 하 여 확인 응답 선형성, 탐지 (LOD)의 제한 및 정량화 (LLOQ)를 사용 하 여 낮은 두 배 모두 8 개의 nucleosides를 포함 하는 100 µ M 표준 혼합 직렬 희석 모든 8 개의 DNA nucleosides에 대 한 표준 곡선을 그립니다.</li>
	<li>검색 및 모든 nucleosides, 특히 수정 된 cytosines 단계 2.4 LC-MS/MS 방법 및 표준 곡선을 사용 하 여에서 생산 계량.</li>
</ol>

<ol><li>Suzuki, M. M., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+landscapes%3A+provocative+insights+from+epigenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics.</a> Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).</li>
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</ol>

저자는 선언에 아무런 재정적 이익이 있다.

TET2 유전자에 있는 돌연변이 다양 한 조 혈 악성 종양 환자에서 가장 많이 검색 된 유전자 변화입니다. 말도, 프레임 이동 및 missense 돌연변이 포함 하는 다른 TET2 돌연변이의 수백까지 환자12에서 확인 되었습니다. TET2 돌연변이 가진 환자 wt-TET214와 그에 비해 골에서 게놈 5hmC의 낮은 레벨을 표시 합니다. 실험 노크에서 돌연변이 TET2 transfected 세포145hmC 수준에이 돌연변이의 효과 지 있다. TET2-녹아웃 마우스 모델에서 결과 시연 TET2 효소의 수준은 반비례 조 혈 악성 종양17,,1819,20</s...

CpG 디 내에서 시 토 신 기지의 C5 위치는 포유류 유전자1에 주된 메 틸 화 사이트 (5mCpG)입니다. 또한, 최근 연구 된 광범위 한 C5 시 토 신 메 틸 화 (5mC) 비 CpG 사이트에서 발견 (5mCpH, 어디 H = A, T, 또는 C)2,3. 5mC 수정 생 retrotransposons 및 유전자 발기인3,,45에 transcriptional 소음 기 역할을 합니다. 5mC에서 DNA 메 틸 화는 또한 X 염색체 비활성화, 유전자 각 인, 핵 프로그래밍 및 조직 관련 유전자 식5,,67에 중요 한 역할을 재생합니다. C5 위치에서 시 토 신 메 틸 화 DNA methyltransferases에 의해 수행 됩니다 그리고이 효소에 돌연변이 발생할 상당한 발달 결함8. 5mC 표시의 제거는 TET1 3 5mC oxidases9,10에서 시작 됩니다. 이러한 TET 가족 dioxygenases 변환 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)와 5-carboxylcytosine (5caC) 순차 산화 단계11,,1213. 마지막으로, thymine DNA glycosylase 5 fC 또는 기본 절단 복구 통로11를 사용 하 여 수정 되지 않은 시 토 신을 5caC 대체 합니다.
인간 TET2 유전자 형성 증후군 (MDS)14,,1516, MDS myeloproliferative 신생 (를 포함 하 여 다양 한 조 혈 악성 종양에서 자주 돌연변이 유전자로 확인 됐다 MDS-MPN), 및 MDS와 MDS MPN16에서 발생 하는 급성 골수성 백혈병 (AML). 5hmC 수정 골 DNA에서에서의 레벨은 야생 타입 (wt)와 그에 비해 TET2 돌연변이와 환자에서 더 낮은-TET214. 그룹 수 일반 조 및 골수성 변환17,18,,1920에서 역할을 명료 하 게 TET2 녹아웃 마우스 모델을 개발 했습니다. TET2 유전자에 있는 돌연변이와이 쥐 되었고 처음 정상 가능한, 하지만 그들은 그들의 이른 죽음을 일으키는 노인으로 다양 한 조 혈 악성을 각 성. 이러한 연구는 정상적인 조 혈 차별화에서 wt-TET2에 의해 재생 중요 한 역할을 보여주었다. 이 마우스 모델, heterozygous 조 혈 줄기 세포 (TET2+ HSCs) 및에서 homozygous TET2-/- HSCs homozygous wt-TET2 HSCs 두 TET2+ 로 조 혈 계보를 다시 채우기에 비해 경쟁 우위를 했다 그리고 TET2-/- HSCs 개발 다양 한 조 혈 악성 종양17,18. 이러한 연구는 haploinsufficiency TET2 dioxygenase HSCs의 개발을 변경 하 고 조 혈 악성의 보여 줍니다.
TET2 유전자에 있는 돌연변이와 마우스와 마찬가지로, 대부분의 백혈병 환자 haploinsufficiency TET2 dioxygenase 활동의 명단. 이 주로 heterozygous 체세포 돌연변이 포함 가장 missense 돌연변이 동안 TET2 유전자 신체에 걸쳐 분산 프레임 시프트와 넌센스 돌연변이 dioxygenase 도메인12클러스터. 날짜 하려면, 작은 특성의 wt 및 돌연변이 TET2 TET2 dioxygenase 및 그것의 분석 결과21의 생산 어려움 때문에 주로 문학에 보고 됩니다. 여기, 우리는 이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 네이티브 TET2 dioxygenase의 간단한 단일 단계 정화를 보고 합니다. 또한, 양적 LC-MS/MS 분석 결과 최적화 되었고 네이티브 TET2 dioxygenase의 효소 활동을 측정 하는 데 사용.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>철 (II) 황산염 헵타 하이드레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr> <tr><td>&alpha; - 케토 글루타르산 (2- 옥소 글루타르산)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>L- 아스코르브 산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 디아민 테트라 아세트산 디 소듐 염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>올리고 클린 및 농축기</td><td>자이모 리서치</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 뉴클레아제</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP(송아지 장 알칼리 포스파타아제)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate]</td><td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sodium chloride Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP 세파로스</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-데옥시-5-메틸시티딘</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-데옥시-5-하이드록시메틸시티딘</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-데옥시시티딘-5-카르복실산, 나트륨 소금</td><td>베리 & 앰프; 어소시에이츠</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-포르밀-2'-데옥시시티딘</td><td>베리 & 어소시에이츠</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-데옥시시티딘</td><td>베리 & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxyadenosine</td><td>Carbosynth</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxyguanosine</td><td>Carbosynth</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxythymidine</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Gateway technology</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Allegra X-15R 원심분리기&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC 시스템</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 4.5 동결 건조 시스템</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo 정제 컬럼&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 컬럼</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Q-Trap 질량 분석기</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>시마즈 HPLC&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XK16/20 FPLC 컬럼</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-methylcytosine dioxygenase에 대 한 lc-ms/ms 기반 분석 결과 개발

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

5-methylcytosine (5mC)에 의해 중재 후 전사 조절 핵 개발에 중요 한 역할을 담당해 왔습니다. 이 후 성적인 표의 demethylation thymine DNA glycosylase 종속 기본 절단 복구 뒤 10-11 전 dioxygenases (TET1-3)에 의해 계속적인 산화에 의해 수행 됩니다. 유전 돌연변이 또는 다른 후 성적인 기계 장치에 의해 TET2 유전자의 비활성화 다양 한 암, 특히 조 혈 악성 종양을 가진 환자에 있는 빈약한 예 지와 연결 됩니다. 여기, 양이온 교환 크로마토그래피를 사용 하 여 태그 한 인간 효소 활성 TET2 dioxygenase의 효율적인 단일 단계 정화를 설명 합니다. 우리는 더 분리 하 고 4 개의 수정된 시 토 신 기초 (5-메 틸, 5-hydroxymethyl 일까 지, 5 formyl 그리고 5-carboxyl) 뿐만 아니라 (A, T, G와 C), 4 개의 정상적인 DNA 기초를 정할 수 있는 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 접근을 제공 합니다. 이 분석 결과 야생 유형 및 돌연변이 TET2 dioxygenases의 활동을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

TET 가족 dioxygenases에 의해 DNA에 5mC의 동적 수정 epigenetic transcriptional 규칙에 중요 한 역할을 담당합니다. TET2 dioxygenase는 다양 한 조 혈 악성 종양12자주 변경 됩니다. 일반 개발 및 질병 TET2 효소의 역할을 조사, 우리 pDEST14 벡터22에 어떤 선호도 태그를 하지 않고 최소한의 촉매로 활성 도메인을 복제 있다. 태그 TET2 dioxygenase 총 수용 성 단백질의 ∼5 %SDS 페이지 분석 박테리아에 의해 제작 되었다 대장균 BL21 (DE3) 세포. 때문에 TET2의 촉매 도메인은 대부분 원주민 대장균 단백질24,25,...

여기, 우리는 활성 태그 인간의 효율적인 단일 단계 정화에 대 한 프로토콜 10-11 전 2 (TET2) 제시 5-methylcytosine dioxygenase 이온-교환 크로마토그래피와 액체 크로마토그래피 탠덤 질량을 사용 하 여 그 분석 결과 사용 하 여 분석 (LC-MS/MS)-기반 접근.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

이 방법은 후성 유전학 및 TET2 중재 5-메틸 시토신 demethylation 분야에서 주요 질문에 대답 하는 데 도움이 될 수 있습니다 정상 및 임상 TET2 돌연변이의 활동의 이러한 분석. 이 기술의 주요 장점은 네이티브 TET2가 한 단계로 정제될 수 있고, 그 활동은 세 가지 제품의 형성 측면에서 분석될 수 있다는 것이다. 몇몇 대학원생은 절차를 시연할 것입니다.단백질 정제는 아닌다 순다리 데이의 TET2 분석, Navid Ayon의 LC-MS/MS 분석에 의해 수행됩니다. 세균 성 변형을 위해, 1.7 밀리리터 튜브에 화학적으로 유능한 E.coli BL21 DE3 세포의 100 마이크로 리터에 태그가 없는 인간 TET2 디산소아제를 포함하는 재조합 pDEST 14 대상 발현 벡터의 마이크로리터 1개를 첨가한다. 얼음에 잠복한 후 적어도 15분 동안, 열은 수조에서 30초 동안 섭씨 42도에서 혼합물을 충격에 빠뜨림.열 충격 직후, 세포를 얼음에 다시 2분 동안 놓습니다. 이에 따라, 세포에 이타볼라이트 억압을 가진 250마이크로리터의 초최적의 국물을 첨가하십시오. 셰이커에서 섭씨 37도에서 세균 세포를 1 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 튜브를 원심분리하여 1분 동안 000배의 중력을 원심분리하여 세포를 회전시합니다. 피펫팅으로 상체의 70%를 버리고 나머지 매체에 펠릿을 용해합니다. 릴리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 Lirua 국물 한마고 접시에 세포 현탁액을 퍼뜨리는 다.섭씨 37도에서 16시간 동안 접시를 배양합니다. 하나의 고립 된 식민지를 선택하고 LB 암피실린 미디어의 10 밀리리터로 접종하십시오. 하룻밤 사이에 37도에서 튜브를 배양하십시오.이에 따라, 100 마이크로리터의 세균 배양을 사용하여 LB 암피실린 배지의 100밀리리터를 1차 배양으로 접종한다. 하룻밤 사이에 37도에서 튜브를 배양하십시오. 다음 날, 15 플라스크, 각각 포함 600 LB 암피실린 미디어의 밀리리터 와 6 플라스크 당 기본 문화의 밀리리터.180 RPM에서 셰이커에 섭씨 37도에서 플라스크를 배양하십시오. 세균 배양의 밀도를 확인하려면 분광계를 사용하여 600 나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정합니다. 배양후 OD600에서 0.8의 밀도에 도달한 후, 각 플라스크에서 1개의 어금니 IPTG의 300마이크로리터를 가진 TET2 단백질의 발현을 유도하고, 섭씨 17도에서 16시간 동안 배양을 추가로 성장시한다.인큐베이션에 따라 세균 배양을 원심분리기 병으로 옮기. TET2 효소를 5, 250배의 중력으로 45분 동안 발현하는 세균 배양을 원심분리합니다. TET2 정제를 위해 세균 펠릿을 사용하십시오.얼음 또는 섭씨 4도에서 작업, 50 밀리머 MES 버퍼의 100 밀리리터에서 세균 펠릿을 다시 중단, pH 6. 그런 다음 셀 서스펜션의 5 밀리리터를 가져 와서 버퍼가있는 45 밀리리터로 가져 올 수 있습니다. 60초 냉각 간격으로 전원 20에서 서스펜션을 5회 30초 동안 초음파 처리합니다.45분 동안 5, 250배의 중력으로 용해를 회전시다. 용해성 TET2 효소를 함유한 상체를 수집하고 FPLC 시스템에 적재하기 전에 0.45 미크론 필터를 통과합니다. 강력한 양이온 교환 수지 30밀리리터를 FPLC 열로 포장합니다.FPLC 시스템을 사용하여 분당 0.3 밀리리터의 일정한 유량으로 10개의 침대 볼륨의 세척 버퍼로 컬럼을 상화합니다. 명확한 리자이트를 미리 평형 컬럼에 적재하고, 유동이 명확해질 때까지 약 10개의 침대 부피의 세척 버퍼로 세척합니다. Elute TET2는 세척 버퍼에서 15개의 침대 볼륨에서 용출 버퍼로 0~ 10%의 그라데이션을 사용하고, 두 개의 침대 볼륨에 대해 10%의 용출 버퍼에서 홀드를 제공합니다.모든 용출 분획과 함께 열 로딩 전후에 셀 용액 100 마이크로리터 샘플을 수집하고 SDS-PAGE 젤을 10% 분해하여 분석합니다. TET2 단백질을 함유한 분수를 풀링하고 단백질을 동결건조시합니다. 그런 다음 효소를 10 밀리리터의 물에 녹여 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.기판의 3 마이크로그램으로 삼중화물에 있는 모든 demethylation 반응을 수행합니다. 정제된 TET2 효소 100마이크로그램을 총 반응 버퍼 50마이크로리터에 추가합니다. 37도에서 1 시간 배양 후, 500 밀리알러 EDTA의 5 마이크로 리터와 TET2 촉매 산화 반응을 담금질.분석을 위해 샘플을 준비하기 위해, 먼저 담금질 반응의 55 마이크로 리터에 Oligo 결합 완충제의 100 마이크로 리터를 추가하여 TET2 반응 혼합물에서 DNA를 분리합니다. 이에 따라 혼합물에 100%에탄올의 400마이크로리터를 첨가한다. 이 혼합물을 올리고 바인딩 컬럼을 통과합니다.750 마이크로리터의 세척 완충제로 결합 된 DNA를 세척 한 후 20 마이크로 리터의 물에 DNA를 엘로트하십시오. 지금, 개별 뉴클레오시드 단인산염을 생성하기 위하여 12 시간 동안 37섭씨에서 DNase I및 S1 핵제의 60 단위의 2개의 단위로 고립된 DNA를 소화합니다. 소화 후, 샘플에 종아리 내장 알칼리 인산염의 두 단위를 추가합니다.37°C에서 추가 12시간 동안 인산염을 제거하여 뉴클레오사이드 단인산염으로부터 종자 인산염군을 제거하고 뉴클레오시드를 획득한다. 모든 수정된 사이토신 뉴클레오시드의 100 마이크로몰라 스톡 용액을 준비하고, LC-MS/MS 방법의 개발을 위해 HPLC 급 수에서 정상 DNA 염기를 제조한다. 향상된 MS 스캔 모드에서 분당 10 마이크로리터의 유속도로 질량 분광계에서 한 번에 하나씩 스톡 솔루션을 주입하여 뉴클레오시드 에 의존하는 MS/MS 파라미터를 최적화합니다.여러 파라미터는 각 DNA 뉴클레오시드에 대한 소프트웨어의 자동화된 정량 최적화 기능을 사용하여 최적화될 수 있다. 이 시점에서, 유동 분사 분석 모드에서 소프트웨어의 수동 정량 최적화 기능을 사용하여 각 DNA 뉴클레오시드에 대한 나머지 파라미터를 최적화한다. 이제 분당 0.3 밀리리터의 유량으로 25%의 용매 B를 사용한 그라데이션을 사용하여 10마이크로리터의 스톡 솔루션을 주입하여 소스 에 의존하는 MS/MS 매개변수를 최적화합니다.8개의 DNA 뉴클레오시드를 모두 분리하려면 C18 컬럼의 텍스트 프로토콜에 상세한 바와 같이 액체 크로마토그래피를 수행한다. 마지막으로, 표준 곡선에서 LC-MS/MS 방법을 사용하여 모든 뉴클레오시드를 검출하고 정량화합니다. TET2의 촉매 영역은 대부분의 토착 대장균 단백질과 비교하여 상대적으로 높은 동전점을 가지므로 양이온 교환 크로마토그래피를 활용한 효율적인 정제 과정이 개발되었다.이 정제는 한 단계에서 90% 이상의 순수 TET2 효소를 산출했습니다. TET2 효소 반응에 따라 상이한 디옥시티딘 유도체와 4개의 천연 DNA 베이스를 분리및 정량화하기 위해 민감한 LC-MS/MS 기반 분석이 최적화되었다. 표준 곡선은 모든 뉴클레오시드를 포함하는 혼합물의 직렬 희석을 사용하여 그려졌습니다.액체 크로마토그래피 MS/MS 방법의 결과는 여기에 나와 있다. 이 방법은 4개의 정상 DNA 기지뿐만 아니라 4개의 수정된 사이토신 염기의 분리 및 정량화를 허용합니다. 이 실험 절차에서, 우리는 E.Coli의 대상 벡터에서 사이트 별 재조합 기술과 충분한 발현을 사용하여 태그가 없는 인간 TET2 dioxynase 촉매 도메인의 복제를 설명합니다.우리는 한 단계에서 90 % 이상의 순도를 산출하기 위해 양이온 교환 크로마토그래피를 활용하여 태그되지 않은 TET2 효소를 효율적으로 정제했습니다. 또한, 4개의 정상 DNA 염기와 4개의 수정된 사이토신 기지를 분리하기 위한 새로운 액체 크로마토그래피 방법을 개발했습니다. TET2 촉매 반응에서 8개의 뉴클레오시드를 정량화하기 위해, 우리는 우리의 향상된 액체 크로마토그래피 방법과 탠덤 질량 분석법을 결합했습니다.민감한 LC-MS/MS 분석이 재조합적 태그가 없는 인간 TET2 효소의 활성을 결정하기 위해 활용되었다. 여기에 설명 된 접근 방식은 야생 유형 및 돌연변이 TET2 디산소제의 평가를 크게 향상시킬 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

EpiMark 5 HMC 5 - MC 분석 키트는 분석하고 spe cific 로커스 이내 5 methylcytosine 5 - hydroxymethylcytosine을 quantitate하는 데 사용할 수 있습니다. 키트는 β - glucosyltransferase (T4 - BGT)를 이용한 효소 반응을 통해 5 - HMC의 수산기 그룹에 포도당의 추가에 의해 5 - HMC에서 5 - MC를 구별. 5 HMC는 CCGG의 맥락에서 발생하면,이 수정은 아닌 cleavable 사이트에 cleavable MspI 사이트를 변환합니다.

Balb / C 뇌 조직에 높은 민감도는 5 hydroxymethylcytosine 감지

세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

우리는 마우스 배아 줄기 세포 배양에 대 한 두 개의 화학 기반 프로토콜 자세히 설명 합니다. 이 새로운 메서드 (비타민 C)에 의해 Tet 중재 산화를 촉진 하 고 DNA hypomethylation 마우스 배아 줄기 세포의 pluripotency를 유지 하기 위해 5-methylcytosine (PD0325901)에 의해의 de novo 종합 억압의 시너지 메커니즘을 활용 합니다.

MEK 억제제 PD0325901와 비타민 C를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포의 게놈 Hypomethylation 유지 하는 대안 문화 방법

자세한 프로토콜 설계 분할-TET2 효소 (사이 다) 화학 유도할 수 있는 DNA hydroxymethylation 및 후 리 모델링 포유류 세포에 도입 되 게 됩니다.

화학을 유도할 수 있는 DNA Hydroxymethylation 및 후 리 모델링 설계 분할-TET2 효소

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

프로토카테츄아제 3,4-디옥시게나아제(PCD)는 기질 인 프로토카츄산(PCA)을 사용하여 수성 시스템에서 자유 분무기 산소를 효소적으로 제거할 수 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 산소 제거 효소의 발현, 정제 및 활성 분석을 설명합니다.

뉴클레아제 없는 산소 제거제 프로토카테의 발현 및 정제 3,4-디옥시게나아제

DNA 메틸트랜스퍼라제는 잠재적인 항암제 표적입니다. 여기에서, DNA 메틸 트랜스퍼 라제 억제에 대한 소분자를 평가하기위한 프로토콜이 제시된다. 이 분석은 엔도뉴클레아제를 활용하여 DNA 메틸화를 형광 생성에 결합하고 효소 활성을 실시간으로 모니터링할 수 있도록 합니다.

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

롤링 서클 강화 효소 활성 검출 검정을 이용한 토포이소머라제 1 활성의 민감성 및 정량적 검출을 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 이 방법은 정제된 성분 또는 세포/조직 추출물로부터 토포이소머라제 1 활성의 검출을 허용한다. 이 프로토콜은 효소 활성의 검출과 관련된 모든 분야에서 광범위한 응용 분야를 가지고 있습니다.

간단하고 빠른 롤링 서클 증폭 기반 조잡한 생물학적 시료에서 토포이소머라제 1 활성 검출

여기에서 우리는 분자 산소를 소비하는 능력과 독립적으로 포유류 세포의 미토콘드리아 기능을 직접 측정하기 위한 분석 모음을 제시합니다.

포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

액체 크로마토그래피, 포획 이온 이동도 분광법 및 비행 시간 질량 분석법(LC-TIMS-ToF MS/MS)을 기반으로 하는 분석 워크플로우는 주요 매개변수(머무름 시간[RT], 충돌 단면[CCS] 및 정확한 질량 대 전하[m/z] 비율)를 기반으로 히스톤 변형 및 식별에 대한 높은 신뢰도와 재현성 있는 "상향식" 분석을 제공합니다.

액체 크로마토그래피, Trapped Ion Mobility Spectrometry 및 Time-Of-Flight Mass Spectrometry를 사용한 Histone Modification Screening

학습하세요 TET2 단백질 정화 및 LC-MS/MS 기반 활성 분석 방법을 통해 후성유전학 연구를 진행하는 방법을. 이 프로토콜은 E.coli에서 단일 단계 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 90% 이상의 순도로 TET2 효소를 정화하고, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 활성을 정량 분석합니다.

효율적인 정화와 10-11 전-2 5-Methylcytosine Dioxygenase에 대 한 LC-MS/MS 기반 분석 결과 개발

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