Name: 단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: 배우세요 효모 2잡杂交 스크린을 이용한 단백질 상호작용 비교 분석 방법입니다. pTEF-GBD 미끼 플라스미드와 딥 시퀀싱을 활용하여 다양한 미끼 단백질의 상호작용 프로파일을 병렬 비교하고 차등 상호작용체를 식별할 수 있습니다.

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우리 직원을 내에서 연구소의 인간 유전학 NGS 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 대 한 감사합니다. 여기 Y2H 플라스 미드 도서관에 대 한 게놈 라이브러리 조각 준비에 그녀의 전문성에 감사 Einat Snir 하 고. 이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다: NIH R21 EB021870-01A1 NSF 연구 프로젝트 그랜트에 의해: 1517110.

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저자 공개할 게 없다

여기 우리는 최적화 된 방법을 사용 하 여 일괄 처리에서 Y2H 분석 실험을 수행 하는 방법에 대 한 가이드를 제공 합니다. 선택 아래에 배치 될 것 이다 효 모의 인구 시작 라이브러리의 대표는 하 고 충분히 시작 효 모 인구 다양성을 제한 하는 선택을 사용 하는 절차에 있는 몇 가지 중요 한 단계 . 중요 한 것은, 이러한 벤치 마크는 적응 방법 및 전통적인 Y2H 분석 결과, 따라서이 방법은 대부분 실험실 표준 분자 생물학 장비에 액세스할 수 만들기에 대 한 자료와 함께 달성 하기 상대적으로 쉽다. DEEPN 다른 미끼 플라스 미드를 사용 하는 동안 같은 먹이 라이브러리 인구에서 선택 영역을 수 있습니다. 따라서, 다른에 대 한 미끼와 Y2H 상호 작용을 생성 하는 상호 작용의 세트는 직접 비교할 수 있습니다. 깊은 시퀀싱을 사용 하기 때문에 각 미끼 별 효 모 인구에 대 한 시작 라이브러리 구성을 확인 하 고 라이브러리에서 각 후보 먹이 유전자의 농축을 독립적으로 수행 수 하나. 일괄 처리는 다음 계산 통계 순위<sup c...

세포 생물학 과정의 완전 한 이해를 찾는 그들의 분자 메커니즘의 기반이 되는 단백질 상호 작용 네트워크에 의존 합니다. 단백질 상호 작용을 식별 하는 한 가지 방법은 효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과, 관심의 두 단백질 도메인 바인딩할 다른1일단 작동 공상 전사 요소를 조립 하 여 작동 하는. 전형적인 Y2H 화면 인코딩 상호 작용 단백질에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 플라스 미드의 두 도서관 효의 인구를 생성 하 여 수행 됩니다 (예., '먹이' 퓨전 단백질)와 주어진된 '미끼' 플라스 미드 단백질의 구성 관심사의 DNA 바인딩 도메인 (예를 들면,에 Gal4 상류 활성화 순서 Gal4 DNA 바인딩 도메인)에 융합. Y2H 접근의 주요 장점 중 하나 그것은 상대적으로 쉽게 하 고 일상적인 분자 생물학 작업2에 대 한 일반적인 실험실에서 수행 하는 저렴 한 장비입니다. 그러나 때 전통적으로 수행, 사용자 긍정적인 Y2H 상호 작용에 대 한 선택 사항에 따라 발생 하는 개별 식민지를 샘플링 합니다. 이 심각 하 게 조사 될 수 있는 라이브러리 '먹이' 클론의 수를 제한 합니다. 이 문제는 때 특정 상호 작용 먹이의 풍부한 매우 낮은 풍부한 먹이 플라스 미드에서 상호 작용 검출의 기회를 감소, 다른 기준으로 복합입니다.
Y2H 원리는 프로테옴의 포괄적인 범위에서 사용 하기 위한 하나의 솔루션 알려진된 개별 먹이 플라스 미드를 포함 하는 배열을 디지털 심문 될 수 있습니다 어떤 점에서 매트릭스 형식의 접근 방법의 사용 이다. 그러나, 이러한 접근 되지 않는 쉽게 액세스할 수 또는 비용 효율적인 단백질 또는 도메인3의 적은 수의 위하여 정의에 관심이 개별 조사 하는 인프라가 필요 합니다. 또한, 상호 작용 단백질의 여러 단편을 인코딩할 수 있습니다 매우 복잡 한 먹이 라이브러리 것 허무 크기 같은 매트릭스 배열의 크기를 확장 합니다. 대안은 배치에서 복잡 한 라이브러리와 분석을 수행 하 고 대규모 병렬 높 처리량 연속4를 사용 하 여 상호 작용 클론의 존재를 평가 하는 것 이다. 이 일반적인 사용 하 여 여러 식민지에서 발생 하는 먹이 플라스 미드의 존재를 시험에 적용할 수 있는 Y2H 형식의 접근을 효 모에 세포 융해 단백질의 상호 작용 쌍 주택 접시5,6에 성장 수 있습니다. 이 일반적인 생각 쿼리 두 여러 미끼의 증가 먹이 같은 시간7,8에서 구성 요소를 강조 될 수 있습니다.
아직도, 많은 조사 쉽게 아직 더에 초점을 맞춘 노력 불과 단백질 '미끼'를 요구 하 고 단일 복잡 한 먹이 라이브러리의 완전 및 반 정량적 쿼리에서 더 혜택을 받을 수 있습니다. 우리가 개발 하 고 배치 형식4의 Y2H 원리를 사용 하 여 대규모 단백질 상호 작용 연구를 수행 하는 방법을 확인 했습니다. 이 Y2H 상호 작용9의 상대 강도 대 한 프록시는 특정 먹이 플라스 미드의 확장 속도 사용합니다. 인구 내의 모든 플라스 미드의 깊은 시퀀싱 대상이 정상적인 성장 또는 선택적 성장 조건 강하고 약한 Y2H 상호 작용을 생성 하는 클론의 완전 한 지도 생성. 인터의 레 퍼 토리 얻을 하 고 직접 여러 미끼 플라스 미드에 걸쳐 비교 수 있습니다. 불리 DEEPN (동적 농축 단백질 네트워크의 평가) 결과 워크플로 따라서 다른에 대 한 단백질 사이 비교를 허용 하는 단백질을 식별 하기 위해 같은 먹이 라이브러리에서 차동 interactomes 식별 하 사용할 수 있습니다.
여기, 우리가 DEEPN 설명 그림 1에 설명 되어 있습니다 실험실 방법의 사용을 촉진 하는 개선 사항 소개. 중요 한 개선 다음과 같습니다.
먹이 효 모 인구의 세대. DEEPN의 주요 요구 사항 중 하나 다른 미끼 플라스 미드 플라스 미드 먹이 라이브러리의 동일한 분포와 누 룩의 생성 합니다. 등가 기준 인구 먹이 플라스 미드 도서관의 다른 미끼의 interactomes 간의 정확한 비교를 만들기 위한 필수적입니다. 이것은 최고의 도서관 플라스 미드는 이미 단일 효 모 인구에 자리 하 고는 2 중 생산 짝짓기에 의해 달성 된다 인구에 주어진된 미끼 플라스 미드 이동 달성. 여기, 우리는 단일 효 모에는 상용 라이브러리를 사용 하 여 이러한 인구를 확인 하는 방법에 명확한 가이드를 제공 합니다. 우리가 diploids의 높은 번호를 생성 하는 방법을 발견, 이러한 상용 라이브러리-포함 된 효 모 종자의 전반적인 짝짓기 효율 낮은 했다. 따라서, 우리는 짝짓기 반응 당 훨씬 더 많은 diploids 수율 먹이 라이브러리를 집을 수 있습니다 새로운 긴장을 건설 한다.
새로운 미끼 플라스 미드의 설정. 익스프레스 '미끼' 퓨전 단백질 구성 관심과 DNA 바인딩 도메인의 단백질의 많은 현재 플라스 미드 2µ-기반으로, 그들의 복사본 수를 증폭 하는. 이 복사 번호 인구에서 매우 변수 하 고 Y2H transcriptional 응답에서 가변성으로 이어질 수 있습니다. 이 차례로 선택 셀의 성장 응답에 따라 주어진된 단백질 상호 작용의 강도 측정 하는 기능을 왜곡 수 있습니다. 이 중 일부는 이전 상용 pDEST3210같은 설명 되었습니다 낮은 사본 플라스 미드를 사용 하 여 주소 분할 수 있습니다. 우리가 건설 한 새로운 미끼 플라스 미드 (pTEF GBD) 또한 상류의 미끼 조각 모두 복제 수 있습니다 Kanr 저항 유전자를 운반 TRP1 centromere 기반 낮은 사본 플라스 미드 내 Gal4 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질을 생산 하 고 Gal4 DNA 바인딩 도메인의 다운스트림.
새로운 고밀도 Y2H 조각 도서관. 우리 집 Y2H 먹이 라이브러리에 새로운 플라스 미드를 건설 하 고 게놈 DNA의 임의로 깎인된 파편의 Saccharomyces cerevisiae에서 만든 매우 복잡 한 Y2H 라이브러리를 구축 하는 데 사용. 시퀀스 분석이 라이브러리 1 백만 이상 다른 요소, 앞에서 설명한 효 모 게놈 Y2H 플라스 미드 도서관11보다 훨씬 더 복잡 했다 보여주었다. 이 새로운 라이브러리 DEEPN 워크플로 안정적이 고 재현 가능한 방식으로 많은 다른 플라스 미드와 복잡 한 라이브러리에 맞게 충분히 강력한 보여줄 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>심층 염기서열분석 플랫폼</td></tr><tr><td>단클론 항HA 항체</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>pGal4AD에서 HA 발현을 검출하기 위한 1차 항체 QED</td></tr><tr><td></td><td>Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>pTEF-GBD에서 MYC 발현을 검출하기 위한 1차 항체</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 3350, 분말</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>에서 판매효모 형질전환을 위한 캐리어 DNA 섹션 3.2.1.</td></tr><tr><td>카나마이신 모노설페이트</td><td>연구 제품 국제</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE 아가로스</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>DNA 아가로스 젤 제조에 사용</td></tr> 염화<tr><td>나트륨</td><td>연구 제품 국제</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>연구 제품 국제</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>연구 제품 국제</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트 이수화물</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 나트륨 염</td><td>연구 제품 국제</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 분말</td><td>연구 제품 국제</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>효모 질소 염기(황산암모늄) 아미노산</td> <td>없음Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu + 40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His + 40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>섹션 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- 메르캅토에하놀 (BME)</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>자이몰리아제 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>페놀:클로로포름:IAA</td><td>앰비온</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>연구 제품 국제</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>연구 제품 국제</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td> 섹션 2 NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S에서 <td>플라스미드 클로닝을 위한 빠른 조립 방법</td></tr> 섹션 <tr><td></td><td></td><td></td><td>2.3의 Gibson Assembly용 제품 증폭 및 섹션 6.2.1</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr>의 DEEPN 심층 염기서열분석을 위한 샘플 준비에 사용됨<tr><td>QIAquick PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>섹션 6.2.3의 PCR 제품 정제에 사용됨</td></tr><tr><td>Qiaquick DNA Gel 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>섹션 2.1의 분해된 pTEF-GBD 정제에 사용됨</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prep kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>딥 시퀀싱</td></tr><tr><td>Codon 최적화</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td> 위한 준비 키트</tr><tr><td>코돈 최적화</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>섹션</td><td></td><td></td><td>2.2 문자열에서 클로닝에 사용되는 DNA 단편</td></tr><tr><td></td> 섹션 <td>2.2에서 클로닝에 사용되는</td><td>Thermofisher</td><td></td> DNA 단편</tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>섹션 2.3에서 DNA를 준비하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>고성능 초음파 발생기 섹션 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCCAGTTTCAG -3'</td>PCR 증폭 및 염기서열분석에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td><td>플라스미드 생성 중 5' 삽입 pTEF-GBD</td></tr><tr><td>올리고 누셀로타이드 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td>PCR 증폭 및 염기서열분석에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td><td>플라스미드 생성 중 5' 삽입 pTEF-GBD</td></tr><tr><td>올리고 누셀로타이드 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td>PCR 증폭 및 염기서열분석에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td><td>3' 플라스미드 생성 중 pTEF-GBD 삽입</td></tr><tr><td>올리고 누셀로타이드 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td>PCR 증폭 및 염기서열분석에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td><td>플라스미드 생성 중 pTEF-GBD</td></tr><tr><td>올리고뉴클레오티드 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>pGAL4AD</td>올리고뉴셀로타이드 5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3'의 삽입 증폭에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td> 5' Pimer</tr><tr><td></td><td>pGAL4AD</td>올리고누셀로타이드 5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'의 삽입 증폭에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td> 3' Pimer</tr><tr><td></td><td>pGADT7</td>올리고뉴셀로타이드 5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'의 삽입 증폭에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td> 5' Pimer</tr><tr><td></td>James P, Halladay J, Craig EA http://depts.washington.edu/yeastrc/ <td>pGADT7</td>PJ69-4A MatA 효모 균주의 삽입 증폭에 사용되는 <td>통합 DNA 기술 또는 Thermofisher</td><td></td> 3' Pimer</tr><tr><td></td><td>: 효모에서 고효율 2-하이브리드 선택을 위해 설계된 게놈 라이브러리 및 숙주 균주. 유전학 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA 결합 도이메인 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-활성화 도메인 발현 플라스미드</td></tr><tr><td>100mm 페트리 접시</td><td>Kord-Vallmark VWR</td><td>2900</td><td></td>에서 판매</tr><tr><td>125 mL PYREX 삼각 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX 삼</td>각 <td>플라스크 Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX 삼각 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2,000 mL PYREX 삼각 플라스크</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm 일회용 배양 튜브</td><td>써모피셔 14-961-33</td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 혈청학적 피펫</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 혈청학적 피펫</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 혈청학적 피펫</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX 그리핀 비커</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL PYREX 재사용 가능한 미디어 저장 병</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1,000 mL 눈금 실린더</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>세포의 광학 밀도를 측정하는 데 사용되는</td><td>분자 장치</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>분광 광도계는 DNA의 양을 정량화하는 데 사용됩니다</td></tr>. 전자 <tr><td>UV 트랜일루미네이터</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>, Ethidium Bromide 아가로스 겔</td></tr><tr><td>P1000, Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200, Gilson PIPETMAN</td><td>, Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20, Gilson PIPETMAN</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10, Gilson PIPETMAN</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &마이크로; L 저 보유 피펫 팁</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; LLow 보유 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Low Retention 피펫 팁</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 코니컬 튜브</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>목재 애플리케이터</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge 5424</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td><td>마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>탁상용 원심분리기</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP 연결 전체 Ab(당나귀에서)</td><td>GE 헬스케어</td><td>NA934-1ML</td><td>2차 항체</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Secondary Antibody</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>ECL 검출 솔루션</td></tr><tr><td>Isotemp 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>인큐베이터</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>쉐이킹 인큐베이터</td></tr><tr><td>Isotemp 디지털 제어 수조 모델 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>수조</td></tr><tr><td>Y187의 Y2H 마우스 cDNA 라이브러리(팬 조직)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>상용 cDNA 라이브러리</td></tr><tr><td>Y187의 Y2H 마우스 cDNA 라이브러리(마우스 뇌)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>상용 cDNA 라이브러리</td></tr><tr><td>pGADT7 AD 벡터</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>많은 cDNA 라이브러리를 수용하는 상용 AD Vector</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vector</td><td>Clontech</td><td>630443</td><td>상업적으로 이용 가능한 DNA-BD Vector</td></tr><tr><td>Biolase DNA Polymerase</td><td>Bioline BIOLINE</td><td>BIO-21042</td><td>DNA 중합효소 섹션 2.4에 사용</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress</td><td></td><td>P-6050-60</td><td>PCR 기계</td></tr><tr><td>TempAssure 0.5 mL PCR 튜브</td><td>미국 사이언티픽</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

효 모 2 잡종 분석 결과 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용에 대 한 심사는 긴 효과적인 도구, 하지만 사용 크게 상호 작용 후보자의 라이브러리에서 풍성 하 게 매우 높은 선호도 인터의 발견에 제한 되었습니다. 전통적인 형식에서 효 모 2 잡종 분석 결과 분석 낮은 엄중에서 실시 하는 경우에 낮은 선호도 인터를 찾을 수 있습니다 너무 많은 식민지를 얻을 수 있습니다. 또한, 다른 미끼 플라스 미드에 대 한 동일한 라이브러리의 포괄적이 고 완전 한 심문 없이 비교 분석 얻을 수 없다. 이러한 문제 중 일부 기준점과 먹이 라이브러리를 사용 하 여 해결할 수 있습니다, 있지만 비용과 같은 화면을 작동 하는 데 필요한 인프라는 금지 될 수 있습니다. 대신, 우리 동시에 과도의 수십을 밝히기 위해 효 모 2 잡종 분석 결과 적응 및 정적 단백질 상호 작용 전략을 활용 한 화면 내에서 불리 DEEPN (평가의 단백질 네트워크를 위한 동적 농축)을 통합 높 처리량 DNA 연속 그리고 상호 작용 파트너 인코딩할 플라스 미드의 인구의 진화에 따라 계산 합니다. 여기, 우리 사용자 지정된 시 약 및 DEEPN 화면 쉽고 비용 효율적으로 실행 될 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.

Y2H 분석 결과 단백질: 단백질 상호 작용을 찾기위한 널리 사용 되었습니다 그리고 몇 가지 적응 및 시스템 개발 되었습니다. 대부분의 경우, 이러한 이전 접근의 성공을 보장 하는 데 도움이 같은 고려 DEEPN에 대 한 중요 하다. 중요 한 벤치 마크의 일부를 포함: 보장 표현의 DNA 바인딩 도메인 융합 단백질, 보장의 스 퓨 리 어스 낮은 배경을 포함 하는 빈 먹이 플라스 미드, 미끼의 높은 결합 효율에 대 한 관심의 미끼 diploids에서 그의 + 성장 포함 하는 라이브러리 포함 된와 타 누 룩 효 모 MATalpha, 그리고 마지막으로, 많은 긍정적인 Y2H 반응에 대 한 선택 하는 조건 하에서 성장 하는 인구를 허용 하는 낮은 엄중 조건 사람 그 생산의 저급 His3 활동과 약한 Y2H transcriptional 응답입니다.
DEEPN의 중요 한 측...

효 모 2 잡종 스크린의 일괄 처리 먹이 융해 단백질의 매우 복잡 한 세트로 여러 미끼 단백질의 상호 작용 프로필의 직접 비교 가능합니다. 여기, 우리는 새로운 시 약, 세련 된 방법과 같은 화면에 대 한 그들의 사용을 구현 하는 방법을 설명 합니다.

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

이 방법은 두 집단 모두에서 효모 2-하이브리드 시스템의 원리를 사용하여 다양한 분자 및 세포 과정에 대한 주요 질문에 답하는 단백질-단백질 상호 작용을 식별합니다. 이 기술은 심층 염기서열분석을 활용하여 한 단백질과 다른 단백질의 상호 작용을 확인합니다. 이 접근법은 병렬 비교를 하도록 설계되었기 때문에 한 단백질과 다른 단백질과 상호 작용하거나 동일한 단백질에 대한 다른 확인 또는 돌연변이 버전을 유발하는 질병을 입력하는 동안 상호 작용하는 단백질 세트를 식별하여 차등 상호 작용체를 밝힐 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이 절차를 위해 새로운 효모 2-하이브리드 미끼 플라스미드 pTEF-GBD가 구성되었습니다. 이 플라스미드는 TRP1 중심체 내에서 Gal4 DNA 결합 도메인 융합 단백질을 생성하며, 이는 Gal4 DNA 결합 도메인의 상류 및 하류 모두에서 미끼 단편의 복제를 허용하는 카나마이신 내성 유전자를 운반합니다. 이 미끼 플라스미드는 MATa 효모를 형질전환시키는 데 사용되었으며, Gal4 미끼 융합 단백질의 발현은 anti-MIC 항체로 면역 블로팅을 통해 검증되었습니다.또한 간소화된 먹이 플라스미드 벡터 PGAL4 AD에 새로운 효모 2-하이브리드 라이브러리가 생성되었습니다. 게놈 DNA는 전단으로 단편화하고, 크기를 선택하고, 어댑터로 변형하고, PGAL4-AD에 삽입하여 saxairtab 효모 2-하이브리드 라이브러리를 생성했습니다. 미끼 및 먹이 라이브러리로 효모 집단을 생성하는 절차를 시작하려면, 미끼 플라스미드 및 CSM에서 트립 배지를 뺀 다양한 트립 플라스미드를 포함하는 다양한 트립 플라스탄트를 운반하는 MATa 효모 형질전환체 각각에 대해 3밀리리터 배양액을 접종합니다.절차적 대조군 역할을 하기 위해 벡터 플라스미드만 포함하는 두 개의 개별 배양을 포함합니다. 배양물을 섭씨 30도 및 200rpm에서 6시간 동안 배양합니다. 그런 다음 멸균 삼각 플라스크에서 각 배양액을 25ml 배양물로 희석하고 밤새 배양합니다.lu2를 운반하는 먹이 라이브러리를 포함하는 MAT 알파 세포의 얼어붙은 사악함을 실온에서 해동합니다. 해동된 세포 전체를 사용하여 125ml의 CSM에서 lu minus met medium을 멸균 삼각 플라스크에 접종합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 30도 및 200rpm에서 배양물을 성장시킵니다.다음날, 하룻밤 매트의 OD600이 형질전환 배양 범위가 1.0

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

신화는 모델 유기체 Saccharomyces cerevisiae의 표현 단백질 사이의 과도 안정적인 상호 작용의 민감한 감지 수 있습니다. 그것은 성공적으로 높은 처리량 방법으로 상호 작용하는 파트너를 식별하기 위해 외인성 및 효모 필수 막 단백질 연구에 적용되었습니다.

분할 Ubiquitin 기반 막 효모 두 하이브리드 (신화) 시스템 : 단백질 단백질 상호 작용을 확인을위한 강력한 도구

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

이 동영상은 특정 단백질 자가 상호작용을 검출하기 위한 효모 2-하이브리드 분석을 보여줍니다. 이 분석에서 관심 단백질은 β-갈락토시다아제 효소를 암호화하는 전사 인자의 두 도메인에 태그가 지정됩니다. 두 단백질이 상호 작용할 때 전사와 번역이 효소를 형성하게 된 다음 생화학적 분석을 사용하여 검출됩니다.

효모 세포에서 단백질 자가 결합을 결정하기 위한 Yeast Two-Hybrid Assay

이 비디오에서는 표적 DNA와 상호 작용하는 여러 단백질을 검출하는 변형된 효모 단일 하이브리드 분석을 시연합니다. 형질전환된 효모 세포는 리포터 유전자의 상류에 있는 표적 DNA 염기서열을 포함합니다. 또한, 그들은 전사 인자 단백질을 발현합니다. 단백질이 복합체를 형성하고 표적 DNA에 결합할 때 리포터 유전자가 발현되고 효소로 검출될 수 있습니다.

이질체 단백질 복합체-DNA 상호작용을 검출하기 위한 Modified Yeast-One 하이브리드 분석

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

거의 전체 (S)를 포함하는 단백질 마이크로 어레이를 사용하여 cerevisiae의 프로테옴은 병렬 단백질 - 단백질 상호 작용의 수천의 신속한 편견 심문 프로브된다. 이 방법은 단백질 - 소분자, 번역 후 수정 및 높은 처리량의 다른 분석을 위해 이용 될 수있다.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

단백질은 서로 상호 작용하며 이러한 상호 작용은 단백질의 기능을 대부분 결정합니다. 단백질 상호 작용 파트너는 디하이드로폴레이트 환원효소 단백질-단편 보완 분석법(DHFR-PCA)을 기반으로 하는 효모 적합성 분석을 사용하여 생체 내에서 고처리량으로 식별할 수 있습니다.

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

세균 이펙터 단백질 성공적인 감염의 확립에 중요하다. 이 프로토콜은 천연 식물 호스트에 세균 이펙터 단백질의 단백질 결합 파트너의 실험 식별을 설명합니다. 효모 두 하이브리드 화면을 통해 이러한 이펙터 상호 작용을 확인하는 분자 병원성 전략을 탈피하는 중요한 도구가되었습니다.

효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

여기에 설명 된 수정 된 효모 하나 - 하이브리드 분석은 기능적 유전체학 연구를위한 이종 시스템에서 헤테로 머 단백질 복합체 - DNA 상호 작용을 연구하고 검증하기위한 고전적인 효모 1- 하이브리드 (Y1H) 분석법의 확장이다.

이성질체 단백질 복합체 -DNA 상호 작용 연구를위한 수정 된 효모 원 하이브리드 시스템

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

단백질-단백질 상호 작용과 같은 생체 분자의 상호 작용은 생물학적 기능의 분자 기초입니다. 특별히 관련 상호작용이 없는 상호작용 null/손상된 돌연변이를 분리할 수 있다면, 이 상호작용의 기능을 이해하는 데 크게 도움이 될 것입니다. 이 문서에서는 interaction-null/impaired mutant를 격리하는 효율적인 방법을 제시합니다.

Yeast Two-Hybrid Assay를 사용한 상호 작용-null/손상된 돌연변이 분리

배우세요 효모 2잡杂交 스크린을 이용한 단백질 상호작용 비교 분석 방법입니다. pTEF-GBD 미끼 플라스미드와 딥 시퀀싱을 활용하여 다양한 미끼 단백질의 상호작용 프로파일을 병렬 비교하고 차등 상호작용체를 식별할 수 있습니다.

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

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