절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

이 방법은 지방 조직 리모델링 중 강력한 지방 생성 반응을 방해하는 핵심 요인 및 메커니즘을 식별하는 것과 같은 비만 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량의 조직으로 시작하는 인간 지방 조직에서 CD34+CD31+내피 세포를 분리할 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 지방 자극에 반응하는 인간 지방 혈관 구조에서 세포를 식별하려고 했을 때 처음 떠올랐습니다.

이 방법의 시각적 시연은 신선한 인간 지방 조직에 대한 접근이 제한적인 경우가 많기 때문에 세포 분리 단계를 연습하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 비만 수술을 받는 인간 피험자로부터 인간 난소 및 피하 지방 조직을 수집합니다. 조직 추출 직후, 페니실린 스트렙토마이신이 밀리리터당 50마이크로그램인 행크의 완충 염 용액이 들어 있는 별도의 바이알에 인간 난소 및 피하 지방 조직을 실온에서 보관하십시오.

조직 추출 후 샘플이 실험실에 도착하면 70% 에탄올 면봉 가위와 핀셋을 사용하여 조직의 섬유화 및 소작 부분을 조심스럽게 청소하고 제거합니다. 지방 조직의 무게를 측정하고 콜라겐 분해 효소 소화를 위해 5g의 분취량으로 나눕니다. 두 쌍의 가위를 사용하여 실온의 섬광 바이알에 5ml의 콜라겐분해효소 용액에 지방 조직 5g을 곱게 다집니다.

다진 조직에 10ml의 콜라겐분해효소 용액을 추가로 첨가하여 총 15ml를 만듭니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 수조에서 계속 흔들면서 샘플을 분해합니다. 분해 후 샘플을 20ml 무딘 주사기에 붓습니다.

250미크론 나일론 메쉬를 통해 샘플을 50ml 원뿔형 튜브에 여과하여 소화되지 않은 조직에서 지방 세포와 기질 혈관 세포를 분리합니다. 10ml의 KRBBS로 섬광 바이알을 세척하고 필터를 통해 세척액을 부어 잔류 세포를 수집한 후 여과된 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 20ml 주사기와 20게이지 x 6인치 피펫팅 바늘을 사용하여 기질 혈관 분획층을 제거하고 깨끗한 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.

KRBBS 10ml를 넣고 샘플을 실온에서 5분 동안 벤치에 둡니다. 추가 처리를 위해 두 창고의 기질 혈관 분획을 얼음 위에 보관하십시오. 기질 혈관 분획을 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 돌립니다.

원심분리기에서 샘플을 제거하고 기질 혈관 분획 세포가 포함된 펠릿을 유지하면서 상층액을 조심스럽게 붓습니다. 세포 펠릿을 PBS 5ml에 부드럽게 다시 현탁시킵니다. 샘플을 다시 회전시킨 후 상등액을 제거하고 PBS 1밀리리터에 세포를 다시 현탁시킨 다음 세포를 계수합니다.

샘플을 세 번째로 펠릿화하고 펠릿을 100마이크로리터의 CD34 분리 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 10마이크로리터의 CD34 칵테일을 넣고 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 5마이크로리터의 마그네틱 비드를 추가하고 실온에서 10분 동안 샘플을 배양합니다.

다음으로, 각 샘플에 2.5ml의 CD34 분리 버퍼를 추가하고 실온에서 5분 동안 샘플을 자석에 넣습니다. 자석을 5초 동안 뒤집어 절연 버퍼를 붓습니다. 이 과정을 4회 반복한 후 자석에서 튜브를 제거하고 2ml의 CD34 분리 버퍼를 추가합니다.

또 다른 원심분리 후, CD34+세포 펠릿을 1ml의 CD34 분리 버퍼에 다시 현탁시키고 세포를 계수합니다. 셀을 다시 펠렛화하고 펠릿을 250마이크로리터의 버퍼 B와 250마이크로리터의 세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 튜브를 와류로 완전히 재현탁시킨 다음 20마이크로리터의 CD31 비드를 재현탁액 세포 펠릿에 추가하고 실온에서 30분 동안 흔들면서 샘플을 배양합니다.

세포를 분리하기 전에 1ml의 세척 버퍼를 추가하여 스트레이너를 평형화합니다. 그런 다음 CD31 비드에 준비된 재현탁 세포 혼합물을 스트레이너에 적용합니다. 스트레이너를 5ml의 세척 버퍼로 원을 그리며 총 20ml로 세척합니다.

커넥터를 멸균 50ml 원추형 튜브에 연결하고 류어 잠금 장치를 닫습니다. 스트레이너를 커넥터에 부착한 후 스트레이너 벽을 따라 1ml의 세척 버퍼를 추가한 다음 스트레이너 벽을 따라 1ml의 활성 버퍼 D를 추가합니다. 샘플을 부드럽게 휘젓고 실온에서 10분 동안 배양합니다.

다음으로, 1ml의 세척 버퍼를 추가하고 위아래로 10회 피펫팅하여 비드에서 세포를 분리합니다. 류어 자물쇠를 열고 분리된 세포가 50ml 원추형 튜브로 흘러 들어가도록 합니다. 매번 1ml의 세척 버퍼로 스트레이너를 10회 세척하십시오.

커넥터와 스트레이너를 버리고 섭씨 4도에서 10분 동안 300배 G로 샘플을 원심분리합니다. 마지막으로, 배양을 위해 세포 펠릿을 2ml의 완전한 EGM2 배지에 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 완전한 EGM2 배지를 사용하여 6웰 조직 배양 처리된 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.

세포가 80-90% 합류점에 도달할 때까지 3-4일마다 배지를 교체하십시오. 그런 다음 약 100-200,000개의 세포를 6웰 플레이트에 시딩하여 각 저장소에 중복된 웰을 확보하고 2일 동안 완전한 EGM2 배지에서 배양합니다. 이틀 후, 모든 성장 배지를 흡인합니다.

대조 세포를 위해 배지를 5% FBS가 포함된 2mL의 DMEM/F-12 배지와 페니실린 스트렙토마이신 1밀리리터당 50마이크로그램으로 교체합니다. 치료 세포의 경우 배지를 2ml의 지방 형성 배지로 교체합니다. 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 13일 동안 세포를 배양하고 3-4일마다 각 배지를 교체합니다.

배양에서 두 번의 계대 후 CD34+CD31+세포의 전형적인 내피 조약돌과 같은 형태를 보여주는 대표적인 결과가 표시됩니다. 또한 예상대로 Matrigel에서 배양할 때 세포가 세뇨관을 형성하는 능력이 입증되었습니다. 형광 표지된 아세틸화 LDL의 균일한 흡수는 내피 정체성을 가진 균질한 세포 집단의 존재를 보여줍니다.

여기에 표시된 것은 13일간의 지방 유도 후 CD34+CD31+세포에서 중성 지질 방울의 Oil Red O 염색입니다. 세 가지 다른 인간 피험자의 난소 및 피하 저장소에서 세포의 대표적인 반응은 동일한 기증자의 지방 저장소 간 및 기증자 간의 지방 유도에 대한 반응의 큰 변동성을 설명하기 위해 나타났습니다. 이 이미지는 13일 동안 지방생성 유도 후 CD34+C31+세포에서 형광 세포 내 지질 염색을 보여줍니다.

이미지는 단위치 지질, 다위치 지질, 지질 축적이 없는 세포를 보여줍니다. Real Time PCR은 범지방세포 마커인 아디포넥틴(adiponextin)과 갈색 베이지색 마커인 CIDEA 및 UCP-1의 발현을 보여줍니다. 이러한 결과는 지방생성 유도 후 세포가 혼합된 흰색 베이지색 지방세포 표현형과 일치하는 분자 마커를 발현한다는 것을 확인합니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 5시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 2시간 이상 보관되지 않고 수집된 신선한 인간 지방 조직을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유세포 분석, 면역 조직 화학 및 RT-PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 반응 세포의 특정 subset을 식별하고 베이지색 갈색 지방 세포 표현형을 식별하는 데 사용할 수 있는 성숙한 adipocyte marker의 발현을 식별할 수 있습니다.

개발 후, 이 기술은 비만 분야의 연구자들이 인간의 지방 조직, 혈관 세포 및 지방 형성의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CD34+31+세포를 분리, 배양 및 확장하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 인체 조직으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 생물 안전 규정과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 기술의 의미는 인슐린 저항성과 같은 비만 관련 동반 질환의 치료로 확장되는데, 이는 잠재적인 치료 개입에 대한 세포의 지방 형성 반응을 식별하기 때문입니다.