Name: 절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 배우세요 인간 지방 조직에서 CD34+CD31+ 내피 세포를 분리하고 확장하여 백색 및 베이지 지방세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 비만 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

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저자 베 키 마르케스, Sentara Bariatric 센터 환자 검사 및 동의의 과정으로 그녀의 지원에 대 한 임상 코디네이터를 인정 하 고 싶습니다. 이 연구는 머 디 Dobrian에 R15HL114062에 의해 지원 되었다.

동부 버지니아에서 제도적 검토 보드 위원회 연구 및 연구에 사용 하는 인간 지방 조직 샘플의 수집을 승인 했다. 정보 서 면된 동의 환자에서 수집 되었다.
1. 버퍼, 미디어, 악기의 준비
<ol><li>Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered 솔루션 (KRBBS) 준비: 135 m m 염화 나트륨, 5 m m 염화 칼륨, 황산 마그네슘 1 m m, 0.4 m m 칼륨 인산 염 염기, 5.5 m m 포도 당, 1mm 아데노신, 0.01% 항생제/antimycotic 혼합 (50 µ g/mL의 페니실린, 스, gentamicin의 30 µ g/mL, 암포의 15 ng/mL의 50 µ g/mL)와 10 mM HEPES (pH = 7.4). 이 솔루션은 조직 수집 및 소화에 대 한 때마다 신선한 준비가 되어 있습니다.</li>
	<li>신선한 콜라 솔루션 준비: 1 mg/mL의 콜라, 입력 1, KRBSS; 3 mL/g의 지방 확인 합니다. 미리 따뜻한 조직 소화 전에 물 목욕에서 37 ° C에서 콜라 솔루션.</li>
	<li>CD34 셀 절연 버퍼 준비: 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 1 mM EDTA.</li>
	<li>지질 미디어 준비: DMEM/F12, 5 %FBS, 페니실린/스, 1.25 µ L/mL (5 µ g/mL 또는 144 mU/mL), 인간 인슐린의 2.8 m m rosiglitazone (1 µ M)의 0.36 µ L/mL의 50 µ g/mL.</li>
	<li>소 프로 파 놀의 100 mL으로 오로 0.3 g을 용 해 하 여 0.3% 기름 빨간 O (오로) 재고 솔루션 (무게/볼륨)를 준비 합니다.</li>
</ol>2. 지방 Stromal 혈관 분수 절연
참고: 연구 morbidly 비만 타입-2 당뇨병 (T2D)와 비 당뇨병 주제, 18-65 세는 Sentara 신진 대사 및 체중 손실 수술 센터 (Sentara 의료 그룹, 노퍽, 버지니아)에 bariatric 수술의 횡단면 일대를 포함. 배제 기준 포함 타입-1 당뇨병 mellitus, 만성 면역 치료, 항 염증 제 약물, thiazolinendiones, 활성 담배 사용, 만성 또는 급성 감염, 또는 역사를 요구 하는 조건을 포함 한 자가 면역 질환 악성의 지난 12 개월 내 처리. T2D는 단식 플라스마 포도 당 126 mg/dL 이상, 200 mg/dl 이상 2 시간 포도 당 내성 검사, 후 포도 당 또는 antidiabetic 약물의 사용으로 정의 되었다.
<ol><li>Bariatric 수술 인체에서 인간의 omental (OM) 및 피하 (SC) 지방이 많은 직물 (AT)를 수집 합니다.</li>
	<li>옴 및 사우스 캐롤라이나에 행 크의 버퍼링 소금 솔루션 페니실린/스 실 온에서의 50 µ g/mL를 포함 하는 조직 추출 후 즉시 별도 튜브 하십시오.</li>
	<li>신중 하 게 청소 하 고 샘플 조직 추출 후 실험실에 도착 하는 때 70% 에탄올 swabbed가 위, 핀셋을 사용 하 여 조직의 거리와 멎 섹션을 제거 합니다.</li>
	<li>It 5 g (또는 적은) aliquots 콜라 소화에 대 한 파티션 및 지방 조직 무게.</li>
	<li>정밀 하 게가 위의 두 쌍을 사용 하 여 실내 온도에, 섬광 유리병 콜라 솔루션의 5 mL에 AT의 5 g을 말하다.</li>
	<li>15 ml 총 다진된 조직에 콜라 솔루션의 추가 10 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>연속 떨고와 물 욕조에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 샘플을 소화.</li>
	<li>무뚝뚝한 끝을 20 mL 주사기에서 끝을 잘라.</li>
	<li>250 µ m 메쉬에서 9 cm x 9 cm 사각 고 무뚝뚝한 끝 주사기를 사용 하 여 50 mL 원뿔 튜브에 밀어 중간.</li>
	<li>20 mL 무뚝뚝한 끝 주사기와 소화 되지 않은 조직에서 adipocytes, 혈관 stromal 세포를 분리 하 50 mL 원뿔 튜브에 250 µ m 나일론 메쉬 통해 필터에 샘플을 부 어. 참고: 메쉬 초과 거리 소화 되지 않은 자료로 인해 막힌 얻을 것 이다으로 50 mL 원뿔 튜브, 당의 이상의 5 g를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>그리고 KRBBS의 10 mL와 함께 섬광 유리병 세척 후 잔류 세포를 수집 하는 필터를 통해 그것을 부 어.</li>
	<li>실 온에서 5 분에 대 한 필터링 된 샘플을 품 어. 참고:이 단계는 adipocytes 플 로트 튜브의 하단에 정착 하는 튜브의 상단 및 stromal 혈관 세포의 일부에 대 한 허용 해야 합니다.</li>
	<li>20 mL 주사기 및 20 G x 6 pipetting 바늘 stromal 혈관 일부 레이어를 제거 하 고 깨끗 한 50 mL 원뿔 튜브에 전송에 이용 한다.</li>
	<li>KRBBS의 10 mL을 추가 하 고 샘플을 실 온에서 5 분 동안 벤치에 앉아 허용.</li>
	<li>2.12-2.14 단계를 두 번 반복 합니다. 참고:이 단계는 부동 adipocytes와 stromal 혈관 세포의 오염 없이 지킬 것 이다.</li>
	<li>다음 단계에 설명 된 대로 추가 처리를 위해 얼음에 두 플랫폼에서 stromal 혈관 분수를 유지. 참고: 두지 마십시오 셀 1 시간 이상에 대 한 얼음이 세포 생존 능력에 영향을 있을 수 있습니다. adipocytes 플래시-장기 저장을 위한 액체 질소에서 냉동 또는 신선한 실험을 위해 사용.</li>
</ol>3입니다. 지방 조직 내 피 세포의 고립
<ol><li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 stromal 혈관 분수 (SVF) 회전</li>
	<li>원심 분리기에서 샘플을 제거 하 고 상쾌한;에서 신중 하 게 부 어 SVF 셀을 포함 하는 펠 릿을 유지.</li>
	<li>부드럽게 PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 참고: AT 센터의 5 g 이상의 여러 aliquots (단계 2.4 참조)으로 처리 된 경우 수영장 셀 펠 릿 함께.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 샘플을 회전</li>
	<li>제거는 상쾌한, resuspend, PBS의 1 mL에 셀과 셀. 참고: 여기는 자동 셀 카운터 셀 계산을 위해 사용 되었다. 세포 생존 능력 acridine 오렌지/propidium 요오드 화물 (AO/PI) 솔루션의 12 µ L로 세포 현 탁 액의 12 µ L를 혼합 하 여 얻은 ( 재료의 표참조). 각 창 고에 대 한 AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 1.69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC 서비스 센터: 105 ± 6.45 x 104x 1.24. 두 플랫폼에서 세포의 생존 능력은 > 90%.</li>
	<li>작은 샘플 500 x g 4 ° c.에 5 분에서 참고: CD34 immunomagnetic 선택 프로토콜 단계 3.7-3.15 적응 했다 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend. 참고: 총 셀 카운트 해야 다음 다시 서 스 펜 션 볼륨: (a) < 2 x 107 셀: 100 µ L;에서 펠 릿 resuspend (b) 2 108–5 x 108 셀 배: 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 단계 3.9-3.16, 사용 시 약의 볼륨은 축소에 대 한 < 2 x 107 셀.</li>
	<li>CD34 칵테일의 10 µ L을 추가 하 고 실 온에서 15 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>마그네틱 구슬의 5 µ L을 추가 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>각 샘플을 CD34 절연 버퍼의 2.5 mL을 추가 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 자석으로 샘플을 배치.</li>
	<li>5 자석 반전 부 절연 버퍼 어 s.</li>
	<li>자석에서 샘플을 제거 하 고 3.10과 3.11 4 x 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>자석에서 튜브를 제거 하 고 CD34 절연 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 5 분 동안 500 x g 에서 셀 펠 렛</li>
	<li>CD34 절연 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend 및 셀. 참고: 여기, AT의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 4.75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC 디포: 1.06 x 104 ± 9.53 x 103. CD31 플라스틱 immunobead 프로토콜 단계 3.16-3.34 ( 재료의 표참조)에 대 한 적응 했다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g 에서 셀 작은 고 버퍼 b 250 µ L에 250 µ L 워시 버퍼의 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>철저 하 게 vortexing 튜브에 의해 CD31 구슬 resuspend.</li>
	<li>CD31 구슬의 20 µ L를 추가 합니다. 참고: 때문에 총 셀 계산 > 1 x 106, 볼륨 제조업체의 입력에 따라 축소 했습니다.</li>
	<li>실 온에서 30 분, 락과 샘플을 품 어.</li>
	<li>살 균 50 mL 원뿔 튜브에 스 트레이너를 연결 합니다. 참고: 위에 여과기의 더 큰 개통 되어야 합니다.</li>
	<li>셀 분리 이전 equilibrate는 여과기를 세척 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 단계 3.16는 여과기를 생성 된 혼합물을 적용 합니다.</li>
	<li>20 mL의 전체 볼륨에 대 한 원형 모션 워시 버퍼의 5 mL와 여과기를 세척. 살 균 50 mL 원뿔 튜브에 커넥터를 연결 하 고 luer 잠금 닫습니다.</li>
	<li>커넥터는 여과기를 연결 합니다. 스 트레이너의 벽을 따라 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 활성화 된 버퍼 D는 스 트레이너의 벽을 따라 1 mL를 추가 합니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.</li>
	<li>워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 10 배 아래로 pipetting으로 구슬에서 세포를 구분 합니다. 참고: 공기 거품을 생성 하지 마십시오.</li>
	<li>Luer 잠금 열고 50 mL 원뿔 관으로 흐름을 분리 된 세포를 허용 합니다. 스 트레이너 10 세척 세척 버퍼 각 시간의 1 mL x.</li>
	<li>커넥터와 여과기 취소 및 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g 에서 샘플을 원심 문화에 대 한 완전 한 EGM-2 미디어의 2 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고:이 시점에서의 그램 당 세포의 평균 수는: (a) 옴 창 고: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC 디포: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. 두 플랫폼에서 셀의 90% 이상 이었다.</li>
</ol>4. 지질 격리 된 내 피 세포에서의 유도
<ol><li>37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 완전 한 EGM-2 미디어와 6 잘 조직 문화 취급 플레이트에 셀 성장. 대체 미디어 셀 80-90%의 합류를 도달할 때까지 매 3-4 일. 참고: 2-3 일 사이 배로 인구.</li>
	<li>100 mm 페 트리 접시에 그들을 도금 하 여 셀을 확장 하 고 1:3 번 셀을 분할. 이 단계에서 세포 통행 2에 있습니다.</li>
	<li>수 자동 셀을 사용 하 여 셀 카운터 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>6 잘 플레이트 각 서비스 센터와 문화 그들에 2 일 동안 EGM-2 미디어를 완료에 대 한 중복 우물 보장으로 씨 약 100-200, 000 셀입니다.</li>
	<li>어떤 성장 매체 떨어져 발음 하 고 5 %DMEM / F12의 2 mL FBS 50 µ g/mL 페니실린/스 컨트롤에 대 한 세포 및 지질 미디어 (단계 1.4 참조) 치료 세포의 2 mL와 함께 그것을 대체 하 고.</li>
	<li>37 ° c 습도 5%에서 세포를 품 어 CO2 인큐베이터 13 일에 대 한 대체 해당 미디어 매 3 ~ 4 일. 참고: 셀 치료의 4 일 후 지질 축적 시작 됩니다.</li>
	<li>오로 빨간 게시 방법15-17에 따라 얼룩 나 일을 수행 합니다.</li>
	<li>RNA 추출에 대 한 셀을, 6-잘 유도 오븐에서 미디어를 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL와 함께 그것을 씻어.</li>
	<li>Guanidium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 350 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 각 음을 5-10 분 동안 실내 온도에 그것을 품 어.</li>
	<li>셀 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 격판덮개 떨어져 긁 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포를 전송. 참고: 샘플 RNA 추출 및 추가 나중에 처리-80 ° C 냉동 실에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>적응된 RNA 추출을 사용 하 여 샘플에서 mRNA를 추출 ( 재료의 표참조) 프로토콜.</li>
	<li>실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 다음 프로브를 사용 하 여 유전자 발현을 평가 하기 위해 수행: adiponectin, UCP-1, 그리고 CIDEA ( 재료의 표참조). 참고: 여기, RT-PCR 절차 실행 되었다 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용 하 여: 변성 (95 ° C, 15 s), 어 닐 링, 그리고 40 사이클에 대 한 확장 (60 ° C, 1 분). CT 값으로 유전자 표현 샘플 > 35 탐지 여겨졌다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 종이의 초점 절연, 확장 및 adipogenic CD34 + CD31 + 인간 지방 조직의 내장과 피하 창 고에서 내 피 세포의 유도 대 한 방법론을 제공 하는 것입니다.
설치류 또는 인간 CD31 항 체 붙일 표시 또는 자석 구슬18, 결합을 사용 하 여 주로 기법을 포함 하는 다양 한 혈관 침대에서 내 피 세포의 고립에 대 한 보고 된 방법론 19 , 20 , 21 , 22 , 23. 이러한 격리 기술의 보편적인 사용에 대 한 주요 도전 이며 다른 혈관 침대에서 내 피 세포 인구의 섬유 아 세포와 혈관 벽 세포 오염의 높은...

최근의 증거는 쥐와 인간에서 지방 조직 맥 관 구조에 있는 셀의 하위 집합 분화 될 수 있다 중 흰색 또는 베이지색/브라운 adipocytes1,2,3으로 보여줍니다. 이러한 세포의 표현 형은 내 피 세포, 평활 근/pericyte, 또는 중간 고기4,5,,67의 스펙트럼을 지 원하는 증거와 함께 논쟁의 주제 이다. 이 방법론을 개발의 범위 CD34 + CD31 + 비만 인간에서 다른 지방 저장소에서 분리 된 내 피 세포의 adipogenic 잠재력을 테스트 했다. 문학에서 다른 연구는 잠재적인 또는 알려진된 체형 창시자2,,89의 총 stromal 혈관 분수의 adipogenic에 초점을 맞추고. 현재 기존 기술 마약 배달10에 대 한 내 피 세포를 지방 조직 구체적으로 타겟팅 할 수 있습니다, adipogenic을 같은 세포의 잠재력을 이해 흰색 또는 베이지색 adipocytes 향해 유도 이므로 중요 한 미래 치료 대상.
다른 그룹 보고 인간 지방 조직11,,1213에서 내 피 세포를 분리 하는 대리 모 알선으로 CD31와 CD34 마커의 조합. 일반적으로, 고립 2 개의 일련의 단계와 긍정적인 선택 마그네틱 비즈를 사용 하 여 사용 하 여 수행 됩니다. 이 보고서에서 immunoseparation CD34 + 자석 구슬 CD31 플라스틱 구슬과 결합을 사용 하 여 이용 되었다. 우리는이 기술은 전형적인 조약돌 내 피 형태학의 보존에 관하여 순차적 자석 immunoseparation에 우수한 발견. 또한, 확장 및 adipogenic 유도에서 작은 지방 1-2 g로 시작에 필요한 충분 한 세포를 생성할 수 있었습니다. 피하 지방의 작은 샘플 생 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 셀의 필요한 수량을 생산 하기 위해 충분 하다. 이 점은 잠재적으로 중요 한 경우에 특히이 방법은 인체에 adipogenic 유도에 응답에 대 한 심사에 활용 됩니다.
다른 시스템과 달리 문학에서 보고,이 방법 활용 CD34 + CD31 + 세포의 adipogenic 유도 대 한만 두 재료: 가진 주 작동 근-rosiglitazone-및 인간의 인슐린. 중요 한 것은, 사용 하는 인슐린의 양을 순환 인간14post-absorptive 인슐린의 정상/높은 범위 내에서 넘어진다. 세포에는 생체 외에서Akt 인 산화에 의해 측정의 인슐린 응답의 정도 칵테일 유도에 대응 하는 능력 연결 되지 않습니다. 흥미롭게도,이 유도 칵테일 및 실험 조건을 사용 하 여, 흰색과 베이 지/브라운 셀의 혼합 얻은 했다 크기와 세포내 지질 방울과 분자 마커의 식의 숫자에 의해 결정 된 대로. 잠재적으로 차별화 된 베이지색의 균형을 변경할 수 있는 에이전트의 심사에 대 한 응답자 셀 (베이 지 화이트 대 )의 표현 형의 양적 평가 함께이 간단 하 고 비용 효율적인 유도 프로토콜 허용 : 화이트 adipocytes.
이 메서드는 또한 인간 지방 조직에서 혈관 내 피 창시자의 지질의 근본적인 메커니즘을 이해 하기 위한 변환 방법을 제공 합니다. 이 특정 격리/차별화 기술을 사용 하 여, 조사 야 위 고 뚱뚱한 인간의 다양 한 지방 창 고에서 책임 지질 혈관 내 피 세포의 하위 집합에 대 한 다양 한 경로 심문 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td> 대형 장비 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosafety Cabinet </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 인큐베이터 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Water Bath </td><td> Forma 과학 </td><td> 2568<td> > Reciprocal Shaker < </td></tr><tr><td> p>RT-PCR 기계 </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Electrophoresis Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 Cell </td><td></td></tr><tr><td> Transblot Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Electrophoresis 전력 공급 </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> 근적외선 </td></tr><tr><td> 냉장 원심분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> 탁상용 원심분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> 도립 현미경 </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> 중탄산나트륨 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> 염화칼슘 이수화물 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> 인산칼륨 일염기 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> 마그네슘 황산염 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> 인산나트륨 일염기성 일수화물 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> 칼륨 염화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> Acros 유기물 </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> 아데노신 < > </td><td> 아크로스 유기물 </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> GE 헬스케어 생명과학 </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린/스트렙토마이신 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Digestion </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL 주사기 </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> 나일론 메쉬, 250 &마이크로; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetting Needles </td><td> Popper </td><td> 7934 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Fine Scissors < </td><td> p>Fine Science Tools </td><td> 14058-11 < </td><td></td></tr><tr><td> p>Tissue Forceps </td><td> 조지 티이먼 & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐분해효소, 유형 I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> 페트리 접시, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 < </td><td> p>TC 처리 </td></tr><tr><td> Eppendorf 튜브, 1.5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> 원뿔형 튜브, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> 원뿔형 튜브, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> 섬광 바이알 </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 < </td><td> p>Tissue Dicing </td></tr><tr><td> Cell Isolation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Slides </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer Viability Stain </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Acridine Orange/Pro 피듐 요오드 </td></tr><tr><td> 안티-CD34 자석 비드 </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep 자석 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 플라스틱 구슬 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x 세척 버퍼 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 커넥터 링 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluri분리 버퍼 선택 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Incubation Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect S 세포 여과기 </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 배양 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-well Plates </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC 처리 </td></tr><tr><td> 4- 웰 챔버 슬라이드 </td><td> 코닝 생명 과학 </td><td> 354559 </td><td> 피브로넥틴 코팅 </td></tr><tr><td> 4-웰 챔버 슬라이드 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK < </td><td> p>코팅되지 않은 유리</tr><tr><td> > 인간 지방 미세혈관 내피 세포(HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> 일차 세포주 </td></tr><tr><td> 내피 세포 배지(ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Complete Kit </td></tr><tr><td> DMEM/F12 기초 배지 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 (FBS) </td><td> 록키 마운틴 생물학 </td><td> FBS-BBT < </td><td></td></tr><tr><td> p>인슐린 </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> 세포 분석 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Prepared in isopropanol </td></tr><tr><td> 96 well plates </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 웰 PCR 플레이트 </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> RNA 추출 </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA 합성 </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR 폴리메라이제 </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> D9307-250UN </td><td> 핫 스타트, PCR 버퍼 N </td></tr><tr><td> 염화마그네슘 용액 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> M8787-5ML </td><td> PCR 반응에서 3 mM 최종 </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega < </td><td> p>U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA < </td><td> p>Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA 어세이 < </td><td> p>Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> 비스-아크릴아미드 </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> 40% 재고 솔루션 </td></tr><tr><td> 과황산암모늄 </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> 시그마-알드리치 </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> 글리신 </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium Dodecal Sulfate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> 브로모페놀 블루 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> 블롯 멤브레인 </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> 메탄올 </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey 차단 버퍼, Tris </td><td> LI-COR < </td><td> p>927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-AKT 항체 </td><td> 세포 신호 기술 </td><td> 2920S </td><td> Mouse monoclonal </td></tr><tr><td> Anti-pAKT 항체 </td><td> 세포 신호 기술 </td><td> 9271S </td><td> 토끼 다클론 </td></tr><tr><td> 항-UCP1 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab10983 </td><td> 토끼 다클론 </td></tr><tr><td> 안티-마우스 IgG 항체 </td><td> LI-COR < </td><td> p>926-68070 </td><td> 염소 다클론성, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anti-Rabbit IgG 항체 </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> "염소 다클론성, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anti-Rabbit IgG 항체 </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> 염소 다클론성, TRITC </td></tr><tr><td> 인산염 완충액 식염수 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37% 포름알데히드 용액 </td><td> 전자 현미경 과학 </td><td> 15686 </td><td> 세포 고정을 위한 4% 용액 </td></tr><tr><td> 일반 염소 혈청 </td><td> ><Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> 10% 차단 용액 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich < </td><td> p>X-100 </td><td> 0.1% 투과화 용액 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calcein AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific < </td><td> p>65-0853-39 </td><td> 세포 형광 시각화 </td></tr><tr><td> Matrigel Basement Membrane Matrix </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> 성장 인자 감소 </td></tr><tr><td> DiI 표지 아세틸화 LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

절연, 확장, 및 adipogenic cd34 + cd31 + 인간의 omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

비만 체형 비 통해 주로 지방 조직에의 개장 하는 광범위 한 함께 제공 됩니다. 극단적인 체형 성장 인슐린, 로컬 hypoxia, 그리고 염증에 빈약한 응답에 결과. 창시자에서 기능 흰색 adipocytes의 분화를 자극 하 여 체형 인구의 급진적인 비를 막을 수 있다, 따라서, 지방 조직의 대사 건강의 감소와 함께 향상 시킬 수 있습니다. 염증입니다. 또한, 베이 지/브라운 adipocytes의 분화를 자극 하 여 몸 전체 에너지 지출을 늘릴 수 있습니다, 체중 감소의 결과로. 이 이렇게 비만 공동 morbidities 2 형 당뇨병 및 심혈 관 질환 등의 개발을 방지할 수 있습니다.
이 종이 절연, 확장, 및 공동 CD31와 CD34 마커를 표현 하는 인간 지방 조직 내 피 세포의 부분 집합에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 상대적으로 저렴 하 고 노동 집약 되지 않습니다. 그것은 인간의 지방 조직에 대 한 액세스를 요구 한다 고 피하 디포 샘플링에 대 한 적합 합니다. 이 프로토콜에 대 한 병 적으로 뚱뚱한 주제에서 신선한 지방 조직 샘플 [신체 질량 지 수 (BMI) > 35] bariatric 수술 절차 동안 수집 됩니다. Stromal 혈관 분수에서 순차적 immunoseparation를 사용 하 여, 충분 한 셀에서 작은 지방의 2-3 g로 생산 됩니다. 이러한 세포 문화에 10-14 일 동안 확장 될 수 있다, cryopreserved 수 그리고 통로 5-6까지 뿌리고 그들의 adipogenic 속성을 유지 합니다. 세포는 adipogenic 칵테일 인간 인슐린의 조합과 가진 주 작동 근 rosiglitazone을 사용 하 여 14 일에 대 한 처리 됩니다.
이 방법론 지방 내 피 세포에서 adipogenic 응답을 드라이브 하는 분자 메커니즘에 대 한 개념 실험의 증거를 얻기 위해 사용할 수 있습니다 또는 심사는 adipogenic을 향상 시킬 수 있는 새로운 약물에 대 한 응답도 흰색으로 감독 또는 베이 지/브라운 체형 차별화입니다. 작은 피하 biopsies을 사용 하 여,이 방법론을 화면 베이 지/브라운과 흰색 adipocytes 비만 공동 morbidities의 치료에 대 한 자극을 목적으로 하는 임상 시험에 대 한 응답자 비 과목으로 사용할 수 있습니다.

우리의 프로토콜 CD34 + CD31 + 다른 플랫폼의 인간 지방 조직에서 혈관 세포의 adipogenic 잠재력을 결정 하기 위해 생체 외에서 접근을 제공 하는 것을 목표로. 간단한 순서도 다이어그램 그림 1A에 표시 됩니다. 셀을 표현 CD34의 긍정적인 선택을 사용 하 여 첫 번째 단계 갓 고립 된 세포 (그림 1A)의 인구에서 CD34 + 세포 &gt; 95%에서에서 발생 합니다. 중요 한 것은,이 표식 셀 몇 구절에 대 한 교양 후 손실 됩니다. CD34 다양 한 조 혈 및 조 혈 비 창시자에 대 한 일반적인 표식 이므로, 내 피 창시자의 분리에 필요한 다음 단계는 CD31 + 셀 CD34 + 세포 인구 (그림 1A)의 긍정적인 선택 이다. CD31 내 피 세포에 대 한 표식 이지만, 그...

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

이 방법은 지방 조직 리모델링 중 강력한 지방 생성 반응을 방해하는 핵심 요인 및 메커니즘을 식별하는 것과 같은 비만 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량의 조직으로 시작하는 인간 지방 조직에서 CD34+CD31+내피 세포를 분리할 수 있다는 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 지방 자극에 반응하는 인간 지방 혈관 구조에서 세포를 식별하려고 했을 때 처음 떠올랐습니다.이 방법의 시각적 시연은 신선한 인간 지방 조직에 대한 접근이 제한적인 경우가 많기 때문에 세포 분리 단계를 연습하기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 비만 수술을 받는 인간 피험자로부터 인간 난소 및 피하 지방 조직을 수집합니다. 조직 추출 직후, 페니실린 스트렙토마이신이 밀리리터당 50마이크로그램인 행크의 완충 염 용액이 들어 있는 별도의 바이알에 인간 난소 및 피하 지방 조직을 실온에서 보관하십시오.조직 추출 후 샘플이 실험실에 도착하면 70% 에탄올 면봉 가위와 핀셋을 사용하여 조직의 섬유화 및 소작 부분을 조심스럽게 청소하고 제거합니다. 지방 조직의 무게를 측정하고 콜라겐 분해 효소 소화를 위해 5g의 분취량으로 나눕니다. 두 쌍의 가위를 사용하여 실온의 섬광 바이알에 5ml의 콜라겐분해효소 용액에 지방 조직 5g을 곱게 다집니다.다진 조직에 10ml의 콜라겐분해효소 용액을 추가로 첨가하여 총 15ml를 만듭니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 수조에서 계속 흔들면서 샘플을 분해합니다. 분해 후 샘플을 20ml 무딘 주사기에 붓습니다.250미크론 나일론 메쉬를 통해 샘플을 50ml 원뿔형 튜브에 여과하여 소화되지 않은 조직에서 지방 세포와 기질 혈관 세포를 분리합니다. 10ml의 KRBBS로 섬광 바이알을 세척하고 필터를 통해 세척액을 부어 잔류 세포를 수집한 후 여과된 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 20ml 주사기와 20게이지 x 6인치 피펫팅 바늘을 사용하여 기질 혈관 분획층을 제거하고 깨끗한 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다.KRBBS 10ml를 넣고 샘플을 실온에서 5분 동안 벤치에 둡니다. 추가 처리를 위해 두 창고의 기질 혈관 분획을 얼음 위에 보관하십시오. 기질 혈관 분획을 섭씨 4도에서 5분 동안 500배 G로 돌립니다.원심분리기에서 샘플을 제거하고 기질 혈관 분획 세포가 포함된 펠릿을 유지하면서 상층액을 조심스럽게 붓습니다. 세포 펠릿을 PBS 5ml에 부드럽게

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

인간 지방 유래 기질 세포 내의 전사 이질성은 세포 표면 마커와 골 형성 유전자를 사용하여 단일 세포 수준에서 정의할 수 있습니다.  우리는 골형성 잠재력이 증가된 세포 하위 집단의 분리를 위해 유세포 분석을 활용하는 프로토콜에 대해 설명하며, 이는 두개안면 골격 재건을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

이 프로토콜은 마우스 지방 저장소를 해부하고 각 동맥을 분리 및 소화하여 내피 세포 집단을 유리시키고 식별하는 방법을 자세히 설명합니다. 다운스트림 응용 분야에 사용되는 새로 분리된 세포는 혈관 세포 생물학 및 혈관 기능 장애의 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 것입니다.

다운스트림 적용을 위한 별개의 지방 저장소에서 혈관 내피 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기서는 생쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도를 설명하여 혈관 주위 지방 조직 기능 및 혈관 세포와의 관계를 연구할 수 있습니다.

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Stromal Vascular Fraction-derived Preadipocytes from Mouse Periaortic Adipose Tissue(마우스 대동맥 주위 지방 조직에서 기질 혈관 분획 유래 지방세포의 분리, 배양 및 지방 유도)

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

배우세요 인간 지방 조직에서 CD34+CD31+ 내피 세포를 분리하고 확장하여 백색 및 베이지 지방세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 비만 및 대사 질환 연구에 활용됩니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

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