Name: 소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 학습하세요 C. elegans에서 젖산과 피루브산을 정량 분석하는 소규모 색도계 분석법. 단백질 침전을 통한 정확한 대사물질 추출 기법으로 생화학 연구의 신뢰성을 높입니다.

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이 작품 Sumino 지금에 다이토 문화 대학에서 특별 한 연구 보조금에 의해 재정적으로 지원 되었다.

1. C. 선 충 의 동기화 된 문화
<ol><li>시드, 전에 문화 대장균 (대장균) 변형 OP50 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 국물 액체 매체의 300 mL에 37 ° C에서. -4 ° c.에 교양된 OP50 저장<ol>
<li>LB 국물 액체 매체, tryptone의 10 g, 효 모 추출 물 5g, NaCl의 10 g 1 N NaOH의 1.5 mL를 사용 하 여와 이온 물 1 L에 추가. 오토 클레이 브. 참고: OP50 및 C. 선 충 종자는 꼬마 유전학 센터 (미네소타의 대학, 세인트 폴, 미네소타, 미국)에서 사용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>선 충 류 성장 매체 (NGM) 한 천 하 게, NaCl의 3 세대, 펩의 2.5 g, 한 천의 17 g 및 이온된 수의 975 mL을 사용 합니다. 오토 클레이 브. 55 ° C, 다음 sterilely 멋진 추가, 순서, 1 M MgSO4의 1 mL, 1 mL의 1 M CaCl2, 5mg/mL EtOH, 및 25 mL 1 M 칼륨 인산 염 pH 90에서 6.0의 콜레스테롤의 1 mL-mm 페 트리 접시.<ol>
<li>1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0에 대 한 KH2포4 108.3 g와 K2HPO4, 46.6 g 사용 하 고 1 L. 압력솥6이온된 수를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1-2 mL NGM 한 천 배지에서 배양된 OP50의 확산. OP50의 얇은 층을 하려면 어떤 nematodes을 추가 하기 전에 실 온에서 하룻밤 번호판을 품 어. 참고:는 NGM agar 접시 접종된 OP50는 2-3 주 동안 실내 온도에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>성인 단계까지 20 ° C에서 OP50, 및 문화 NGM 천 배지에 적어도 100 벌레를 추가 합니다. 적어도 3 개의 격판덮개는 필요 합니다.</li>
	<li>Utero에서달걀 수집, 전송 3 NGM 한 천 격판덮개에서 각 15 mL 원뿔 튜브에 S 버퍼의 5 mL와 함께 광고에 나온 벗 것을 3 번 30 300 x g 에서 원심 분리를 사용 하 여 S 버퍼의 15 mL와 함께 벌레를 씻어 실 온에서 s.<ol>
<li>NaCl의 5.9 g 50 mL의 1 M 칼륨 인산 염 pH 6.0 사용 하 여 S 버퍼 수 있도록, 이온 물 1 L를 추가 합니다. 압력솥6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Axenization에 대 한 알칼리 성 차 아 염소 산 용액에 벌레를 해산 하 고 그 절연을 대량 (신선한 표 백제 또는 동급의 0.5 mL: 5-6% 염소, 10 M NaOH, S 버퍼의 약 4.5 mL의 0.1 mL)6, 10-15 분에 솔루션을 서 반전에 의해 혼합과 룸 온도입니다. 참고: 15 분 이내 어른 벌레 해야 디졸브, 계란 (해방된 계란은 입체 현미경으로 확인 되어야 한다) 그들의 시체에서 해방의 흐릿한 솔루션을 떠나. 10 N NaOH의 0.1 mL, 대신 5 N NaOH의 0.2 mL도 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>차 아 염소 산 처리 후 3 번 S 버퍼의 15 mL와 함께 계란 펠 릿을 세척 하 고 S 버퍼의 5-6 ml에서 resuspend. L1 무대 애벌레의 동기 나이 문화에 대 한 대장균 없이 S 버퍼에 20 ° C에서 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 나온된 계란을 부 화 한다.</li>
	<li>L1 무대 애벌레의 대략적인 수를 확인 하려면 resuspending 애벌레 적어도 3 번 후 S 버퍼의 10 µ L에 입체 현미경을 사용 하 여 웜 세 고 평균을 계산. OP50 (1500-3000 벌레 당 90 mm 페 트리 접시를 사용 하 여 접시), 5 NGM 한 천 배지를 L1 무대 애벌레를 전송 그리고 그들은 젊은 성인 단계는 self-fertilization 시작 하 고 몇 알 (일반적으로 3 d 후 레이아웃 성장해 왔습니다 때까지 20 ° C에서 문화 ays)입니다.</li>
</ol>2. C. 선 충 에서 셀룰러 분수의 추출
<ol><li>젊은 성인 단계 (5-하루-오래 된 동물) S 버퍼 (그림 1A)와 5 NGM 한 천 배지에서 벌레를 수집 합니다.<ol>
<li>30% (w/v) 자당에 부양에 대 한 자당 방법6 을 사용 하 여 살아있는 벌레만을 선택, 15 mL 원뿔 튜브에 얼음 처럼 차가운 60% (w/v) 자당의 동등한 양으로 S 버퍼의 3-4 mL에 벌레를 혼합 한다. 1500 x g 15에서 튜브를 회전 s 4 ° C 및 부동 제거에 파스퇴르 피 펫과 튜브의 벽에서 이동 하 여 신선한 튜브로 벌레.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1500 x g 30에 원심 분리에 의해 3 번 S 버퍼와 벌레를 씻어 4 ° c.에 s 1000 µ L micropipette 팁 (그림 1B)를 사용 하 여 원심 분리 후 세척된 벌레의 젖은 볼륨을 확인 합니다.</li>
	<li>단백질 강 수 (그림 1C)에 대 한 차가운 10% (w/v) trichloroacetic 산 (TCA, 5%의 최종 농도)의 동일한 볼륨을 씻어 벌레를 추가 합니다. TCA, 대신과 염소 산 (PCA) 또는 metaphosphoric 산 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>얼음에 1300 rpm 까지의 회전 테 플 론 균질 화기 (포터 Elvehjem 조직 분쇄기)에 유 봉의 40 스트로크를 사용 하 여 비례적으로 벌레를 균질.</li>
	<li>파스퇴르 피 펫과 신선한 1.5 mL microtube에는 homogenate를 전송 하 고 3 분 (3 시간 1 분) 20% 듀티 사이클 얼음에 대 한 초음파 균질 화기를 사용 하 여 sonicate.</li>
	<li>4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리 하 여는 homogenate를 명확히 4 m 코 supernatants 중화 (0.25 볼륨 10 %TCA), 얼음에 4 ° c.에서 10 분 동안 8000 x g 에서 원심 분리기 20 분 (테스트 샘플)로 상쾌한 다음 분석까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 젖 산 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여
<ol><li>색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 테스트 샘플에 있는 젖 산의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 테스트 샘플의 5 또는 10 µ L 96 잘 접시에 추가 하 고 젖이 나올 시험 버퍼 키트와 함께 제공 잘 당 50 µ L 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>젖 산 표준 곡선에 대 한 희석 100 m m L (+)-젖이 나올 표준 1 mm 젖이 나올 시험 버퍼. 0, 2, 4, 6, 8, 및 10 µ L 1 m m L의 (+)를 추가-젖이 나올 표준, 우물의 시리즈에는 키트와 함께 제공 되는.</li>
	<li>각 잘에 반응 믹스 (젖이 나올 시험 버퍼, DMSO, 무수; 모든 시 약 키트와 함께 제공 됩니다에서 프로브 젖이 나올 젖이 나올 효소 혼합 46:2:2 포함) 또는 배경 제어 믹스 (프로브 젖이 나올 젖이 나올 시험 버퍼의 48:2 포함)의 50 µ L를 추가 그리고 샘플은 빛 으로부터 보호 하는 동안 30-60 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
	<li>각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여 배경 제어 혼합 반응 혼합의 흡 광도에서 흡 광도 뺍니다.</li>
	<li>젖 산 표준 곡선을 플롯. 젖 산 표준 곡선에서 테스트 샘플의 젖 산 농도 계산 합니다.</li>
</ol>4. pyruvate 분석 결과 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여
<ol><li>색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에 pyruvate의 농도 측정 합니다. 테스트 샘플에 대 한 이중 검사를 실시 합니다. 96 잘 접시에 테스트 샘플의 10 µ L 및 작업 시 약 (효소 혼합 및 염료 시 약 키트와 함께 제공 되는 94:1를 포함 하는)의 90 µ L을 추가 하 고 샘플 빛 으로부터 보호 하는 동안 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>각 잘 570에서의 흡 광도 측정 nm microplate 리더를 사용 하 여.</li>
	<li>Pyruvate 표준 곡선을 플롯. Pyruvate 표준 곡선에서 테스트 샘플의 pyruvate 농도 계산 합니다.</li>
</ol>5. 단백질 단백질 콘텐츠 정규화에 대 한 분석 결과
<ol><li>색도계 분석 실험 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 supernatants (테스트 샘플)에서 단백질 농도 측정 합니다. 그러나,이 단계는 분석 결과 키트에 국한 되지 않습니다 그리고 다른 접근 단백질 농도 측정 하기 위하여 이용 될 수 있다.</li>
	<li>각 총 단백질 농도 사용 하 여 테스트 샘플 중 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 값을 정상화. 참고: 테스트 샘플에 있는 단백질 농도 단백질 강 수 후에 충분히 감지 되 고 샘플 중 정규화 단계에 대 한 활용.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
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<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
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<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이러한 색도계 분석 실험 키트를 활용 하면 샘플 추출 세포 젖 산을 감지 하는 가장 중요 한 단계 및 pyruvate C. 선 충 에 정확 하 게 균질 (그림 1) 동안 단백질 강 수 과정입니다. 그것은 엄격 하 게 다른 균질으로 테 플 론 균질 화기를 사용 하는 데 필요한 (예., Dounce 및 조직 그 라인 더, 또는 비드 밀 테이퍼)는 또한 벌레의 소규모 추출에 적합. 우리 검색 하지 못했습니다 셀룰러 젖 산 염 그리고 pyruvate 단백질 강 수 전에 균질 화기를 사용 하 여 추출 된 테스트 샘플에. 게다가, 젖 산 염 그리고 pyruvate 레벨 단백질 강 수 (표 1) 대신 ultracentrifugation를 사용 하 여 분리 cytosolic 분수에 크게 감소 합니다. 이러한 샘플 추출 중요 한 생 화 학적 방법론 C. 선 충선 충 류를 사용 하 여 세포 대사를 감지 하는 것이 좋...

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 에너지 대사의 중간체로 널리 그리고 분해, tricarboxylic 산 (TCA) 사이클, 에어로빅 생물의 세포에서 전자 전송 체인의 상태를 관련이 있습니다. 분해 반응의 시리즈 포도 당 변화 기로에 놓여 있으며 gluconeogenesis, 지방산 및 아 세 틸 coa, 통해 에너지 대사를 통해 탄수화물과 아미노산 알라닌 개조 될 수 있다 pyruvate에 산화. TCA 주기 충분 한 용 존된 산소의 존재에서 발생 하 고 포도 당 에너지 변환에 대 한 근본 이다. 특히, 보조 대사의 변경 분해 에너지 생산을 위한 주로 사용 되는 흥미로운 현상을 이며 TCA 주기 및 전자 전송 체인을 포함, 에어로빅 미토 콘 드리 아 호흡 downregulated 포유류 암에서 세포1,2. 우리는 최근 젖 산 수준 및 필연적인 젖/pyruvate (L/P) 비율은 감소 모델 유기 체 꼬마 선 충 (C. 선 충)에 노화 동안 보였다. 마찬가지로, 우리는 C. 선 충 에 포유류 종양 억제기 p53 ortholog CEP-1는 transcriptional 대상3의 활성화를 통해 에너지 대사의 연령 관련 변경에 중요 한 역할은 발견.
셀, 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 측정 등 생물학 분석 실험에 감도, 정확도, 샘플 크기 및 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 부 화 시간이 개선 되었습니다 극적으로. 기술 혁신으로 인하여 우리 지금 분석 다양 한 대사 산물 및 중간 대사 산물의 C. 선 충, 대규모 문화 없이 작은 크기를 주어 어려운 수 있다. 일반적으로 색도계 분석 실험의 감도 fluorimetric 분석 결과;의 그것 보다는 더 작은 크기 순서 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실의 설정에 더 적합 합니다. 이 선 충이 류는 외 골격에 묶여 있기 때문에 또한, 균질 및 단백질 강 수를 포함 하는 추출 기법 선 충 C. 셀에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정 결정적 이다 포유류 배양된 세포 라인4,5와 달리 표 피를 라고합니다. C. 선 충에서 샘플 추출에 대 한 팁을 포함 하 여 상업 색도계 분석 실험 키트를 사용 하 여 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 분석 하는 프로토콜을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>젖산 색도계/형광 분석 키트&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>비색/형광 100 분석; -20oC</td></tr><tr><td>EnzyChrom Pyruvate Assay Kit</td><td>BioAssay Systems</td><td>#EPYR-100</td><td>colorimetric/fluorometric 100 어세이에 보관; -20oC</td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>비색 분석에 보관; 보관 장소 &nbsp; 실온</td></tr><tr><td>트리클로로아세트산</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>#207-04955</td><td>실온</td></tr><tr><td>테플론 균질화기에서 보관&nbsp;</td>이<td>와키/파이렉스 대신 이와키/파이</td>렉스<td>#358034(휘튼)</td><td> Wheaton에서 사용 가능</td></tr></tbody></table>

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 pyruvate

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

젖 산 염 그리고 pyruvate는 세포내 에너지 대사 경로의 핵심 중간체. 셀에 젖/pyruvate 비율 모니터링 연령과 관련 된 에너지 대사 미토 콘 드 리아 산화 인 산화 및 호 기성 분해 사이에서 불균형이 있는지 여부를 확인 도움이 됩니다. 여기, 우리는 모델 유기 체 C. 선 충에 젖 산 염 그리고 pyruvate에 대 한 상업 색도계 분석 실험 키트 활용을 보여줍니다. 최근, 감도 fluorimetric/색도계 분석 실험 키트의 정확도 개선 되었습니다 크게 연구 및 개발 시 약 제조 업체에 의해 실시. 향상 된 시 약은 C. 선 충에서 96 잘 접시와 함께 소규모 분석 실험의 사용을 활성화 했습니다. 일반적으로, fluorimetric 분석 결과 우수한 감도 색도계 분석 결과; 그러나, 색도계 방식은 일반적인 실험실에서 사용에 대 한 더 적합 합니다. 양적 결정에 대 한 이러한 분석에 또 다른 중요 한 문제는 무 균된 C. 선 충 의 단백질 강 수 샘플. 우리의 단백질 강 수 방법에서는, 일반적인 침 (예., trichloroacetic 산과 염소 산 및 metaphosphoric 산) 샘플 준비를 위해 사용 됩니다. 분석 결과 단백질 무료 샘플 직접 균질 동안 차가운 비례적 (최종 농도 5%)를 추가 하 여 준비가 되어 있습니다.

젖 산 염 그리고 pyruvate 농도의 양적 결정에 대 한 색도계 분석 실험을 사용 하 여, 우리는 선 충 C.7,8이전 보고서와 비교 분석 하는 이러한 실험의 정확도 보였다. 여기, 샘플 추출 하는 동안 단백질 강 수 과정은 정확한 값을 생성 하는 가장 중요 한 단계. 단백질 강 수, 일반적인 침에 대 한 (예., TCA, PCA, 또는 metaphosphoric 산) 테스트 샘플 (그림 1)를 준비 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, C. 선 충에 벌레 (표 1)의 균질 동안 단백질 강 수를 수행 하는 데 필요한 했다. 정확도, 뿐만 아니라 이러한 분석 충분히 민감한 소규모 샘플에 젖 산 염 그리고 pyruvate 농도 측정 하...

우리는 수정 된 소규모 추출 및 젖 산 염 그리고 pyruvate는 선 충 류에서의 색도계 분석 실험 설명 C. 선 충. 상업적인 분석 키트를 이용 하는 때 그들의 감도 정확도의 기술 개발이 중요 합니다. 추출 강 수 단백질은 세포내 대사 산물의 양적 결정에 대 한 가장 중요 한 단계 이다.

소규모 색도계 분석 실험의 세포내 젖이 나올와 꼬마 선 충 의 선 충 Pyruvate

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

이 연구는 선충에서 개발 권리의 분석과 같은 생체 화학 수 및 방법론 분야에서 어떤 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 벌레의 외과 및 음료 및 균질화의 단백질 강수량입니다. 하룻밤 사이에 37°C에서 LB 국물 액체 배지의 300 밀리리터에서 E.coli OP50 균주를 성장시킴으로써이 실험을 시작합니다.성공적인 OP50을 섭씨 4도에 저장합니다. 이전에 준비된 최소 3개의 NGM 또는 선충 성장 미디어 아가 플레이트에 배양된 OP50의 파이펫 2밀리리터가 플레이트를 손으로 소용돌이치게 한다. 밤새 실온에서 플레이트를 배양하여 OP50의 얇은 층을 만듭니다.다음으로, 멸균 이쑤시개를 사용하여 벌레가 있는 접시에서 한 조각을 고르고 각 OP50 NGM 플레이트에 최소 100개의 웜을 추가합니다. 벌레가 입체 현미경으로 확인되는 성인 단계에 도달할 때까지 20°C에서 벌레가 있는 적어도 3개의 판을 배양합니다. 입체 현미경을 사용하여 계란으로 채워진 중력 헤르마프로디트를 찾습니다.플레이트에 5밀리리터의 S 버퍼를 추가한 후 파스퇴르 파이펫을 사용하여 3개의 플레이트에서 15밀리리터 원컬튜브로 웜을 전송합니다. S 버퍼 15 밀리리터를 추가한 다음 실온에서 300배 G에서 30초 동안 원심분리를 하여 웜을 세 번 세척합니다. S 버퍼의 부피가 5밀리리터를 초과하는 경우 원심 분리 후 초과 버퍼를 제거합니다.성공적인 엑소시화 및 대량 계란 절연을 위해, 알칼리성 hypo 염소염용 0.5 밀리리터에 벌레를 녹입니다. 반역하여 10-15분 동안 실온에서 배양합니다. 1, 400 RPM에서 30초 동안 원심분리기를 사용하여 용액을 제거합니다.계란 펠릿을 세척하기 위해 S 버퍼 15 밀리리터를 사용합니다. 원심 분리 후 상체를 제거하고 이 세척을 적어도 세 번 반복합니다. 마지막 세척 후, 우리는 대장균없이 S 버퍼의 5 ~ 6 밀리리터에 펠릿을 중단하고 그들을 부화하고 L1 단계 애벌레의 H 동기 문화를 달성하기 위해 섭씨 20도에서 밤새 계란을 배양.3개의 커버 슬립에 L1 웜을 함유한 S 버퍼의 파이펫 10 마이크로리터. 입체 현미경으로 애벌레를 계산하고 L1 단계 애벌레의 대략적인 수를 결정하기 위해 평균을 계산합니다. 마지막으로, L1 단계 애벌레를 OP50로 NGM 아가 플레이트 5개에 옮기고, 자가 수정이 발생하고 계란 몇 개가 놓인 젊은 성인 단계까지 섭씨 20도에서 재배합니다.현미경의 밑에 매일 벌레를 관찰하고 젊은 성인, 또는 5 일 오래된 벌레를 수집합니다. 살아있는 벌레만 선택하려면 S 버퍼의 3~4밀리리터에 매달린 웜을 15밀리리터 원컬 튜브에 추가합니다. 그런 다음 얼음 차가운 60 % 자당과 혼합의 동일한 볼륨을 추가합니다.15초 동안 4도에서 1, 500배 G로 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 파스퇴르 파이펫을 사용하여 벌레를 조심스럽게 튜브 벽에서 옮은 다음 부동 벌레를 신선한 튜브로 제거합니다. 튜브를 S 버퍼로 채우고 벌레를 씻고 원심분리기는 섭씨 4도에서 1500배G로 30초 간 세척합니다.버퍼를 제거하고 세척을 두 번 더 반복합니다. 세 번째 세척 후, 조심스럽게 어떤 벌레를 제거하지 않도록, 슈퍼 나탄을 제거하고, 세척 된 벌레의 젖은 볼륨을 측정하기 위해 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용합니다. 단백질 강수량의 경우 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세척된 웜을 얼음 위에 놓는 균질화균제에 얼음냉이 10%트리클로로아세트산을 동일한 부피에 추가합니다.최대 1, 300 RPM의 회전패스 40스트로크를 사용하여 균질화합니다. 20%의 듀티 사이클이 있는 초음파 균질화제를 사용하여 균질화를 초음파처리합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 동형균을 얼음 위에 놓인 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다.균동화를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후, 원심분리기는 섭씨 4도에서 8, 000시간 G에서 10분 동안 이를 명확히 한다. 상체를 신선한 튜브로 옮기고 4개의 어금니 칼륨을 넣고 얼음에 20분 간 배양하여 중화합니다. 그런 다음 원심 분리는 섭씨 4도에서 8, 000 배 G에서 10 분 동안 분리합니다.상체를 신선한 튜브로 옮기고 추가 시도에 필요할 때까지 섭씨 80도에 보관하십시오. 젖산의 농도를 측정하려면 색분석 키트를 사용하여 테스트 샘플에 대한 중복 분석을 수행하십시오. 96웰 플레이트의 각 웰에 테스트 샘플 10마이크로리터를 추가한 다음 각 샘플에 젖산 분석 버퍼를 추가하여 15마이크로리터로 볼륨을 조정합니다.젖산 분석 버퍼로 100 밀리머 L+락테이트 스탠다드를 1밀리머로 희석합니다. 그런 다음 일련의 우물에 희석 된 L + 락테이트 표준의 0, 2, 4, 6, 8 및 10 마이크로 리터를 추가하십시오. 각 웰에 50 마이크로리터의 반응 믹스를 추가하고, 색상이 발달하기 위해 적어도 30 분 동안 빛으로부터 보호 되는 실온에서 배양하십시오.마지막으로 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 570 나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 반응 믹스의 흡광도로부터 배경 제어 믹스의 흡광도를 빼는다. 그런 다음 젖산 표준 곡선을 플롯하고 각 농도를 2.25로 곱하여 곡선으로부터 젖산 농도를 계산합니다.컬러메트릭 분석 키트를 사용하여 시험 샘플에서 피루바테의 농도를 측정하고 이중 검사를 수행합니다. 96웰 플레이트의 다른 우물에 테스트 샘플 10마이크로리터를 추가하고 각 샘플에 90 마이크로리터의 작업 시약을 추가합니다. 실내 온도에서 30 분 동안 덮여 인큐베이션.그런 다음 570 나노미터에서 각 웰의 흡수도를 측정하기 위해 마이크로 플레이트 판독기에 플레이트를 배치합니다. 피루바테 표준 곡선을 플롯하고 각 농도를 2.25로 곱하여 표준 곡선으로부터 피루바테 농도를 계산합니다. 그리고 마지막으로, 시험 샘플에서 단백질 농도를 측정하기 위해 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 색분석 키트를 사용한다.단백질 강수량 후, 착색 분석은 젖산 및 피루바테 농도의 정량적 결정에 사용될 수 있다. 이 실험은 C.Elegans의 이전 보고서와 는 반대로 색분석 분석의 정확성을 보여줍니다. 더욱이, 이러한 소하는 짧은 기간에 작은 규모의 샘플에서도 젖산 및 피루바테 농도를 측정하기에 충분히 민감하다.C.elegans에서 젖산과 피루바테를 정확하게 검출하려면 벌레의 균질화 시 단백질 강수량을 수행하는 것이 중요합니다. 검출된 젖산과 피루바테의 양은 균질화 시 단백질이 침전될 때, 손상되지 않은 세포균 분획또는 균질화 후와 비교하여 젖산이나 피루바테가 전혀 검출되지 않은 경우 더 높다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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