Name: 세균성 활용 주파수의 고해상도 비교 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 학습하세요 고해상도 세균 접합 주파수 측정법을 통해 플라스미드 DNA 전달 효율을 정량화하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 미생물학 연구에서 유전자 수평 이동 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

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우리는 제공 하는 pCAR1 pBP136 및 교수 박사 헤 노 지리 동경 (일본)의 제공을 위한 닥터 K. 아마의 국립 연구소의 전염병 (일본) 감사 합니다. 우리는 또한 제공 하는 pJBA28에 대 한 덴마크의 기술적인 대학의 교수, 박사 Molin Sølen에 감사입니다. 이 작품은 JSP KAKENHI에 의해 지원 되었다 (부여 번호 15 H 05618와 15KK0278) 석사 (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. 녹색 형광 단백질 (GFP)와 기증자의 준비-고 대 저항 유전자 태그 플라스 미드
<ol><li>대상 플라스 미드 pBP136에 마커 유전자의 소개 참고: 이 프로토콜의 목표는 pBP136를 생성 하는::gfp. 세균성 긴장 및이 연구에 사용 된 플라스 미드는 표 1에 나열 됩니다.<ol>
<li>은닉 pBP13617 살 균 Luria 국물 (파운드)과 대장균 S17-1λpir18 pJBA2819 은닉의 5 mL에 대장균 DH10B의 문화를 성장 [대 (Km)를 포함-저항 유전자와 gfp mut3 * 유전자 발기인과 미니-테네시5터미네이터] 50 μ g/mL 킬로미터 하룻밤 37 ° C에서 (O/N, 16-24 h) 200 분당 회전 (rpm)에 동요를 포함 하는 살 균 파운드의 5 ml에서.</li>
		<li>수확 및 세척<ol>
<li>각 문화권의 1 mL를 수확, 2 mL microtube 및 원심 분리기 (10000 × g, 실내 온도, 2 분) 그것을 넣습니다. 그리고 삭제는 상쾌한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)의 2 개 mL에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
			<li>원심 분리기 다시 (10000 × g, 실내 온도, 2 분), 그리고 살 균 PBS의 500 μ에 resuspend.</li>
		</ol>
</li>
		<li>짝짓기를 필터링합니다<ol>
<li>(1.6 %agar)와 살 균 파운드 플레이트를 준비 하 고 그것에 살 균 0.22 μ m 기 공 크기 멤브레인 필터를 배치. 믹스 500 pBP136와 자리 파운드 접시에 필터에 혼합물을 은닉과 DH10B 대장균 과 대장균 S17-1λpir 은닉 pJBA28의 μ. 플레이트 O/N 30 ° c.에 품 어 파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가. 참고: pJBA28 수 Π 단백질, pir 유전자18, 의해 존재 및 DH10B S17-1λpir 에서 옮겨질 수 있다. pBP136 아무 표식 유전자17 고 S17-1λpirDH10B에서 옮겨질 수 있다. 따라서, S17-1λpir 이 단계에서 pBP136 및 DH10B 은닉 pBP136 (염색체 또는 pBP136에 transposed) 미니-테네시5 에서 pJBA28를 은닉 구분 하지 않을 수 있습니다. 다음, 우리는 후속 단계 (1.1.4.–1.1.5)에 기증자로 그들의 혼합물을 사용.</li>
		</ol>
</li>
		<li>200 rpm와 슈 도모 나 스 putida KT2440의 문화에서 떨고 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에 위의 짝짓기 혼합물의 O/N 문화 성장 [Km-민감한 (Kms), 리 팜 피신-민감한 Rif (s), gentamicin 민감한 Gm (s), 및 항생물질 내성 (Tcr)] 200 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 12.5 μ g/mL Tc를 포함 하는 매체에서.</li>
		<li>수확 후 단계 1.1.2로 세포 세척 (O/N, 30 ° C) 단계 1.1.3에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들 (짝짓기 혼합물 및 KT2440)을 사용 합니다.</li>
		<li>50 μ g/mL 킬로미터 및 12.5 μ g/mL Tc 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (LB + 킬로미터 + Tc 판).</li>
		<li>살 균 PBS 가진 멤브레인 필터에 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 그리고 다음 확산 파운드 + 킬로미터 + Tc에 각 희석 플레이트와 플레이트 2-3 d 30 ° C에서 품 어.</li>
		<li>격판덮개에서 식민지를 선택, 포함 된 킬로미터 및 Tc P살 균 파운드에 O/N 문화. resinovorans CA10dm4RG (Rifr 및 Gmr)6 Rif 포함 하는 살 균 파운드 (25 μ g/mL)와 Gm (30 μ g/mL) 30 ° C와 200 rpm에서. 참고: 후판 (1.1.7.) 이전 메모, 파운드 + 킬로미터 + Tc에 식민지에 설명 된 대로 들고 있을 수 있습니다 KT2440 은닉 pBP136 미니-테네시5 와 KT2440 미니-테네시5, pJBA28 S17-1λpir 에서 직접 전송 될 수 있기 때문에 은닉 pBP136와 KT2440에 pJBA28입니다. 이 때문에 미니-테네시5 다음 단계에서 대상 pBP136를 얻을 하는 데 필요한 P. resinovorans CA10RG와 다른 짝짓기.</li>
		<li>수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.</li>
		<li>Rif, Gm, 및 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드 플레이트를 준비 (Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드 격판덮개).</li>
		<li>필터에 혼합물을 resuspend 하 고 다음 101– 105희석-접어, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 판, 그리고 30 ° c.에 2-3 d에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 pBP136 항구를 확인.</li>
	</ol></li>
	<li>대상 플라스 미드 pCAR1에 선택적 마커 유전자의 소개 참고:이 프로토콜의 목표 pCAR1를 생성 하는::gfp
	<ol>
<li>P. putida KT2440의 pCAR1를 은닉 한 O/N 문화 성장 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm와 30 ° C 및 대장균 S17-1λpir18 살 균 파운드의 5 ml에서 pJBA28 은닉 200 rpm와 37 ° C에서 50 μ g/mL 킬로미터를 포함 하</li>
		<li>수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.</li>
		<li>파운드 플레이트에서 필터를 제거 하 고 살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 배치 살 균 PBS의 1 mL을 추가.</li>
		<li>살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판. 참고: pCAR1 대장균;에 복제 하지 않습니다 따라서, P. putida KT2440 미니-테네시5 은닉 pCAR1 파운드 + Tc + Km에서 선택할 수 있습니다 접시.</li>
		<li>접시에서 식민지를 선택 하 고 킬로미터 및 Tc와 P의 문화를 포함 하는 살 균 파운드에 O/N 문화를 성장. resinovorans CA10dm4RG 리프와 Gm (200 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 살 균 파운드에.</li>
		<li>수확 후 단계 1.1.2에서 세척, 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기에 대 한 셀을 사용 하 여 단계 1.1.3에서.</li>
		<li>필터에 혼합물을 resuspend 그것을 희석, 접시, Gm + 킬로미터 + Rif, 파운드에 확산 하 고 2-3 d 30 ° c.에 대 한 번호판을 품 어</li>
		<li>식민지를 선택 하 고 만약 그들이 플라스 미드에 대 한 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 pCAR1 항구를 확인.</li>
	</ol></li>
	<li>태그-플라스 미드의 양도 확인 하 고 단계에 대 한 기증자를 준비 참고:이 프로토콜의 목표는 위의 생성 된 플라스 미드의 양도 확인 하 고 다음 단계에 대 한 기증자를 준비 하는.<ol>
<li>은닉 pBP136 P. resinovorans CA10dm4RG의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: P. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI의 문화와 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드에gfp q는 Pa 1에서/O4/O3-gfpmut3*의 염색체 lacIq 유전자 때문에 표현 하지]21 파운드 포함 하는 Tc (200 rpm, 30 ° C)의 3 ml.</li>
		<li>수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 사용할 필터 (O/N, 30 ° C) 짝짓기 단계 1.1.3에서.</li>
		<li>살 균 50 mL 플라스틱 튜브에 필터를 배치 하 고 메 마른 PBS의 1 mL와 함께 resuspend. 살 균 PBS 가진 resuspended 혼합물을 희석 (101– 105-배), 무 균 선택적 파운드 + Tc + 킬로미터에 희석된 혼합 확산 판.</li>
		<li>식민지를 선택 하 고 그들은 각각 특정 한 뇌관으로 PCR에 의해 플라스 미드의 경우 항구 확인. 참고: 플라스 미드 추출 후 직접 연속 미니-테네시5 의 삽입 위치 확인, 삽입은 플라스 미드의 전달 함수에는 영향을 미치지 않습니다 확인을 선택 사항입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MPN 방법으로 활용 주파수의 계산
<ol><li>살 균 파운드 + 킬로미터와 파운드 + Gm 준비 접시.</li>
	<li>P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm (140 rpm, 30 ° C)를 포함 하는 파운드의 3 ml에서.</li>
	<li>수확 후 세척 단계 1.1.2 에서처럼 셀 단계 1.1.3에서 45 분 30 ° C에서 짝짓기 하는 필터에 대 한 그들을 사용 합니다.</li>
	<li>순차적으로 희석 Gm (받는 사람) 형성 단위 (CFU) 식민지를 (3 중에서 각각) 플레이트 + 위의 기증자 및 받는 사람 (101 – 107) 문화와 파운드 + 킬로미터 (기증자) 또는 파운드에 그것을 확산. 2 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>살 균 파운드와 Gm를 포함 하는 필터에 혼합물을 resuspend 하 고 순차적으로 희석 (2에서1 224– 107.2) 96-잘 셀 문화 접시 (quadruplicate)을 사용 하 여.</li>
	<li>적절 한 시간 (30 ° C에서 2 d)에 대 한 96 잘 접시를 품 어.</li>
	<li>기증자 및 받는 사람 (2.4 단계.) 접시에의 CFU를 계산 하 고는 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산.</li>
	<li>자비스 외개발한 MPN 계산 프로그램을 사용 하 여는 MPN 및 그것의 편차를 계산 합니다. 22, http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls에서 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>(예, 2018/4/9) 실험, 테스트 시리즈, 수 및 최대의 날짜 (예, '테스트'), 실험의 이름을 입력 합니다. 아니요. Excel의 행 #7 '프로그램'의 시트에서 ('24' 입력) 희석의 파일 (이 하 ' MPN_ver5.xls').</li>
		<li>입력 ' 2-1 (0.5 =) (= 5.96 × 10-8) 2-24 ' '희석 요인 d'열에 '' 'ml 또는 g w볼륨' 열과 ' 4 0.01'에서 ' 호 튜브 n의 ' 데이터' 입력된'의 자동으로 생성된 테이블에.</li>
		<li>각 샘플 희석 (0-4)에 transconjugants 성장 하는 우물의 수를 입력 합니다.</li>
		<li>오른쪽 상단 ' 계산 결과 ' 버튼을 눌러 하 고 (MPN/μ)에서 결과 및 그들의 95% 신뢰 한계 (하단과 상단).</li>
	</ol>
</li>
	<li>기증자와 받는 사람 세포 (CFU/mL)의 숫자에 의해 transconjugants (MPN/mL)의 수를 나누어는 플라스 미드의 활용 빈도 계산 합니다.</li>
</ol>3. 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 준비
<ol><li>P. putida SMDBS pBP136 은닉의 O/N 문화 성장::gfp 또는 pCAR1:: 문화와 P. putida KT2440RGD 킬로미터를 포함 하는 살 균 파운드의 3 mL에gfp (Gmr, Rifr) Gm 300 mL를 사용 하 여 포함 된 살 균 파운드의 3 ml 플라스 크 (140 rpm, 30 ° C) precultures로.</li>
	<li>Km 또는 Gm 500 mL 플라스 크에 들어 있는 신선한 살 균 파운드의 200 mL에는 preculture의 200 μ를 전송 하 고 140 rpm에서 떨고와 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>600에서 탁도 측정 nm (OD600) 자리를 대 일 분 광 광도 계를 사용 하 여 문화권의 문화, 파운드에 희석 (101– 108-배 희석), 킬로미터를 포함 하는 파운드 플레이트 또는 1-2 d 30 ° C에 Gm. 품이이 파운드 플레이트에 CFU 결정.</li>
	<li>OD600 가치와 기증자와 받는 사람의 성장 곡선을 생성 하 성장 시간 CFU 플롯.</li>
	<li>성장 곡선에 따라 중앙 로그 단계로 기증자와 받는 사람 긴장의 문화를 성장.</li>
	<li>수확 후 세척 셀 101– 103 파운드 및 105– 107 파운드의 100 μ에 받는 사람의 CFU의 10 μ에 기증자의 CFU를 준비 합니다.</li>
	<li>기증자와 받는 사람 문화 (3 중)에서 96 잘 접시에 다양 한 밀도에 100 μ의 믹스 10 μ. 예를 들어 혼합 101 CFU는 기증자 및 10의5 받는 사람의 CFU 96 웰 스와 믹스 101 기증자의 CFU의 각 10를 추가 하 고6 CFU의 또 다른 96 잘 접시에 받는 사람 등등.</li>
	<li>45 분, 30 ° C에 혼합물을 품 어 고을 추가 활용을 억제 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.</li>
	<li>2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>Transconjugants 성장 하는 우물의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>위의 데이터를 (transconjugants 96 잘 접시의 적어도 1에 발견 한다)에 따라 기증자 시작 활용의 확률의 추정에 대 한 적절 한 받는 사람 밀도 선택 합니다. 참고: 기증자와 받는 사람 세포의 밀도 높은 때 잘에서 발생 하는 하나 이상의 활용 Transconjugants 모든 우물에 성장할 것입니다. 반면, 아무 transconjugants 셀 밀도 너무 낮을 때 어떤 우물에서 찾을 수 것입니다. 다음 섹션에서 단일 기증자 세포는 잘으로 정렬 됩니다. 따라서 받는 사람 밀도 최대에 이어야 한다.</li>
</ol>4. 기증자 시작 활용의 확률의 추정
<ol><li>기증자의 중간 로그 단계 문화의 200 mL P. putida SMDBS pBP136을 품고 준비::gfp 또는 pCAR1::gfp 와 P. putida KT2440RGD, 3.6-3.7에서 설명한 대로 받는 사람.</li>
	<li>장소 106 CFU 96 잘 접시의 각 음에 파운드의 100 μ에 수신자의.</li>
	<li>FACS 시스템 (교류 cytometry 및 셀 정렬 로봇 팔, 488 nm 아르곤 레이저와 70 μ m 노즐 오리 피스)을 설정 합니다. 앞으로 분산형 (FSC), 수집 트리거로 1% 임계값을 설정 합니다. H 이득 및 FSC의 이득 조정 및 부정적인 컨트롤로 PBS를 사용 하 여 거짓 긍정적인 신호를 제외할 수 있는 최대 감도에 측면 살포 (SSC). FSC 그리고 SSC 및 0.5 드롭 최대한 정렬 순도 대 한 정렬 모드에 따라 정렬 게이트를 설정 합니다.</li>
	<li>정렬 파운드 플레이트 (384 다른 관광 명소), FACS에 의해 셀 단일 기증자 2 d, 그리고 얼마나 많은 식민지 정렬된 셀에서 접시에 나타나는 수 30 ° C에서 접시를 품 어. 참고: 이 절차는 설정의 유효성 검사에 대 한. 접시에 384 식민지는, 100% 정렬 된 식민지를 형성 수 의미 합니다. 정렬의 평균 유효 항상 90-95% 이다.</li>
	<li>받는 사람 (4.2)와 96 잘 접시의 각 음에 FACS에 의해 단일 기증자 셀을 정렬 합니다.</li>
	<li>30 ° C에서 45 분 동안 접시를 품 어 고을 추가 활용을 방지 하기 위해 각 영역 (100 μ g/mL 킬로미터 및 60 μ g/mL Gm) 항생제의 높은 농도 추가 합니다.</li>
	<li>2 d 30 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>Transconjugants로 증가 했다 우물의 수를 계산 하는 육안으로 검사 하 여 결정.</li>
	<li>기증자 정렬 했다 웰 스의 총 수로 transconjugants와 우물의 수를 나누어 기증자 시작 활용의 확률을 계산 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리 transconjugants의 수를 추정 하는 MPN 방법을 사용 하 여 다른 조건 하에서 활용 주파수 차이 탐지 하기 위한 고해상도 프로토콜 제시. 프로토콜의 한 중요 한 단계 아니 transconjugants 성장 때까지 짝짓기 후 기증자와 받는 사람의 혼합물을 diluting은. 또 다른 단계는 선택적 액체 매체 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 추가 하 고. 이 절차는 배경 선택적 매체에 더 활용으로 인 한 줄일 수 있습니다. 우리가 성공적으로 기증자와 받는 사람 사이의 짧은 짝짓기 기간 후에 차이 검출할 수 있었다. 이 프로토콜에 의해 계산 conjugative 주파수 기증자와 받는 사람 긴장의 성장 조건에서 작은 차이 의해 변경 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 조건은 신중 하 게 설계 되어야 한다.
또한, 우리는 단일 기증자 셀 정렬 FACS를 사용 하 여 두 번째 단계 활용의 추정을 위한 프로토콜을 제시. 이 프로토콜의 가장 중요 한 단계...

세균성 활용 모바일 유전 요소, conjugative 플라스 미드, 그리고 통합 및 conjugative 요소 (얼린 다)의 유전 정보의 수평 확산에 대 한 중요 하다. 그것은 급속 한 세균성 발전 및 적응을 홍보 하 고 multidrug 저항 유전자1,2를 전송할 수 있습니다. 활용 빈도 단백질 DNA (폭도)와 짝짓기 쌍 형성 (MPF)의 동원에 대 한 conjugative 요소에 인코딩된 섹스 pili, 폭도 및 MPF 유형3,4에 따르면 분류 된다를 포함 하 여 영향을 받을 수합니다 있습니다. 5. 그것은 또한 기증자와 받는 사람 쌍6 와 셀7,8,9,10,,1112 (의 성장 조건에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 성장 율, 세포 밀도, 고체 표면 또는 액체 매체, 온도, 양분 가용성 및 양이온의 존재). Conjugative 요소 박테리아 사이에서 확산 하는 방법을 알아야 자세히 활용 주파수를 비교할 필요가 있다.
기증자와 짝짓기 후 받는 사람 쌍 사이 활용 주파수는 다음과 같이 기존의 방법으로 추정 일반적으로. (i) 먼저, 기증자와 받는 사람 식민지의 숫자 계산 됩니다; (ii) 다음, conjugative 요소 (= transconjugants)를 받은 받는 사람 식민지 세 어진다; (iii) 그리고 마지막으로, 활용 주파수 기증자 또는 받는 사람13그는 transconjugants의 단위 (CFU)를 형성 하는 식민지를 나누어 계산 됩니다. 그러나,이 메서드를 사용 하면 배경은 높은 셀 밀도 높은10때 transconjugants를 사용 하는 선택적 접시에도 발생할 수 있습니다 추가 활용 이벤트 때문 이다. 따라서, 주파수 (아래 사진 차이)에 작은 차이 감지 하기가 어렵습니다. 우리는 최근에 항생제의 높은 농도 포함 하는 액체 매체를 사용 하 여 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 방법을 소개 했다. 이 방법은 더 선택적 매체;에 활용을 억제 함으로써 배경 감소 따라서, 활용 빈도 높은 해상도와 추정 될 수 있습니다.
활용 3 단계로 분할 될 수 있다: (1) 기증 받는 첨부 파일 쌍의 conjugative 전송 개시 (2) 및 (3) 쌍14의 분리. 단계 (1) 및 (3), 하는 동안은 물리적 상호작용 기증자와 받는 사람 세포; 따라서, 셀 밀도 및 환경 조건 좌우할 수 있다이 단계, 비록 성 pili의 기능 또한 중요 하다. (2) 단계는 가능성이 플라스 미드, 기증자와 받는 사람의 다양 한 기능에 의해 영향을 받을 수 있는 외부 변화에 대응 활용에 관련 된 여러 유전자의 표현에 의해 규제 됩니다. 실제 첨부 파일 또는 기증자 받는 쌍의 분리 수학적으로 시뮬레이션할 수 입자로 셀의 추정을 사용 하 여, 비록 단계 (2)의 주파수는 실험적으로 측정 되어야 한다. 몇 가지 보고 방법의 직접 관찰에 종종 기증자 활용 [단계 (2)] 형광 현미경 검사 법15,16;를 사용 하 여 시작할 수 있습니다 되었습니다 그러나, 이러한 방법은 셀의 많은 수를 모니터링 해야 하기 때문에 높은 처리 되지 않습니다. 따라서, 우리는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 사용 하 여 단계 (2)의 발생 가능성을 예측 하는 새로운 방법을 개발. 우리의 방법 활용에 대 한 필수적인 유전자의 id 없이 어떤 플라스 미드에 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>IsoFlow</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8599600</td><td>Sheath 용액</td></tr><tr><td>형광구(10 &mu; m)</td> <td>FACS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Yamato Scientific Co. Ltd</td><td>211197-IC802</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS 분광 광도계 UV-1800</td><td>SIMADZU Corporation</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td>, <td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트형 페트리 접시</td><td>AXEL</td><td>1-9668-01</td><td>분류 검증을 위한</td> 비드 6605359</tr><tr><td>멤브레인 필터</td><td>ADVANTEC</td><td>C045A025A</td><td>필터 결합</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000</td><td>0.5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L, 100-1000 &mu; L</td></tr><tr><td>다채널 피펫</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP</td><td>0.5-10 &mu; L, 20-200 &mu; L</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>BD Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>나카라이 테스크</td><td>01162-15</td><td></td></tr><tr><td>리팜피신</td><td>와코</td><td>185-01003</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신</td><td>와코</td><td>077-02974</td><td></td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>와코</td><td>115-00342</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>AXEL</td><td>3-1491-51</td><td>JPND90-15</td></tr><tr><td>마이크로튜브</td><td>Fukaekasei</td><td>131-815C</td><td></td></tr><tr><td>500mL 일회용 스피너 플라스크</td><td>Corning</td><td>CLS3578</td><td></td></tr></tbody></table>

세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

세균성 활용 conjugative DNA 요소를 통해 항생제 저항 유전자의 수평 이동에 중요 한 단계는 이다. 다른 조건 하에서 활용 주파수의 심층 비교 자연에서 conjugative 요소를 확산 하는 방법 이해 해야 합니다. 그러나, 활용 빈도 비교 하기 위한 기존의 방법 않습니다 심층 비교에 대 한 적절 한 선택에 추가 활용 이벤트의 발생으로 인 한 높은 배경 때문에. 우리는 성공적으로 가능성이 가장 높은 숫자 (MPN) 메서드와 선택적 액체 매체에서 활용을 더 방지 하기 위하여 항생제의 높은 농도 도입 하 여 백그라운드를 감소. 또한, 우리 개발 종종 방법의 확률을 추정을 위한 프로토콜 기증자 세포 시작 활용 형광 활성화 된 세포 (FACS)를 정렬 하 여 받는 사람 풀으로 하나의 기증자 셀을 정렬 하 여. 두 개의 플라스 미드를 사용 하 여, 다른 교 반 속도로 액체 매체에서 pBP136 및 pCAR1, 슈 도모 나 스 putida 셀 활용 주파수에서 차이 검출 될 수 있습니다. 활용 개시의 주파수는 pCAR1에 대 한 보다 pBP136에 대 한 더 높았다. 이러한 결과 사용 하 여, 우리가 더 나은 이러한 두 plasmids의 활용 기능을 이해할 수 있다.

MPN 방법으로 활용 주파수의 비교
우리의 이전 보고서에서 우리는 pBP136의 활용 빈도 비교::gfp 와 pCAR1:: 125 mL 스피너 플라스 크10를 사용 하 여 45 분 짝짓기 후 다른 교 반 속도 3 배 희석된 파운드 (1/3 파운드) 액체 매체에서gfp . 우리 pBP136의 활용 주파수 비교::gfp 와 pCAR1:: 10gfp 6 다른 교 반 조건 하에서 기증자와 받는 사람 긴장의 CFU/mL (0-600 rpm). 두 plasmids의 활용 빈도 높은 교 반 속도로 증가 하 고 활용 주파수에 최대 차이점은 &lt; 사진 pBP136에 대 한:: pCAR1의 동안 (0와 400 rpm) 사이gfp ::g...

우리가 활용 빈도, 얼마나 효율적으로 예측 하려면 높은 해상도에 차이 탐지 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 다양 한 세균성 conjugative DNA 요소 다른 조건 하에서 동작을 이해 하는 목표로, 기증자 박테리아 활용을 시작합니다.

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

이 방법은 플라스미드 DNA가 다른 박테리아 사이에서 얼마나 자주 퍼질 수 있는지에 관하여 미생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 배경을 줄임으로써 고해상도로 컨쥬게이션 주파수의 작은 차이를 감지할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생인 야나기야 코스케가 될 것입니다.가장 가능한 수로 컨쥬게이션 주파수를 계산하려면, 필터는 하룻밤 기증자 문화에서 1 밀리리터를 30°C에서 45분 동안 1밀리리터로 메이트합니다. 공동 문화가 인큐베이팅하는 동안, 기증자 루리아 국물에 삼중 도금에 대한 원래 기증자와 받는 문화를 연속적으로 희석, 또는 카나마이신, 또는 받는 사람 LB 플러스 30 섭씨에서 이틀 문화에 대한 겐타마이신 플레이트. 인큐베이션의 끝에서, 4중 세포 배양판에서 직렬 희석을 위해 카나마이신과 젠타마이신을 함유한 멸균 LB의 필터에 배양을 재연한다.섭씨 30도에서 이틀 후, 기증자 및 수령인 한천 플레이트및 경미세검사에 의해 트랜스컨쥬개가 증가하는 우물의 수에 식민지 형성 단위 또는 CfU를 수동으로 계산합니다. 가장 가능한 숫자와 편차를 계산하려면 MPN 계산 프로그램을 엽니다. 실험의 이름과 날짜, 테스트 시리즈의 수 및 스프레드시트 파일의 프로그램 시트 7개행에 최대 희석 수를 입력합니다.자동으로 생성된 입력 데이터 테이블에서 희석 계수 D 열, 밀리리터 또는 GW 열의 볼륨에 0.01, 튜브 N 열 수에 4개의 수식을 입력합니다. 각 샘플 희석에서 트랜스컨쥬펀트가 증가한 우물수를 입력하고 계산 결과를 클릭하여 밀리리터당 가장 가능성이 높은 수와 95% 신뢰도가 상하로 높은 결과를 얻습니다. 그런 다음 플라스미드의 컨쥬게이션 주파수를 계산하기 위해 밀리리터당 기증자 및 수령인 콜로니 형성 단위의 수로 트랜스컨쥬트 수를 나눕니다.본 대표적인 실험에서, pBP136:gfp 플라스미드에 도입된 배양에 대해 0과 400 RPM 사이에 관찰된 컨쥬레이션 주파수의 최대 차이로 두 플라스미드의 컨쥬션 빈도가 더 높은 교반률로 증가했으며, pCAR1:gfp pfpsmid에 도입된 배양에 대해 0~200RPM 사이에 나타났다. 결합 의 확률을 비교하는 데 필요한 받는 세포의 밀도를 결정하기 위해 짝짓기 해석은 다른 기증자 및 받는 사람 밀도로 수행되었습니다. 본 대표적인 실험에서 pBP136:gfp 트랜스컨쥬Gants는 기증자의 10~3차 CFU를 10~10~10회, 10~10회 10~10회 10~10회, 기증자의 제2 CFU10~10~10~10~10~10~100회 CFU를 검출하였다. , 세포 밀도가 너무 높았다는 것을 나타낸다.기증자의 10 CFU와 짝짓기 분석 10 받는 사람의 다섯 번째 CFU에 10 또는 10, 그러나, 트랜스 콩주 간트 양성 우물의 감소 수의 결과. 따라서, 10~제5CFU의 수신자는 단일 기증자 세포와 짝짓기위해 요구될 것으로 예측되었다. 기증자와 받는 사람 균주의 다른 밀도에서 pCAR1:gfp와 결합 분석 유사한 결과 설명, 비록 전반적인 트랜스 콩주 간 긍정적인 우물의 비율은 pBP136:gfp의 그 보다 훨씬 낮았다.기증자와 수령인 세포가 유사하게 서로 부착할 수 있다고 가정하면 pCAR1 기증자에 대한 유도 개시 확률은 pBP136 기증자의 경우보다 낮았습니다. 이러한 결과에 기초하여, 10받는 사람의 일곱 번째 CFU가 FACS에 의해 정렬 된 단일 기증자 세포에 필요한 것으로 추정되었다. 트랜스컨주간트 양성 우물의 수를 계산한 후, pBP136:gfp에 대한 트랜스콘주간트 양성 우물의 백분율은 pCAR1:gfp에 비해 더 큰 것으로 결정되었으며, 이 두 플라스미드 사이의 공조 개시 연상 확률에 36배 이상의 차이를 보여 주었습니다.시술을 시도하는 동안, 항상 신중하게 세균 혼합물을 희석하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

미리 만든 수용체의 직전 되나 상륙 패드 종자에 관심있는 외국의 DNA를 통합하는 신속하고 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 방법은 ΦC31 integrase의 활용과 표현을 통해 주어진 변형율의 공학 상륙 패드 현장에 DNA 카세트의 특정 사이트 통합을 허용합니다.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

출처: Erdogan, F.,et al., 박테리아 접합에 관여하는 전달 단백질의 서열 특이적 분석을 위한 접합 짝짓기 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 구조 플라스미드를 사용하여 기증자에서 수혜자 대 장균 세포로 F 플라스미드를 전달하고 이중 항생제 내성을 통해 형질전환체를 선택하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아 배양 혼합, 흔들림 없이 배양, 짝짓기 쌍 방해, 성공적인 플라스미드 전달을 확인하기 위한 선택적 배지에 도금하는 작업이 포함됩니다.

대장균의 F 플라스미드 전달 및 이중 항생제 선택

출처: Chetrit, D. 외 레 지오넬라 폐포균 DOT/ICM 분비계의 시공간적 특징을 해명하기 위해 생세포 영상 및 냉동 전자 단층촬영 적용. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 형광 표지된 병원성 박테리아의 준비와 영상 촬영 과정을 시연합니다. 아가로스 패드는 먼저 접착 프레임 안에 준비되어 위치시킵니다. 형광 단백질을 발현하는 유전자 변형 박테리아의 현탁액을 패드에 적용하여 세포를 고정시킵니다. 프레임은 커버슬립으로 밀봉되어 현미경으로 관찰하여 박테리아의 형광 이미지를 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 샘플 준비 및 영상

여기에서는 플라스미드 접합에 관여하는 관심 유전자를 knockout하고 나중에 짝짓기 분석을 사용하여 그 부재의 영향을 분석하는 프로토콜을 제시합니다. 유전자의 기능은 결실 또는 점 돌연변이를 사용하여 염기서열의 특정 영역까지 더 탐구됩니다.

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

우리는 여기에서 황색 포도상 구균의 활용, 전달, 자연 변화의 체외 조사에 대한 세 가지 다른 프로토콜을 설명합니다.

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여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.

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여기서, 우리는 i) CyanoGate 모듈식 클로닝 툴킷을 사용하여 자가 복제 벡터를 조립하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시하고, ii) 컨쥬게이션에 의해 시아노박테리아 숙주에 벡터를 도입하고, iii) 형질전환 시아노박테리아 균주를 특성화한다. 플레이트 리더 또는 유세포 분석.

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접합은 두 개의 서로 다른 세포에 걸쳐 플라스미드 DNA를 동원하여 유익한 유전자의 확산을 촉진함으로써 수평적 유전자 전달을 매개합니다. 이 연구는 접합 플라스미드, 공여체 및 수용자에서 차등 마커를 사용하여 형질전환을 검출하는 것을 기반으로 접합 플라스미드 전달의 효율적인 검출을 위해 널리 사용되는 방법을 설명합니다.

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학습하세요 고해상도 세균 접합 주파수 측정법을 통해 플라스미드 DNA 전달 효율을 정량화하는 방법을 배우세요. 이 프로토콜은 미생물학 연구에서 유전자 수평 이동 메커니즘을 이해하는 데 필수적인 도구입니다.

세균성 활용 주파수의 고해상도 비교

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