복합 체적 망막 이미징 오블리크 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy (오슬로) 및 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)

여기, 우리 소설 영상 복합 플랫폼을 사용 하 여 큰 시야 (FOV) 3 차원 (3D) 형광 및 10 월 망막 이미지를 얻을 프로토콜 제시. 시스템 설치 프로그램, 정렬 방법 및 운영 프로토콜을 소개 합니다. Vivo에서 화상 진 찰 설명 될 것입니다, 그리고 대표적인 결과 제공 됩니다.

이 방법은 안과 및 망막 이미징 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 혈액-망막 장벽 파괴 및 망막 모세혈관 기능의 이미징 및 정량화와 같은. 이 기술의 주요 장점은 단일 래스터 스캔에서 비스듬한 스캐닝 레이저를 사용하여 넓은 시야, 3차원, 다중 대비 망막 이미징을 얻을 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막 전 질환의 진단으로 확장됩니다. oSLO는 단일 모세혈관까지 망막 미세혈관 구조의 고대비 이미지를 3D로 얻을 수 있기 때문입니다. 이 방법은 망막 이미징에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 기존의 대물 렌즈를 사용하는 다른 이미징 시스템에도 적용할 수 있습니다.

예를 들어 마우스 피질의 생체 내 이미징과 같은. super-continuum 레이저 소스는 비스듬한 스캐닝 레이저 검안경 또는 oSLO 설정을 위한 시스템 레이저 소스로 사용됩니다. 가시광선 범위는 첫 번째 이색성 거울에 의해 더 높은 파장 범위와 분리됩니다.

광 스펙트럼은 빔이 편광 빔 스플리터를 통과한 후 한 쌍의 분산 프리즘으로 확장됩니다. 슬릿은 여기 파장 범위를 선택하는 데 사용됩니다. 그리고 반사 미러는 필터링된 빔을 프리즘 쌍으로 다시 반사하여 빛을 단일 모드 광섬유에 결합합니다.

분광계는 단일 모드 광섬유의 출력에서 파장 선택을 확인하는 데 사용됩니다. 단일 모드 광섬유는 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러에 연결됩니다. 두 번째 광섬유 커플러의 광섬유 출력 포트 중 하나는 빛을 oSLO 시스템에 전달합니다.

oSLO 시스템에서 레이저를 시준하기 위해 레이저는 검류계 미러에 의해 편향됩니다. 일대일 망원경 시스템은 레이저를 두 번째 검류계 거울로 중계하고 3:1 망원경 시스템은 레이저를 눈동자에 추가로 중계합니다. 3:1 망원경 시스템 내의 이색성 거울은 형광 신호를 반사합니다.

3:1 망원경 시스템과 이색성 거울은 맞춤형 더브테일 슬라이더에 장착되어 광축을 오프셋하고 비스듬한 스캐닝 조명을 생성합니다. oblique illumination은 절편화가 필요 없이 체적 형광 이미징을 가능하게 합니다. 레이저를 오프셋하면 사선 빔이 망막에 초점을 맞추고, 사선 감지는 사선 빔 경로를 따라 단층 촬영 형광 이미지를 캡처할 수 있습니다.

형광 이미징 광학 경로를 생성하기 위해 형광은 이색성 미러에 의해 반사되고 세 번째 검류계 미러로 전달됩니다. 그런 다음 형광등은 다른 일대일 망원경 시스템에 의해 이미징 대물 렌즈로 전달됩니다. 세 번째 검류계 미러 아래에 두 개의 추가 translation stage가 설치되어 이미지 최적화를 위한 자유도의 중복성을 제공합니다.

최종 이미징 시스템은 3개의 자유도를 가진 스테이지에 장착됩니다. 회전 및 두 개의 평행 이동 축. 평면 카메라는 단면 형광 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다.

또 다른 이색성 미러는 후방 적외선 범위를 나머지 빛과 분리합니다. 긴 통과 필터는 대역폭을 800-900 나노 미터로 추가로 제한하는 데 사용됩니다. 빔을 단일 모드 파이버에 결합합니다.

단일 모드 광섬유는 두 개의 캐스케이드 광섬유 커플러의 다른 입력 포트에 연결되어 파란색 oSLO 여기와 결합합니다. 두 번째 광섬유 커플러의 두 번째 출력 포트에서 나오는 빛은 OCT 레퍼런스 암으로 향합니다. 분산 보상 플레이트, 가변 중성 밀도 필터 및 반사 거울이 있습니다.

기준 암과 눈에서 반사되는 빛은 두 번째 광섬유 커플러에서 재결합하고 OCT 분광계로 전달되어 신호를 수집합니다. Labview에서 작성되고 스캐닝 OCTA 스캐닝 프로토콜에서 수정된 데이터 수집 시스템 소프트웨어를 사용하십시오. 각 b-scan에 대해 500단계의 80% 듀티 사이클 톱니파가 아날로그 출력 보드에 의해 출력되어 x-prime 고속 스캐닝 미러를 제어합니다.

각 단계에서 라인 스캔 카메라를 트리거하여 미러가 전방 스캔 방향에 있을 때만 OCT에 대한 데이터를 획득합니다. 라인 스캔 카메라의 노출 시간을 17마이크로초로 설정합니다. OCTA 신호를 획득하려면 동일한 b-스캔 위치에서 측정을 5번 반복합니다.

AO 출력 속도를 100kHz로 설정하고 OCT A-line 속도를 50kHz로 설정합니다. 램핑 파형으로 y-prime 저속 스캐닝 미러 GM1을 제어합니다. 디스캐닝 미러 GM3를 GM1과 동기화하여 느린 스캔을 디스캔합니다.

다른 아날로그 출력 보드에 의해 평면 카메라를 트리거하여 각 y-prime 위치에서 하나의 형광 이미지를 캡처합니다. 이미징 크기를 자르거나 인접 픽셀을 bin하여 원하는 대로 속도와 감도를 높입니다. intradigital 핀치 동안 금단 반사가 부족하여 쥐의 적절한 마취 수준을 확인하는 것으로 시작합니다.

마취 유도 후 쥐를 홀더에 올려 놓습니다. 실험의 나머지 기간 동안 마취를 유지하기 위해 콧방울을 맞춥니다. 국소 마취를 위해 쥐의 눈에 5 tetracaine hydrochloride 점안액을 바르십시오.

그런 다음 1% 트로피카미드 점안액으로 동공을 확장시킵니다. 2분 동안 팽창시킨 후 1ml 주사기와 29게이지 바늘을 사용하여 식염수로 희석된 10% 플루오레세인 또는 10% FITC 를 꼬리 정맥을 통해 주입합니다. 그런 다음 레이저 소스를 켜고 중성 밀도 필터를 배치하여 정렬 중 청색광 여기를 감쇠합니다.

청색광의 세기를 측정하여 10마이크로와트 미만인지 확인합니다. 그런 다음 광간섭 단층 촬영 조명으로 전환하여 8밀리와트에 가까운지 확인합니다. 레이저의 방향을 제어하는 데 사용되는 검류계 미러의 전원 공급 장치를 켭니다.

안구의 높이를 조정하여 각막에 고정된 레이저 스폿을 만듭니다. 눈의 위치를 조정하여 동공 가장자리가 레이저에 대략 수직이 되도록 합니다. 그리고 레이저를 눈의 정점 중심에서 약 1.5mm로 오프셋합니다.

광간섭 단층 촬영 이미지가 최적의 품질에 도달할 때까지 동물 홀더를 추가로 조정합니다. x-prime 고속 스캔 방향에서 단면 b-스캔 이미지가 평평하게 나타나는지 확인합니다. y-prime 느린 스캔 방향으로 전환할 때 경사 스캔으로 인해 단면 b-스캔 이미지가 기울어져 나타나는지 확인하십시오.

청색광 여기(blue light excitation)에 대한 중성 밀도 필터를 제거합니다. 그리고 카메라의 실시간 피드를 모니터링합니다. 서로 다른 깊이의 혈관을 보여주는 단면 형광 이미지가 나타나야 합니다.

최적의 초점에 도달하기 위해 최종 형광 이미징 시스템의 초점을 조정합니다. 그리고 최적의 경사 스캐닝 레이저 검안경 이미지 품질에 도달하기 위해 측면면에서 눈 위치를 미세 조정합니다. 정렬 후 동시 광간섭 단층 촬영 혈관 조영술과 체적 플루오레세인 혈관 조영술을 획득하기 시작합니다.

이 이미지는 쥐 망막의 단면 광학 간섭 단층 촬영 이미지를 보여줍니다. 이것은 동일한 영역의 광간섭 단층 촬영 혈관 조영술 또는 OCTA 이미지입니다. 및 비스듬한 스캐닝 레이저 검안경 및 체적 플루오레세인 혈관 조영술 이미지 단면 플루오레세인 혈관 조영술 또는 oSLO-VFA.

광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography) b-scan과 유사합니다. OCTA와 비교하여, 비스듬한 스캐닝 레이저 검안경 및 체적 플루오레세인 혈관 조영술 단면 이미지는 외망상층의 모세혈관을 명확하게 식별합니다. 망막의 표재층은 OCTA 이미지에 나와 있습니다.

수직 줄무늬 형태의 인공물이 이미지에서 볼 수 있습니다. oSLO-VFA는 형광 방출 대비를 활용하여 모션 인공물을 방지합니다. 망막 중간층 내에서 수직 다이빙 혈관은 oSLO FA 이미지에 명확하게 표시됩니다.

그러나 OCTA에서는 분명하지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 2분 이상 눈에 지속적으로 레이저가 노출되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 각막의 건조를 피하고 빛을 차단하여 영상 섹션 사이에 최소 30초 동안 눈을 쉬게 하십시오.

이 절차에 따라 형광 단백질을 발현하기 위해 유전자 변형 마우스를 이미징하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다. 특정 망막 세포 유형이 어떻게 바뀔 수 있는지, 알려진 질병과 함께 과거를 견뎌내는 변수와 같은 것입니다.