복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

수백 개의 유전자가 확인되었으며, 그 기능은 유기체의 노화 방식에 영향을 미칩니다. 그러나 그들의 관계는 대부분 제대로 이해되지 않고 있다. 이 방법은 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

즉, gerA 유전자 간의 유전적 상호 관계는 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 처리량이 증가하고, 동시에 정량적으로 측정할 수 있는 유전적 사전 논쟁의 수가 적어도 한 자릿수 증가한다는 것입니다. 이 절차로 수집된 수명 데이터는 이 간행물과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 플롯 및 분석할 수 있습니다.

수명에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 이 방법은 스트레스 저항 및 건강 계획의 변화와 같은 다른 노화 관련 표현형에도 적용할 수 있습니다. 이 절차에서는 RNAi 하위 라이브러리의 새 스탬프를 만듭니다. 먼저, 12채널 피펫터를 사용하여 암피실린이 포함된 200마이크로리터의 LB가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰을 분취합니다.

96핀 플레이트 리플리케이터를 핀을 50% 표백제에 순차적으로 담근 다음 초순수에 넣어 멸균합니다. 그런 다음 팁을 에탄올에 담그고 팁을 조심스럽게 불에 태웁니다. 다음으로, 동결된 96웰 글리세롤 스톡 라이브러리 플레이트의 접착 호일 덮개를 조심스럽게 제거하고 멸균된 플레이트 복제기의 끝을 아직 동결된 글리세롤 스톡의 웰에 부드럽지만 단단히 분쇄합니다.

그런 다음 배양액을 접종하고 접종된 플레이트를 투과성 멤브레인으로 밀봉합니다. 배양이 벤치 탑에서 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 합니다. 다음날 플레이트 복제기를 멸균하고 야간 배양에서 씰을 조심스럽게 제거하고 복제기 핀의 팁을 담그십시오.

다음으로, 직사각형 LB 암피실린과 테트라사이클린 한천 플레이트에 핀을 접종합니다. 균일한 압력을 가하고 작은 원형 동작을 사용하여 반점이 너무 붐비지 않도록 박테리아를 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

다음 날, 복제 플레이트 10개가 필요할 때마다 1.5ml의 LB가 있는 깊은 웰 96웰 플레이트의 각 웰에 암피실린을 로드합니다. 다음으로, 배양된 박테리아를 우물에 접종합니다. 그런 다음 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉하고 흔들면서 20시간 동안 배양합니다.

제어 우물은 96개의 우물에 걸쳐 흩어져 있어야 하며, 96개의 우물 하위 라이브러리 플레이트가 24개의 그룹으로 나뉘어 있을 때 24개의 우물의 각 분할에는 각 제어 항목이 하나씩 있어야 합니다. 다음 날, 팁 간격을 조정할 수 있는 6웰 멀티채널 피펫을 사용하여 배양액의 120마이크로리터 분취액을 24웰 플레이트에 로드합니다. 그런 다음 모든 액체가 흡수될 때까지 층류 후드에 덮개를 씌운 건조판

과도하게 건조시키지 마십시오. 액체 배양을 분주할 때 초점을 유지하여 적절한 박테리아 배양이 24웰 플레이트의 적절한 웰에 주입되도록 하십시오. 복제 세트 실험은 각각 동일한 박테리아 RNAi 클론으로 파종된 독립적인 24웰 복제 플레이트 세트로 시작합니다.

수명 실험을 위해 15-20 마리의 L1 동물을 각 플레이트 웰에 첨가하고 L4 단계까지 성장시킵니다. L4에서 FUdR은 반복 실험의 모든 웰에 추가됩니다. 같은 날 늦게, 세트에서 복제 플레이트를 가져와 첫 번째 타임 포인트로 득점할 수 있습니다.

수명을 측정하기 위해 접시의 우물에 액체를 첨가하여 동물의 움직임을 유도합니다. 움직이기 시작하지 않는 동물은 지렁이 곡괭이로 부드럽게 찌릅니다. 그런 다음 총 동물 수와 죽은 동물의 수를 기록합니다.

그런 다음 첫 번째 관찰의 플레이트를 버립니다. 다음 관찰 시점에서, 세트에서 다른 복제 플레이트를 가져와서 비슷한 방식으로 점수를 매깁니다. 이것은 결정된 점수 간격에서 반복됩니다.

매번 복제 세트에서 새 플레이트를 사용합니다. 살아 있는 동물이 없을 때까지 접시 세트에 계속 점수를 매깁니다. 먼저, 기존 수명 분석에 사용된 것과 동일한 표백제 기반 전처리 방법으로 동물 개체군을 동기화합니다.

그런 다음 6웰 간격 조절 피펫과 시약 저장소를 사용하여 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 15-20마리의 L1 동물을 파종합니다. 플레이트를 파종하는 동안 주기적으로 L1 동물을 용액에 혼합하여 균일한 분포를 유지하십시오. 이제 동물들이 L4로 발달하도록 합니다. 이 프로토콜에 대해 L4 개발 타이밍을 알아야 합니다.

주기적으로 웜의 발달을 모니터링하십시오. 동물이 L4에 도달하면 각 웰에 24마이크로리터의 50x FUdR을 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다. L4 동물을 사용하는 것은 매우 중요합니다.

자웅동체가 FUdR을 추가하기 전에 생식 성숙에 도달하면 자손이 살아남아 음식을 먹게 됩니다. 반대로, FUdR을 너무 일찍 추가하면 동물이 파열될 수 있습니다. 원하는 시점에 하나의 복제 플레이트를 사용하여 생존 가능성을 평가합니다.

이렇게 하려면 우물을 M9 솔루션으로 범람시키십시오. 매일 생존 능력을 평가하기 전에 음식이 없거나, 오염된 것으로 보이거나, 형태학적 또는 발달 결함이 있는 동물이 있는 우물을 감지합니다. 각 우물에 대해 우물당 총 동물을 기록하고 지렁이 곡괭이로 각 우물의 머리를 부드럽게 만져 움직이지 않는 지렁이의 상태를 확인합니다.

접시에서 움직이지 않는 모든 데드를 세고 나서 접시를 버립니다. 이 절차에서는 변형된 e를 성장시킵니다. 암피실린과 함께 LB에서 하룻밤 동안 대장균.

다음날, 3, 15-20 분 동안 000 G에서 원심 분리로 박테리아를 집중시킵니다. 시작 부피의 1/10에서 박테리아를 재현탁시킵니다. 다음으로, 200마이크로리터의 10x 박테리아를 6cm 플레이트에 분취합니다.

테스트 조건당 3개 또는 4개의 플레이트를 준비하고 오염이 있는 경우 2개의 추가 플레이트를 포함합니다. 모든 액체가 흡수되거나 증발될 때까지 층류 배치에서 플레이트를 건조시킵니다. 건조되면 플레이트를 플라스틱 상자에 넣어 실온에서 하룻밤 동안 보관하여 이중 가닥 RNA 생산을 유도합니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관하십시오. 동물의 경우 M9에서 육식성 성인 동물을 수집하십시오. M9로 두 번 씻으십시오. 흡인에서 스핀을 반복합니다. 그런 다음 C.elegans를 M9 4 밀리리터에 재현탁시키고 차아 염소산염 용액 2 밀리리터를 첨가합니다.

이제 즉시 3 분 동안 주기적이고 격렬한 흔들림으로 벌레를 소용돌이 치게하십시오. 그런 다음 해부 현미경으로 알 구름을 찾으십시오. 구름이 보이지 않으면 추가로 10-20초 동안 벌레를 소용돌이치게 합니다.

다음으로, 이전과 같이 M9로 두 번 계란을 빠르게 씻으십시오. 그리고 씻은 계란을 3 밀리리터 M9에 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 난자를 15밀리리터의 새 튜브로 옮기고 섭씨 20도에서 부드럽게 회전하며 튜브를 배양하고 배아가 하룻밤 동안 부화하도록 합니다. 다음 날, 10마이크로리터 방울 3회에서 마이크로리터당 평균 L1 수를 계산하여 준비된 L1 용액의 밀도를 결정합니다.

준비된 박테리아 파종 플레이트에 각각 50마리의 L1 동물을 로드합니다. 배아가 L4 단계로 발달할 때까지 20도 Celsuis 인큐베이터에 플레이트를 설치합니다. L1에서 L4까지의 정상적인 개발에는 약 40시간이 걸립니다.

그런 다음 자손 생산을 방지하기 위해 각 플레이트에 160마이크로리터의 50x FUdR을 추가합니다. 그런 다음 수명은 일반적으로 자웅동체로만 측정되므로 수컷을 제거하십시오. 완료되면 플레이트를 20도 섭씨 인큐베이터에 다시 포장합니다.

모든 벌레가 죽을 때까지 매일 생존 능력을 평가하십시오. 그렇게 하려면 움직이지 않는 각 선충의 머리를 백금 철사나 속눈썹으로 부드럽게 만지십시오. 반응하지 않는 동물은 죽었으므로 접시에서 제거해야 합니다.

이 루틴 중에 발생하는 모든 변칙을 기록해 둡니다. 예쁜꼬마선충의 수명을 분석하기 위한 복제 세트와 전통적인 방법은 야생형 N2 동물과 유사한 결과를 보여줍니다. 예를 들어, mml-1 또는 mxl-2의 섭식 기반 RNAi 녹다운은 정상적인 수명을 현저히 감소시켰습니다.

이는 전통적인 수명 분석과 복제 세트 분석으로 측정되었습니다. 장기간도 감지할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, mdl-1 또는 mxl-1에 대한 RNAi는 두 방법론 중 하나로 측정했을 때 C.Elegans의 수명을 크게 증가시켰습니다.

replica set 방법을 사용하면 100개 이상의 조건에서 수명 변화를 동시에 정량화할 수 있으며, 이는 보다 전통적인 접근 방식으로는 합리적이지 않습니다. 예를 들어, 게놈 전체 섭식 기반 RNAi 스크리닝은 daf-2 인슐린 유사 신호 전달 감소로 인한 수명 연장에 필요한 159개의 유전자를 식별했습니다. 인슐린과 같은 신호와 이러한 유전자 사이의 관계는 동물의 건강 수명을 측정하여 추가로 설명되었습니다.

건강은 c. elegans가 용액에 부유했을 때 몸부림치는 것으로 표시되었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 섭식 기반 RNAi를 사용하여 C.Elegans의 수명을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그러나 RNAi는 다재다능하며 다양한 표현형에 적용할 수 있습니다. 일단 마스터되면 replica set 방법을 통해 적절하게 수행될 경우 매일 100개 이상의 RNAi 클론의 수명을 평가할 수 있습니다. 이른 시간과 늦은 시간 포인트를 빠르게 득점할 수 있습니다.

우물 안의 모든 동물은 살아서 움직이거나 죽을 것입니다. 동물이 죽기 시작할 때 득점하는 데 가장 오래 걸립니다. 이 점을 염두에 두고 독립적인 임상시험을 개설하는 데 시차를 두어야 합니다.