Name: 복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 배우세요 Replica Set 방법을 사용하여 C. elegans의 수명과 건강수명을 고처리량으로 정량 측정하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 간 상호작용 연구와 노화 메커니즘 이해에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 원고에 설명 된이 작업에 의해 제공 된에 대 한 자금:는 학장 및 대학원 의학 및 건강 과학 센터에 대 한 계산 혁신 (HSCCI);를 통해 치과 학장의 사무실의 로체스터의 대학 사무실 에이징 화목 (AG-NS-0681-10) 엘리슨 의료 재단 새로운 학자 funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다.

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저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

두 전통 및 복제 설정된 방법 날짜순 세 동물의 동기화가 필요합니다. 우리는 수정 된 달걀만 벗 성인 치료를 생존 벗 성인, 차 아 염소 산 치료를 사용 하는 동물을 동기화 하는 메서드를 포함 합니다. 이러한 배아 액체에 해치 고 발달 첫번째 애벌레 단계 (L1)에서 체포. L1 동물 식품 (예: 대장균 표현 dsRNA의 유전자)에 시드, 후 동물 개발을 다시 시작 합니다. L1 동물 벗 성인의 차 아 염소 산 처리에 의해 동기화 장점이 남은 unseeded L1 동물 동결 되 고 무한정 액체 질소 또는-80 ° C 냉장고에서 저장 될 수 있습니다. 이 방법에서는, 미래 연구를 위한 귀중 한 자원 만들기 및 재현성을 향상 실험 설치의 시간에 각 스트레인의 샘플 보존 됩니다. 그러나, 차 아 염소 산 벗 성인 동물의 치료는 노화 연구22에 대 한 동기화 된 동물을 얻을 수 있는 일반적인 방법을, L1 체포 기아 응답 이다. 따라서, 어떤 실험실 접시에 발생...

노화의 유전 기초 이해를 향한 가장 transformative 기술 발전의 한 개 이었다 C. 선 충1; 먹이 기반 RNAi의 개발 RNAi의 실험적인 사용 전에 노화의 많은 고기 유전자 세공 되지 않았습니다. 먹이-기반 RNAi dsRNA 일치 하는 대장균 내에서 생산을 통해 이루어집니다는 생 선 충 C. mRNA: IPTG 중 선 충 C. cDNA의 삽입 또는의 부분에서 양방향 전사를 유도 한 플라스 미드2내의 열려있는 독서 프레임. C. 선 충 에 그대로 피드 박테리아에 의해 생산 하는 대장균, dsRNA 루멘에서 SID-2 막 횡단 단백질3을 통해 장 세포로 수송 이며 다음 SID-14를 통해 동물의 나머지 부분을 통해 배포. 각 셀 내에서 외 인 dsRNA에 의해 처리 됩니다 Dicer 복잡 한 siRNA에 새로운 만들려고 보완 기본 페어링 통해 성숙한 mRNA와 상호 작용 하는 siRNA mRNA 이중. 이 이중 RISC 복합물에 의해 인식 하 고, 그로 인하여 죽 습 생 mRNA5저하. 따라서, 단지 플라스 미드 삽입 변경, 하나 C. 선 충 게놈 내에서 거의 모든 유전자의 기능을 비활성화 수 있습니다. 이 발견의 라이브러리 컬렉션 변형 대장균 주식의 약 86%의 범위를 달성 하기 위해 결합 될 수 있는 몇 가지 큰 먹이 기반 RNAi의 창조에 주도 알려진 C. 선 충 유전자6, 7.
먹이-기반 RNAi의 발전 이후 종합 화면 C. 선 충 에 수명 비활성화 (로 WormBase에 큐레이터 RNAi 형 협회 입증) 때 우리가 참조를 변경 하는 900 개 이상의 유전자의 발견에 지도 gerogenes로. 대부분 장 수 제어에 gerogenes의 역할 몇 정액 보고서에 RNAi 먹이-기반을 통해 발견 되었다 (자세한 내용은 그림 1A 및 추가 파일 1 참조). 경우에 따라 이러한 gerogenes는 RNAi 치료와 수명에 정량 측정을 제공할 수 있는 단일 또는 몇 시간 지점에서 생존 능력 측정에 따라 확인 되었습니다. 다른 경우에,이 유전자가 수명, 추가 나이 관련 된 고기에 있는 변화에 대 한 양적 평가 되었습니다. 예를 들어, 우리는 이전 159 유전자를 정상적이 고 증가 수명 감소 인슐린/IGF-1 신호, 동물의 필요 그리고 healthspan에서 변화를 정량 확인. 이들의 103 유전자 inactivations 귀 착될 progeric 표현 형으로 손실 귀착되 었 다 조기 노화8의 하나 이상의 표시.
일부 gerogenes 100 이상의 연구 (예: daf-16, daf-2, 선생님-2.1)와 연결 된, 400 gerogenes 10 이하의 인용 (그림 1B및 보조 파일 2) 있다. 따라서, 동안 포괄적인 먹이 기반 RNAi 스크린 발견 하 고 엉 특징 상 상속 gerogenes의 수백, 장 수 제어에서 이러한 유전자 기능 및 이러한 유전자 제품 사이 유전 상호 관계 유지 하는 방법을 제대로 공부. 나이 관련 된 고기에 대 한 전체 경도 분석 gerogenes (예: epistatic 상호 작용, asynthetic 상호 작용, 등등) 사이 유전 상호 작용을 식별 하는 데 필수입니다. Gerogenes 사이 유전 상호 관계에 대 한 깊은 통찰력을 얻고 또한 먹이 기반 RNAi의 장점을 활용 하 여 높은 처리량 양적 방법을 필요 합니다.
노화의 가장 일반적인 대리 측정은 수명. C. 선 충 사망률을 측정 하기 위한 전통적인 방법은 작은 인구 샘플 내에서 시간이 지남에 개별 동물의 죽음을 추적 합니다. 동물의 비교적 적은 수 시간이 지남에 따라 하 고 정기적으로 부드럽게 백 금 철사 또는 속눈썹, 생존 (그림 2A)의 지표로 서 운동으로 prodded. 이 방법은 널리 사용 되었습니다, 평균 및 최대 수명, 직접 측정을 제공 합니다. 그러나,이 전통적인 방법은 이다 시간과 상대적으로 낮은 처리량을 동시에 제어 방식으로 측정할 수 있는 조건과 동물의 수를 제한. 시뮬레이션 연구는 최근 많은 C. 선 충 수명 연구 조건9사이의 작은 변화를 안정적으로 감지 수 동물의 충분히 큰 수를 시험 하지 않습니다 발견. 또한,이 전통적인 방법은 차례로 수 소개, 오염 및 손상 하거나 점점, 세 동물을 죽 일 시간 동안 동물의 동일한 코 호트를 반복적으로 처리를 포함 한다.
C. 선 충 수명 측정에 대 한 대체 "복제 세트" 방법론을 개발 했습니다. 이 위해, 나이 동기화, isogenic 동물의 큰 인구 수 작은 인구 (또는 복제)으로 나누어집니다. 충분 한 복제 샘플 계획 된 실험에서 각 시간 포인트를 충당 하기 위해 생성 됩니다. 각 관찰 시간이 시점에서 복제본 중 하나가 죽은 생활의 수를 위해 득점 하 고 검열된 동물, 다음 그 복제 동물 삭제 됩니다. 따라서, 이상의 독립 모집단의 시리즈 전체 인구의 예상된 수명은 주기적으로 샘플링 (그림 2B). 복제 세트를 사용 하 여 잠재적인 환경 오염 없이 반복된 노출의 아무 반복 괴롭히는 있다. 1 회 시점에서 관찰 생존 모든 다른 관측, 처리를 최소화 하 고 적어도 크기 순서에 의해 처리량 증가의 완전히 독립적입니다. 이 RNAi의 수백 클론8,10동시에 대 한 수명에 변화를 quantitate 하을 수 있다.
여기 C. 선 충 수명 복제 세트와 C. 선 충 장 수 득점을 위한 전통적인 방법을 통해 수행을 위한 상세한 프로토콜 선물이. 우리는 방법 사이 비슷한 결과 얻은 것을 보여 줍니다. 우리는 우리가 자유롭게 GPL V3 라이센스 (참조 자료의 테이블)에서 제공 하는 어느 접근 방식을 통해 생성 된 수명 데이터의 그래픽 분석을 지원 하기 위해 개발 된 소프트웨어를 있다. "WormLife" R11, 작성 하 고 Mac OS와 리눅스에서 테스트 되었습니다 데이터를 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)를 포함 한다. 마지막으로, 우리가 비교 하 고 각 방법의 한계를 대조 C. 선 충 수명에 양적 변화를 측정 하는 방법을 선택할 때 다른 고려를 강조.

<table><tbody><tr><td>IPTG (이소 프로필 베타 -D-1- 티갈 락토피라 노시드)</td> <td>Gold Bio</td><td>12481C100</td><td></td></tr><tr><td>FuDR (5- 플루오로 -2'- 데옥시 우리딘)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L16497</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 배양 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td> <td># 662102</td><td></td></tr><tr><td>Retangular Non-treated Single-well 플레이트, 128x86mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>242811</td><td></td></tr><tr><td>600 &micro; L 96웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#786261</td><td></td></tr><tr><td>2mL 96웰 플레이트</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#780286</td><td></td></tr><tr><td>통기성 플레이트 씰</td><td>VWR</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>96핀 플레이트 리플리케이터</td><td>Nunc</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>bacto-peptone</td><td>VWR</td><td>90000-368</td><td></td></tr><tr><td>세균 한천</td><td>Affymetrix/USB</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans RNAi 클론 라이브러리 in HT115 bacteria- Ahringer</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans RNAi Collection (Ahringer)</td><td>Kamath et al, Nature 2003 참조.</td></tr><tr><td>C. elegans RNAi 클론 라이브러리 in HT115 bacteria- Vidal</td><td>Source Bioscience</td><td>C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)</td><td>Rual et. al, Genome Research 2004 참조. 이 라이브러리는 Dharmacon에서도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>WormLife- 복제 세트 생존 분석을 위한 소프트웨어</td><td>Samuelson Lab</td><td>해당 사항 없음</td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife L4440 빈 벡터 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>1654</td><td>https://www.addgene.org/1654/</td></tr> <tr><td>웜베이스</td><td></td><td></td><td>http://www.wormbase.org/&nbsp;</td></tr><tr><td>오아시스</td><td></td><td></td><td>https://sbi.postech.ac.kr/oasis2/&nbsp;</td></tr><tr><td>Graphpad 프리즘</td><td></td><td></td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan

복제 설정 방법은 양적 측정 수명 또는 꼬마 선 충 선 충의 생존의 동일한 금액에 더 많은 치료 또는 조건 화면을 단일 조사 되므로 높은 처리 방식에 대 한 접근 데이터 품질의 손실 없이 시간. 방법 C. 선 충 작업 대부분 실험실에서 발견 하는 일반적인 장비를 요구 한다 고 따라서 채택 간단 합니다. 접근 각 관측 지점에서 모집단의 독립 샘플 보다 시간이 지남에 단일 샘플 전통적인 경도 방법 시 금에 센터. 점수 다 잘 접시의 우물에 액체를 추가 하는 수반는 자극 하는 선 충 C. 이동 하 고 healthspan에서 측정 변화를 용이 하 게. 복제 설정 방법의 다른 주요 장점으로는 agar 표면 (예: 형 또는 곰 팡이), 공 수 오염 물질의 감소 된 노출 최소한의 동물, 및 견고성 산발적 잘못 채 점 (예: 때 그것은 여전히 죽은 동물을 호출을 처리 살아 있는). 적절 하 게 분석 하 고 복제 세트 스타일 실험에서 데이터 시각화, 사용자 정의 소프트웨어 도구는 또한 개발 되었다. 소프트웨어의 현재 기능 모두 복제 설정 및 전통적인 (카 플 란-마이어) 실험으로 통계 분석 생존 곡선의 복제 세트에 대 한 표시 포함 됩니다. 여기에 제공 된 프로토콜 전통적인 실험적인 접근 복제 설정 방법 뿐만 아니라 해당 데이터 분석에 대 한 개요를 설명 합니다.

어떤 새로운 방법론의 개발, 새로운 방법 이전 접근 허용된 결과 고 필드 내에서 표준 충족 필수적입니다. 우리는 이전 표시 경험적으로 복제 설정 및 C. 선 충 수명 시 금를 위한 전통적인 방법 유사한 결과20생산. 야생-타입 C. 선 충 (N2) 일반적으로 20 ° C에서 유지 우리 전통 (그림 4A, 검은 선)과 복제 세트 접근 (그림 4B, 블랙) 관찰 20 ~ 25 일 살고 있다. 따라서, 두 방법 모두 합리적으로 야생-타입 수명 근사치. 또한 새로운 방법을 테스트 조건 및 상당한 변화를 감지 하는 통계적 인 힘 사이 변화를 정확 하 게 계량을 해상도 필수적 이다. 우리의 이전 연구에서 우리가 발견 Myc 가족 녹음 방송 요인의 C. 선 충 장 수의 결정 요인. <em...

여기 우리가 설명 복제 설정 방법, 양적 측정 C. 선 충 수명/생존 하 접근법 및 healthspan 높은 처리량 및 강력한 방법으로 데이터 품질을 희생 하지 않고도 많은 조건의 심사 되므로. 이 프로토콜은 전략 하 고 데이터 복제 집합의 분석을 위한 소프트웨어 도구를 제공 합니다.

The Replica Set method is an approach to quantitatively measure lifespan or survival of Caenorhabditis elegans nematodes in a high-throughput manner, thus ...

수백 개의 유전자가 확인되었으며, 그 기능은 유기체의 노화 방식에 영향을 미칩니다. 그러나 그들의 관계는 대부분 제대로 이해되지 않고 있다. 이 방법은 노화 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.즉, gerA 유전자 간의 유전적 상호 관계는 무엇입니까? 이 기술의 주요 장점은 처리량이 증가하고, 동시에 정량적으로 측정할 수 있는 유전적 사전 논쟁의 수가 적어도 한 자릿수 증가한다는 것입니다. 이 절차로 수집된 수명 데이터는 이 간행물과 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 플롯 및 분석할 수 있습니다.수명에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 이 방법은 스트레스 저항 및 건강 계획의 변화와 같은 다른 노화 관련 표현형에도 적용할 수 있습니다. 이 절차에서는 RNAi 하위 라이브러리의 새 스탬프를 만듭니다. 먼저, 12채널 피펫터를 사용하여 암피실린이 포함된 200마이크로리터의 LB가 포함된 96웰 플레이트의 각 웰을 분취합니다.96핀 플레이트 리플리케이터를 핀을 50% 표백제에 순차적으로 담근 다음 초순수에 넣어 멸균합니다. 그런 다음 팁을 에탄올에 담그고 팁을 조심스럽게 불에 태웁니다. 다음으로, 동결된 96웰 글리세롤 스톡 라이브러리 플레이트의 접착 호일 덮개를 조심스럽게 제거하고 멸균된 플레이트 복제기의 끝을 아직 동결된 글리세롤 스톡의 웰에 부드럽지만 단단히 분쇄합니다.그런 다음 배양액을 접종하고 접종된 플레이트를 투과성 멤브레인으로 밀봉합니다. 배양이 벤치 탑에서 하룻밤 사이에 자랄 수 있도록 합니다. 다음날 플레이트 복제기를 멸균하고 야간 배양에서 씰을 조심스럽게 제거하고 복제기 핀의 팁을 담그십시오.다음으로, 직사각형 LB 암피실린과 테트라사이클린 한천 플레이트에 핀을 접종합니다. 균일한 압력을 가하고 작은 원형 동작을 사용하여 반점이 너무 붐비지 않도록 박테리아를 옮깁니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.다음 날, 복제 플레이트 10개가 필요할 때마다 1.5ml의 LB가 있는 깊은 웰 96웰 플레이트의 각 웰에 암피실린을 로드합니다. 다음으로, 배양된 박테리아를 우물에 접종합니다. 그런 다음 통기성 멤브레인으로 플레이트를 밀봉하고 흔들면서 20시간 동안 배양합니다.제어 우물은 96개의 우물에 걸쳐 흩어져 있어야 하며, 96개의 우물 하위 라이브러리 플레이트가 24개의 그룹으로 나뉘어 있을 때 24개의 우물의 각 분할에는 각 제어 항목이 하나씩 있어야 합니다. 다

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 문서에서 우리는 UV - 살해 박테리아 음식 고체 미디어에 유지 nematodes의 수명을 측정하는 일반적인 프로토콜을 제시한다.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을...

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

이 비디오는 예쁜꼬마선충의 수명을 측정하는 전통적인 플레이트 기반 방법을 설명합니다. 예시 프로토콜은 RNAi로 처리된 기생충의 수명을 측정합니다.

수명 분석: 예쁜꼬마선충(C. elegans) 수명 측정

여기, 우리는 넓은-범위 식이 제한 유전자 발현 및 수명에 관련 된 프레임 워크 제시. 우리는 넓은-범위 식이 제한 및 유전자 발현이이 패러다임에서의 양적 이미징에 대 한 프로토콜 설명합니다. 우리는 더 이상 음식 감지에 관여 유전자 회로의 정보 처리 기능 기본 공개 전산 분석 개요.

C. 선 충 에서 광범위 한 범위 식이 제한 유전자 식 수준 동안 수명 변조에서 인코딩된 정보의 정량화

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

이미징 플랫폼 "The Lifespan Machine"은 대규모 개체군의 평생 관찰을 자동화합니다. 수명, 스트레스 저항성, 발병 기전 및 행동 노화 분석을 수행하는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 데이터의 품질과 범위를 통해 연구자들은 생물학적 및 환경적 변이가 존재함에도 불구하고 노화에 대한 개입을 연구할 수 있습니다.

Lifespan Machine을 사용한 High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assay

이 프로토콜은 액체 배양에서 박테리아의 청소율을 측정하여 Caenorhabditis elegans 섭식 속도를 정량화하는 분석을 설명합니다.

예쁜꼬마선충( Caenorhabditis elegans )의 음식 섭취량을 세균 청소율 측정으로 정량화

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans의 배아 치명률을 정량화하는 간단하고 저비용의 절차를 제공합니다. 전문 장비나 벌레 제거 전문성 없이도 집단 전체에서 배아 이상을 쉽게 감지할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 유전적 돌연변이, RNA 간섭 매개 유전자 노크다운, 식이의 효과를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 치명률 정량화

배우세요 Replica Set 방법을 사용하여 C. elegans의 수명과 건강수명을 고처리량으로 정량 측정하는 기술입니다. 이 방법은 유전자 간 상호작용 연구와 노화 메커니즘 이해에 필수적인 도구를 제공합니다.

복제 설정된 방법: 양적 측정 꼬마 선 충 수명에 접근 높은 처리량

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