셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

이 방법은 종양 형성, 세포 이동 추적, 암 및 건강한 세포 신호와 같은 암 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 섬유아세포와 같은 기질 세포와 함께 3D 환경에서 저비용과 높은 재현성으로 종양 형성을 연구할 수 있다는 것입니다. 재료가 생물 인쇄가 가능하고 생체 기능적인지 확인하는 것이 중요하며, 이를 위해서는 유변학적 특성과 세포 호환성에 대한 정량적 연구가 필요합니다.

하이드로겔 준비 및 셀 하이드로겔 혼합 단계는 기포 형성이 인쇄된 모델의 충실도를 방해하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 생물 안전 캐비닛에서 250ml 비커에 알긴산 3g과 젤라틴 분말 7g을 섞습니다. 자석 교반기와 100ml의 DPBS를 추가합니다.

오염을 방지하기 위해 비커를 멸균 파라핀 필름과 알루미늄 호일로 밀봉하십시오. 그런 다음 참가자에게 근전도 또는 EMG 패턴에 해당하는 독특하고 구체적인 극성 플롯을 보여줍니다. 그 후, 실온에서 2 시간 동안 교반을 계속하십시오.

겔이 액체 상태로 상전이를 거칠 때까지 용액을 섭씨 37도에서 가열합니다. 그런 다음 용액을 멸균 50ml 원추형 원심분리기 튜브에 옮기고 밀봉합니다. 가스 기포를 제거하기 위해 834회 g에서 5분 동안 튜브를 원심분리하십시오.

다음으로, 하이드로겔 전구체를 10ml 주사기로 흡인합니다. 캡과 파라핀 필름으로 주사기를 밀봉합니다. 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오.

테스트를 시작할 준비가 되면 준비된 하이드로겔 전구체의 주사기를 섭씨 37도의 수조에 1시간 동안 놓습니다. 주사기가 예열되는 동안 레오미터를 켜고 초기화합니다. 한 시간 후 수조에서 주사기를 제거합니다.

약 0.5 ml의 프리케이터를 레오미터 플랫폼으로 압출합니다. 제어판에서 아래쪽 삼각형 버튼을 클릭합니다. 측정 도구가 트리밍 위치로 내려갈 때까지 기다립니다.

주걱을 사용하여 측정 도구의 가장자리에서 벗어난 과도한 전구체를 제거하고 불필요한 물질을 버립니다. 그런 다음 측정 도구의 가장자리에 미네랄 오일을 피펫으로 넣습니다. 오일이 경계를 완전히 밀봉할 때까지 기다립니다.

제어판에서 Continue(계속)를 클릭합니다. 그런 다음 시작 버튼을 클릭합니다. 테스트가 완료되면 측정 도구에서 손을 떼고 위쪽 삼각형 버튼을 클릭합니다.

측정 도구를 제거하십시오. 측정 도구와 플랫폼을 모두 70% 에탄올로 청소하십시오. 먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 완전한 진폭 및 온도 스윕입니다.

등온 시간 스윕을 시작하려면 My Apps(내 앱)를 클릭하고 등온 시간-온도 테스트용 템플릿을 클릭합니다. 워크플로에서 측정 단계를 클릭합니다. 그런 다음 가변 진동 변형률을 클릭하고 설정 창을 불러옵니다.

진동 변형률을 0.1%로 설정하고 진동 주파수를 1헤르츠로 설정합니다. 풀업 창에서 데이터 점의 수를 120으로 설정합니다. 데이터 수집 빈도를 분당 1포인트로 설정합니다.

추가 버튼을 클릭하여 온도 변수를 추가합니다. 변수 온도를 클릭하고 섭씨 25도로 설정합니다. 워크플로에서 Device, Move to measuring point 단계를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.

삭제를 클릭합니다. 그런 다음 장치, 값 설정 단계를 클릭합니다. 값에 도달할 때까지 대기 상자를 선택 취소하고 값을 섭씨 25도로 설정합니다.

하단 화면에서 사진, 제목, 버튼을 클릭합니다. 계속 확인란의 선택을 취소합니다. 그런 다음 시작 단계를 클릭하고 프로젝트 이름을 지정한 다음 저장합니다.

이제 샘플을 레오미터 플랫폼에 로드하고 앞서 설명한 일반 테스트 프로토콜에 따라 테스트를 시작합니다. 그런 다음 시간 대비 G 소수와 G 이중 소수를 관찰합니다. G 소수와 G 이중 소수의 교차 지점을 구하고 교차 지점에서 시간을 결정합니다.

그런 다음 테이블을 클릭하고 모든 데이터를 복사하여 텍스트 파일에 붙여넣습니다. 다양한 겔화 시간에서 항복 강도를 측정하려면 My Apps(내 앱)를 클릭합니다. Yield and flow stress, Gel-like(젤 모양)에 대한 템플릿을 클릭합니다.

프로젝트 이름을 지정합니다. 그런 다음 워크플로에서 시작 단계를 클릭합니다. 상단 메뉴에서 Insert(삽입)를 클릭합니다.

그런 다음 드롭다운 메뉴에서 대기를 선택합니다. 설정 창을 열고 대기 시간을 50분으로 설정합니다. 시작을 클릭한 다음 삽입을 다시 클릭합니다.

드롭다운 메뉴에서 장치를 선택합니다. 설정 창을 당겨 온도를 선택하고 섭씨 25도로 설정합니다. 값에 도달할 때까지 대기 상자를 선택 취소합니다.

워크플로에서 측정 단계를 선택합니다. 변수 전단 응력을 선택하고 설정 창을 불러옵니다. 초기 및 최종 전단 응력을 각각 0과 10, 000파스칼로 설정합니다.

그런 다음 계산기를 클릭하고 포인트 밀도를 파스칼당 0.2포인트로 설정합니다. 왼쪽의 데이터 포인트 탭에서 초당 1개의 포인트를 설정합니다. 풀업 창 하단에서 Event Control(이벤트 제어) 탭을 선택하고 전단 속도가 초당 100보다 큰 경우 측정 중지 기준을 설정합니다.

샘플을 레오미터 플랫폼에 로드하고 앞서 설명한 일반 테스트 프로토콜에 따라 테스트를 시작합니다. 테스트가 완료되면 다이어그램을 클릭하여 변형-응력 곡선을 관찰합니다. 30분, 40분 및 50분의 대기 시간에 대해 이 테스트를 반복합니다.

다음 단계는 멸균 상태에서 수행해야 합니다. 시작하려면 바이오프린터에 70% 에탄올을 철저히 분사한 다음 밤새 자외선에 노출시켜 살균합니다. 보관에서 하이드로겔 전구체 주사기를 제거하고 섭씨 37도의 수조에서 1시간 동안 데웁니다.

이전에 배양된 세포의 T-플라스크를 CO2 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮깁니다. 배양 배지를 버리고 DPBS로 세포를 두 번 헹굽니다. 데워진 트립신-EDTA 용액을 세포에 추가합니다.

섭씨 37도에서 6분 동안 배양합니다. 그런 다음 동일한 부피의 FBS를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 수조에서 하이드로겔 전구체의 주사기를 제거하고 청소하십시오.

주사기를 생물 안전 캐비닛으로 옮기기 전에 70% 에탄올로 주사기를 살균하십시오. 약 3ml의 하이드로겔 프리코체를 10ml 인쇄 카트리지로 압출합니다. 기포 생성을 피하기 위해 천천히 피펫팅하여 MDA-MB-231-GFP 세포와 전구체를 밀리리터당 100만 세포 농도로 혼합합니다.

카트리지를 끝 캡과 상단 캡으로 덮고 파라핀 필름으로 밀봉합니다. 그런 다음 834 회 g에서 1 분 동안 원심 분리하여 가스 기포를 제거합니다. 다른 선구자에 대해 이 전체 프로세스를 반복합니다.

그런 다음 세 개의 카트리지를 모두 70% 에탄올로 살균하십시오. 멸균된 카트리지를 바이오프린터의 챔버에 로드합니다. 프린터의 제어 소프트웨어에서 manual(수동)을 클릭합니다.

그런 다음 프린터의 제어 소프트웨어에서 도구 헤드 탭을 확장합니다. 왼쪽의 그래픽 인터페이스에서 카트리지 하나를 클릭하고, 카트리지 온도를 섭씨 25도로 설정하고, 프리컨더가 인쇄 가능한 조건에 도달할 때까지 35분 동안 기다립니다. 다른 두 카트리지에 대해 이 작업을 반복합니다.

프린터의 제어 소프트웨어에서 Tool head 탭을 확장합니다. 그래픽 인터페이스에서 하나의 카트리지를 클릭한 다음 measure short(짧은 측정) 버튼을 클릭하여 노즐 팁의 위치를 측정합니다. 다른 두 카트리지에 대해 이 작업을 반복합니다.

그런 다음 프린터 스테이지에 투명 폴리스티렌 마이크로플레이트를 놓습니다. G 코드 파일을 열고 모든 카트리지에 대해 압력을 200킬로파스칼로 변경합니다. 제어 소프트웨어로 돌아가서 Scaffolder Generator 탭을 클릭합니다.

인쇄를 시작할 지점을 선택하고 실행(Run) 버튼을 클릭합니다. 이 과정을 반복하여 3개의 반복실험을 얻습니다. 그런 다음 100밀리몰의 염화칼슘 용액을 1분 동안 첨가하여 모델을 가교합니다.

DPBS로 두 번 헹굽니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 모델을 아가로스 코팅된 6웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 각 웰에 5ml의 DMEM을 첨가하고 섭씨 37도에서 배양하고 이산화탄소를 5%씩 배양하여 3일마다 세포 배양 배지를 교체합니다.

이 연구에서는 3차원 하이드로겔 시스템을 제작하여 생체 내 종양 미세환경을 재현하고 다세포 종양 스페로이드의 형성을 촉진합니다. A3G7 전구체의 온도 스윕은 G 더블 프라임이 섭씨 37도에서 G 프라임보다 큰 것으로 나타나며, 이는 전구체의 알려진 특성을 검증합니다. 온도가 낮아짐에 따라 전구체는 젤라틴 분자가 삼중 나선 형성으로 자발적으로 물리적으로 얽히기 때문에 물리적 겔화를 겪습니다.

G 프라임과 G 더블 프라임은 모두 온도를 증가시키고 섭씨 30.6도에서 수렴하여 졸-겔 전이를 나타냅니다. 인쇄된 프로펠러 모델의 컨포칼 현미경 검사는 MDA-MB-231-GFP 세포가 배양 기간 15일 동안 스페로이드를 발달시키기 시작하고 스페로이드는 30일까지 크기와 수가 계속 증가하는 것을 보여줍니다. IMR-90-mCherry 세포 중 일부는 응집체를 형성하는 것도 보입니다.

배양 30일 후, IMR-90-mCherry 세포는 MDA-MB-231-GFP 세포가 초기에 점유했던 영역에서 관찰될 수 있었고, MDA-MB-231-GFP 세포는 IMR-90-mCherry 우세 영역에서 관찰될 수 있었습니다. 이는 모델에서 가능한 마이그레이션 이벤트를 의미합니다. 디스크 모델의 컨포칼 현미경 검사는 MDA-MB-231-GFP 세포가 프로펠러 모델에서와 유사하게 행동하여 21일의 배양 후 스페로이드가 함유된 하이드로겔을 생성한다는 것을 보여줍니다.

마스터하면 모델을 인쇄하는 이 기술을 제대로 수행하면 2시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 하이드로겔과 세포를 가능한 한 최신 상태로 유지하고, 오래된 하이드로겔 배치를 새 배치와 혼합하지 않으며, 오해의 소지가 있는 결과를 피하기 위해 멸균 상태에서 작업해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 주사 전자 및 타임 랩스 현미경과 같은 다른 방법을 수행하여 재료 다공성, 세포 이동 속도 및 매트릭스 리모델링과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술의 의미는 암 치료로 확장되는데, 그 이유는 이 시험관 내 모델을 통해 공동 배양 시스템에서 종양 형성 및 행동에 대한 체계적으로 통제된 연구를 수행할 수 있기 때문입니다. 유방암 세포 외에도 이 모델은 다양한 초기 위치에서 다른 유형의 세포를 사용하는 시스템에도 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 하이드로겔을 적절하게 준비하고, 세포를 내장하고, 최적의 인쇄 창 내에서 재료를 인쇄하여 3D 이종 질병 모델을 만드는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

생물학적 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 장갑, 실험실 가운 및 보안경과 같은 개인 보호 장비를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 잊지 마십시오.