Name: 분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 배우세요 단일세포 유전자 발현 분석과 FACS를 결합한 방법으로 줄기세포 및 암세포 이질성을 규명하고 면역표현형을 특성화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 세포 다양성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 의료 연구, 스웨덴어 유년기 암 재단, 라 그 나 Söderberg 재단, 그리고는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에 대 한 스웨덴의 암 사회, 스웨덴 연구 위원회, 스웨덴의 사회에서 교부 금에 의해 지원

1입니다. 세포 접시의 준비
<ol><li>390 µ L nuclease 무료 물, 10%의 17 µ L를 혼합 하 여 10% 추가, 96 웰 스에 대 한 충분 한 세포의 용 해 버퍼 준비 RNA/DNA 무료 벤치를 사용 하 여 NP-40, 2.8 µ L 10 mM dNTP, 10 µ L 0.1 M DTT와 5.3 µ L RNAse 억제제 ( 재료의 표참조). 와 동 그리고 아래로 회전입니다.</li>
	<li>96 잘 PCR 플레이트의 각 음에 세포의 용 해 버퍼의 4 µ L 고 접착 필름으로 접시를 봉인. 접시의 바닥에 액체를 수집 하는 튜브 아래로 회전 합니다. 셀 정렬 (최대 24 시간)까지 얼음에 플레이트를 유지.</li>
</ol>2입니다. 셀 정렬 셀의 준비
<ol><li>적절 한 수의 실험에 대 한 (여기, CD34 풍부한 조 혈 줄기와 조상 세포) 셀 동 1 x 106 세포는 약 3 96 잘 접시 컨트롤에 포함 된 단일 셀의 정렬 적합 합니다.</li>
	<li>15 mL 원뿔 튜브에 해 동된 셀을 전송 하 고 1 mL FBS 모든 30 추가 s 8 mL의 총 볼륨에 도달할 때까지. 셀 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심 분리기에서 회전 하 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>Resuspend 8 mL 버퍼 얼룩에 셀 (PBS 2 %FBS) 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 원심과 상쾌한 제거.</li>
	<li>200 µ L 얼룩에서 resuspend 셀 버퍼링 하 고 셀 제어 얼룩을 제거.</li>
	<li>50에 세포의 일부분을 얼룩에 의해 한 컨트롤 (FMOs) 각 fluorophore 마이너스 형광을 확인 µ L 버퍼 얼룩. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브는 FMOSs로 사용 됩니다. 참고 셀의 수는 인구 조사에 따라 조정 되어야 한다. 각 튜브를 하나 제외 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 모든 항 체를 추가 합니다.</li>
	<li>각 fluorophore 사용에 대 한 50 µ L 버퍼에 셀의 일부를 착 색 하 여 각 fluorophore에 대 한 하나의 얼룩을 확인 합니다. 이 예제에서 20000 셀 6 microcentrifuge 튜브 사용 됩니다. 참고 각 항 체에 대 한 대상 컨트롤에 사용 되는 세포에 의해 표현 될 필요가. 개별 튜브에서 샘플 얼룩 처럼 동일한 농도에서 각 항 체를 추가 합니다. 또한 흠 없는 컨트롤로 50 µ L에 20000 흠 없는 셀을 계속.</li>
	<li>셀 샘플을 그들의 적절 한 농도에서 항 체를 추가 합니다. 사용 1/100 농도, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 및 혈통 믹스에서 CD34-FITC 운항: CD3-PECy5 1/50, c d 2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, 및 CD235a-PECy5 1/1000입니다.</li>
	<li>어둠 속에서 얼음에 30 분을 위한 항 체와 세포를 품 어.</li>
	<li>셀 3 mL 버퍼 얼룩이 씻어. 4 ° C에서 10 분 동안 350 x g 에서 세포를 원심 고 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>Resuspend 셀 고 2.9 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>500 µ L에서 샘플 및 100에서 FMOs resuspend µ L 버퍼 1/100 7AAD 및 필터 세포를 단일 세포 현 탁 액을 50 µ m 필터를 통해 얼룩.</li>
</ol>3. 셀 정렬
<ol><li>FACS 기계 설정 되어 있는지 확인 드롭 지연 및 cytometer 설치 및 추적 (중부 표준시) 적절 한 셀 정렬 있도록 제조업체의 지침에 따라 수행 되었습니다 최근 그와 제대로. 조 혈 모 세포에 대 한 4의 85 미크론 노즐과 최대 속도의 사용은 권장, 최적의 이벤트 속도가 800 및 2000 이벤트/s 사이.</li>
	<li>형광 보상을 수행 하 여 스펙트럼 중첩에 대 한 수정 하 고 게이츠 FMO 컨트롤 또는 내부 부정적인 컨트롤 설정.</li>
	<li>대상 인구의 해도 얼룩 버퍼의 100 µ L 가진 새로운 microcentrifuge 관으로 적어도 100 대상 셀을 정렬 하 여 수행 합니다. FACS 정렬된 셀 정렬된 샘플을 기록 하 여 분석 하 고 그들은 정렬 게이트에서 결국 다는 것을 확인 한다.</li>
	<li>설정 단일 셀 플레이트 96 잘 접시에 잘 A1 드롭 중심으로 정렬. 중심은 50-100 6 µ m 입자 모든 우물 우물 모든 셀의 각 센터에 얻을 것 이다 있도록 빈 96 잘 접시의 가장자리 주위에 정렬 됩니다.</li>
	<li>만약에 가능 하다 면, 가능한 셀 정렬 되도록 추가 제어 생체 외에 성장에 대 한 단일 셀을 정렬 하 여 추가할 수 있습니다. Haematopoietic 셀 FLT3L, TPO, SCF 1% 페니실린 스, 100 ng/mL로 100 µ l SFEM에서에서 U-하단 96 잘 접시에서 자란 수 있습니다. 3 일 후에 문화는 현미경을 사용 하 여 셀 식민지를 위한 각 잘 분석.</li>
	<li>플레이트에서 접착 필름을 제거 합니다. 96 웰 스에서 92에 (여기에 린-CD34 + CD38-세포)의 단일 셀 정렬 각 단일 셀에 대 한 (여기 CD45RA, CD49f, 및 CD90) 다른 표식에 대 한 immunophenotypic 프로필을 저장 하는 소프트웨어를 정렬 FACS에 인덱스 정렬 활성화 합니다.</li>
	<li>10 및 20 각각 선형성 컨트롤 PCR 증폭에 대 한 세포와 2 개의 우물을 정렬 합니다. 웰 스 h 1과 h 2 일반적으로 사용 됩니다.</li>
	<li>아니오-템플릿 컨트롤, 일반적으로 우물 H3 및 H4 셀 없이 2 개의 우물을 유지.</li>
	<li>명확한 접착제 필름으로 접시를 봉인 하 고 스냅 드라이 아이스에 냉동 하기 전에 1 분 동안 300 x g 에서 접시를 회전.</li>
	<li>-80 ° c.에 냉동된 번호판을 저장 참고: 안전 정지 지점입니다. 정렬 및 lysed 세포는 장기 저장을 위한-80 ° C에 보관 수 있습니다.</li>
</ol>4. 반전 전사 및 특정 대상 확대
<ol><li>등 내부 관리 유전자 뇌관 뇌관 제어용 아군에서 RNA, RNA/DNA 무료 벤치에 RNAse 무료 튜브 1.5 mL에 각 뇌관 쌍의 2 µ L을 추가 하 여 모든 96 유전자 표적을 위해 뇌관 믹스를 준비 합니다. 미만 96 뇌관을 사용 하 여, nuclease 무료 물 없는 뇌관에 대 한 해당 볼륨을 추가 합니다. 프라이 머는 별도로 원하는 유전자 패널에 맞게 정렬 됩니다.</li>
	<li>반전 녹음 방송 및 혼합 반응 혼합 x 632.5 µ L 2, 101.2 µ L을 추가 함으로써 특정 대상 확대 Taq/SuperscriptIII, 151.8 µ L 뇌관 믹스, 그리고 0.7 µ L 제어 RNA에에서 아군. 이 단계는 DNA 무료 벤치에 예비적 형성. Vortexing와 수집 튜브의 하단에 있는 액체 아래로 회전 급강하에 의해 혼합. 샘플에 추가 될 때까지 얼음에 계속.</li>
	<li>반응 혼합 x 2의 27.5 µ L, Taq 효소의 1.76 µ L, 뇌관 믹스의 6.6 µ L, nuclease 무료 물 2.64 µ L를 혼합 하 여 4 개의 우물에 대 한 만들기 없음 반전 전사 제어 믹스. 제어 RNA에에서 스파이크. DNA 무료 벤치에이 단계를 수행 합니다. 와 동 그리고 샘플 수집 튜브 및 추가까지 얼음에 계속의 하단에 있는 액체 아래로 회전.</li>
	<li>Lysate 번호판 얼음에 녹여 92 웰 스, 선형성 및 아니오-템플릿 컨트롤을 포함 하 여 이전에 준비 된 반전 녹음 방송 및 특정 대상 확대 믹스 8.75 µ L를 추가 합니다. 4 나머지 우물을 아니 반전 전사 제어 믹스의 8.75 µ L를 추가 합니다. 명확한 접착제 필름 및 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전 접시를 봉인.</li>
	<li>반전 녹음 방송 및 특정 대상 증폭 앰프 프로그램;에 따라 PCR 기계에서 접시를 실행 하 여 예비적 형성 단계 1시 50분 ° C 60 분, 2 분 동안 2: 95 ° C 단계, 단계 3: 95 ° C 15에 대 한 s, 단계 4: 60 ° C 4 분, 반복 단계 3-4 24 시간 및 마지막으로 영원히 5: 8 ° C 단계.</li>
	<li>PCR를 완료 한 후 단기 저장을 위해 8 ° C 및 장기 저장을 위한-20 ° C에서 접시를 유지. 참고: 안전 정지 지점입니다. 단기 저장을 위해 8 ° C에 그리고 장기 저장을 위한-20 ° C에서 증폭 된 자료를 보관할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 다중 미세 유전자 표정 분석에 대 한 샘플 및 시험 접시의 준비
<ol><li>분석 결과 pipetting 3 접시를 로드 준비 µ L 분석 결과 로딩 시 약 96 잘 접시의 각 음에. 플레이트 로드 분석 결과에서 개별 우물에 각 뇌관의 3 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.</li>
	<li>준비 희석 플레이트 nuclease의 pipetting 8 µ L에 의해 무료 물 96 잘 접시의 모든 우물에. 1: 5의 최종 희석 하는 희석 접시에 증폭 된 샘플의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>접착 필름 판 인감, 10 vortexing 격판덮개에 의해 혼합 s, 그리고 마지막으로 수집 액체 접시의 바닥에 아래로 회전.</li>
	<li>샘플 로드 믹스 마스터 믹스의 352 µ L의 샘플 로딩 시 약 35.2 µ L 신중 하 게 혼합 하 여 준비 합니다. Aliquoting 3.3 µ L 로드 96 잘 접시의 각 잘 혼합 하 여 샘플 로드 접시를 준비 합니다.</li>
	<li>접시를 로딩 하는 샘플의 각 음에 희석된 샘플에서 2.7 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>접착 필름 및 플레이트의 하단에 수집 액체 아래로 회전 접시를 봉인.</li>
</ol>6. 미세 칩의 로드
<ol><li>새로운 96 x 96 미세 칩을 가져가 라. 파고 그들 모자와 주사기에 이동 될 수 있다 다는 것을 확인 하 여 후미를 준비 합니다.</li>
	<li>주사기에서 거품을 제거 합니다. 기울이기 칩 45도 하면서 밸브를 누르고 각 밸브를 주사기의 전체 볼륨을 추가 합니다. IFC 컨트롤러 칩을 프라임.</li>
	<li>플레이트 로드 분석 결과에서 우물의 각에서 각 분석 결과 입구 4.25 µ L로를 로드 합니다. 거품을 하지 마십시오. 거품에는 잘 표시, 피 펫 팁 그들을 제거 합니다.</li>
	<li>플레이트 로드 샘플에 우물의 각에서 각 샘플 입구 4.25 µ L로 로드 continue, 거품을 방지 하 고 거품 표시, 피 펫 팁 그들을 제거.</li>
	<li>IFC 컨트롤러 칩을 로드 합니다.</li>
	<li>칩도 외모와 모든 챔버 로드 된 확인 하십시오. 테이프와 그것으로 칩 표면에서 먼지를 제거 합니다. 멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼에 칩을 실행 합니다.</li>
</ol>7. 다중 미세 유전자 식 플랫폼에 칩 실행
<ol><li>멀티플렉스 미세 유전자 식 플랫폼으로 칩을 로드 한 후 샘플을 이름을 지정 합니다.</li>
	<li>이용한 수동 염료로 설정 합니다. 형광으로 단일 프로브 및 팸-MGB를 설정 합니다. 96 x 96 표준 v 2를 사용 하 여 프로토콜. 실행 시작.</li>
	<li>제거 칩 실행 하면 완료 됩니다.</li>
</ol>8. 예비 분석 칩 실행의
<ol><li>실시간 PCR 분석 소프트웨어에 데이터를 로드 합니다.</li>
	<li>세포 및 유전자 레이아웃 탭으로 구분 된 파일에서 풀 칠해서 유전자 이름 및 셀 이름을 로드 합니다.</li>
	<li>이미지 보기를 열고 고 염료를 이용한 선택 합니다. 모든 웰 스를 이용한 수동 염료 있다면 확인 하십시오.</li>
	<li>모든 증폭 플롯 확인 ( 그림 3E비슷합니다) 없이 스파이크와 부드러운 증폭 곡선으로 본다면 조사.</li>
	<li>모든 단일 세포 아군에 제어 모두 제대로 로드는 다는 것을 확인 하는 RNA의 식을 확인 합니다.</li>
	<li>모든 셀 내부 관리 유전자 발현 있고 따라서 제대로 정렬 된 것을 확인 합니다.</li>
	<li>10 및 20 셀 선형성 제어 선형 증폭을 확인 하기 위해 약 1 CT 차이가 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>NoRT 컨트롤 샘플 식 인지 확인 합니다. 식을 noRT에 감지 되 면 후속 실행에 대 한 게놈 DNA를 검색 하지 않습니다 프로브에 프로브를 변경 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 csv 파일에서 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>9. 단일 세포 분석 SCExV를 사용 하 여
참고: 입문 영화 존재20 도구를 소개 하는. 여기, 프로토콜에 도입 하는 컨트롤을 사용 하 여 분석을 수행 하는 방법의 짧은 추천 제공 됩니다.
<ol><li>SCexV 웹사이트20에 연결 합니다.</li>
	<li>내보낸된 CSV 파일을 업로드.</li>
	<li>긍정적인 통제로 제어 RNA에서 아군을 선택 했다. 25 위 제어 RNA CT는 모든 셀을 제거 합니다. 중간 식 제어 RNA의 데이터를 정상화.</li>
	<li>"다 여기-> 분석"을 클릭 합니다. 제외 셀 옵션에서 noRT, notemplate, 10 및 20 셀 컨트롤을 제거 합니다.</li>
	<li>클러스터의 예상된 번호 선택의 클러스터링 방법으로 클러스터 셀. 분석된 값을 내보냅니다.</li>
</ol>10. 인덱스 정렬 분석
<ol><li>FACS 분석 소프트웨어 열고 인덱싱된 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>스크립트 편집기를 열고 퀸 제이 외 에서 사용할 수 있는 스크립트를 실행 21
</li>
	<li>FACS 분석 소프트웨어 단일 셀의 각 게이트를 만든 해야, 레이아웃 편집기를 열고 고 ("Sample_complete_Data.xls" 라는 파일에서 사용할 수 있는) SCexV에서 그룹화에 따라 셀 색.</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

최근 몇 년 동안, 단일 셀 유전자 표정 분석은 다양 한 세포 인구23의 정의에 가치 추가 되었다. 그러나 이러한 메서드는 셀 시퀀싱 깊이 탈락에 의해 복잡 하 게 RNA 시퀀싱 기술의 출현 이론적으로 셀의 전체 transcriptome 측정 하는 가능성을 제공 합니다. 단일 셀 정량 제공 중요 한 유전자에 있는 모든 세포의 수백의 식의 과민 하 고 강력한 분석 기술 노이즈 감소 마찬가지로 처리 됩니다. 성적 증명서의 제한 된 수의 집중된 분석 또한 매우 표현된 유전자에서 간섭 없이 단순화 된 분석을 위해 수 있습니다.
만 셀에 표현 하는 유전자의 하위 집합을 조사 하는 접근 그것 이므로 매우 유전자 패널을 설계 할 때 유전자의 정확한 세트를 선택 하는 것이 중요. 유전자의 선택; 여러 가지 방법으로 할 수 있습니다. 통해 문학, 대량 분석 및 공개적으로 사용 가능한 데이터의 생물 정보학 분석에 의해 이전 연구 결과. 이것은 간단 합니다...

각 개별 혈액 세포 어디 줄기 세포 형성 결국 말기 특정 들고 최종 효과 기 세포로 분화 하는 점점 더 최선을 다하고 중간 창시자의 시리즈 위에 정점 세포 계층 구조에서 것으로 생각 됩니다. 생물 학적 기능1. 줄기 세포 시스템 구성 방식에 대 한 지식을 많이 크게 능력을 고도로 농축 줄기 세포 또는 다양 한 창시자2 가지 조 혈 인구 prospectively 분리 때문에 조 혈 시스템에 생성 된 FACS 정렬. 이 분석 기능 또는 분자로, 주로 유전자 발현 프로 파일링3,4를 통해 이러한 인구의 많은 수 있다. 그러나 때 대량 인구 개별 차이 세포의 유전자 발현을 분석은 평균 밖으로 하 고5를 잃었다. 따라서, 이기종 셀 분수 내 셀 변화를 감지 하는 무능 경우 셀의 작은 하위 집합 그 인구6,의 유추 생물 학적 기능에 대 한 중요 한 생물 학적 과정에 대 한 우리의 이해 혼동 수 있습니다. 7. 반대로, 유전자 식 서명 단일 셀 해상도 조사가 윤곽을 그리 다 셀8overrepresented 하위 집합에서가 영향을 회피 하는 가능성을 제공.
현재까지 단일 셀 유전자 표정 분석을 위한 많은 프로토콜 개발 되었습니다; 각 접근 자체 주의 데. 가장 이른 방법은 이었다 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기), 한 번에 제한 된 수의 성적을 측정 하지만 독특한 RNA 지역화9,11의 조사에 대 한 수 있습니다. 단일 또는 거의 기록 했다 또한 감지를 PCR과 정량 Pcr를 사용 하 여 초기 방법 개발12. 그러나,이 요즘 대체 되었습니다 동시에 정량 셀의 수백에 셀 당 증명서의 수백의 식을 분석 하 고 따라서 높은 차원이 분석을 사용 하 여 허용 수 있는 마이크로-기반 방법으로 사전 결정 유전자 패널10,13. 최근 RNA 시퀀싱 기반 기술을 널리 사용이 될 단일 세포 분석을 위해 이러한 이론적으로 수 셀의 전체 transcriptome 측정 하 고 그로 인하여 추가 답사 차원이 분석10, 14. Multiplexed 정량 분석 및 단일 셀 RNA 시퀀싱 다른 기능을가지고, 따라서 방법 중 하나를 사용 하 여에 대 한 근거는 타깃 셀의 수 뿐만 아니라 질문에 따라 달라 집니다. 높은 처리량 및 단일 셀 RNA 시퀀싱의 편견, 탐구 특성 함께 셀 당 저가 알 수 없는 셀 또는 큰 인구 조사 때 바람직한. 그러나, 단일 셀 RNA 시퀀싱은 또한 낮은 풍부와 성적 증명서는 중단 하는 경향이 높은 풍부한 성적표를 더 자주 시퀀싱으로 편 파. 이 종종 미묘한 또는 기술적인 잡음15에 숨겨진 중요 한 분자 신호를 공개 bioinformatic 분석에 높은 수요를 상당히 복잡 한 데이터 발생할 수 있습니다. 따라서, 잘 특징이 조직에 대 한 단일 셀 정량 분석을 사용 하 여 미리 결정 뇌관 패널 기능적으로 중요 한 유전자 또는 분자 마커 선택의 질을 결정 하는 민감한, 간단한 접근 될 수 있는 인구입니다. 그러나, 주목 해야 한다 그에 비해 단일 셀 RNA-seq, 셀 당 비용은 단일 셀 정량 방법에 대 한 일반적으로 더 높은. 여기, 우리가 결합 하 여 단일 셀 실시간 정량 Pcr (Teles J. 그 외 여러분 에서 수정 하는 방법 설명 16), FACS 인덱스 인구 내에서 분자와 immunophenotypic이 특징에17 및 생물 정보학 분석18 를 동시에 정렬.
이 방법에서는, 관심사의 세포 인구, 스테인드 그리고 단일 세포 세포의 용 해 버퍼 96 잘 PCR 접시에서에 직접 FACS에 의해 정렬 됩니다. 동시에, 세포 표면 마커 추가 집합 식 수준의 FACS 라고 인덱스 정렬 방법-정렬, 하는 동안 각 단일 셀에 대 한 기록 됩니다. Lysed 세포 물자는 연속적으로 증폭 하 고 실시간 정량, 미세 플랫폼을 사용 하 여 선택된 된 유전자의 유전자 발현 분석. 이 전략에는 각 개별 셀의 세포 표면 마커 식의 정렬 된 단일 셀으로 동시 특성화의 분자 분석 수 있습니다. 직접 인덱스 정렬 된 표시자의 식 세포의 분자로 고유 하위 집합을 매핑하여,를 모집단 그들의 잠재 격리에 대 한 사용할 수 있는 특정 immunophenotype에 연결할 수 있습니다. 메서드를 설명 하는 그림 1에서 단계적으로. 미리 정해진된 유전자 패널 더 미묘한 유전자 식 신호를 가리고 그렇지 않으면 수 없는 풍부한 유전자의 측정 circumvents 이후 타겟된 유전자 발현의 높은 해상도에 기여 한다. 또한, 특정 대상 확대, 한 단계 반전 녹음 방송, 그리고 증폭 녹음 방송 요인 또는 비 폴 리 adenylated RNAs 같은 낮은 표현된 성적표의 강력한 측정에 대 한 수 있습니다. 중요 한 것은, 정량 방법에서 특정 악성 질병19를 조사할 때 중요 한 융해 단백질 mRNA의 측정에 대 한 수 있습니다. 마지막으로, 유전자의 집중된 수 조사, 낮은 드롭 아웃 요금, 및 제한 된 셀 확인이이 방법은 쉽게 분석 기술 차이 단일 셀 RNA-이 같은 높은 차원 방법에 비해 프로토콜에 따라, 전체 실험 수행할 수 있습니다, 정렬 셀 분석된 결과를 3 일 이내 중요 한, 높은 처리량 단일 셀 유전자 표정 분석에 대 한 단순 하 고 빠른 방법 만들기에서.

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>클론: 61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>클론: 3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>304608</td><td>클론: MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>클론: HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>클론: RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>클론: HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>클론: 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>클론 GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>클론: 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>클론: Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>클론: 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD bioscience</td><td>560362</td><td>클론: HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>클론: eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>96-well u-바닥 플레이트</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>줄기 세포 기술</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorph tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>CST beads</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>Accudrop 비즈</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 &micro; M 입자&nbsp;</td></tr><tr><td>접착 필름 Clear</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>접착 필름 호일</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 PCR 플레이트</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR 1.5 mL 튜브</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 PCR cycler</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>RNAse inhibitor</td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>from CellsDirect</td><td>kit</td></tr><tr><td>2x </td><td>CellsDirect 키트의</td><td>반응 혼합물 Invitrogen</td><td>11753-100</td></tr><tr><td>SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>CellsDirect 키트</td>Platinum&nbsp의 <td>Invitrogen</td><td>11753-100</td></tr><tr><td>; 타크&nbsp; DNA 중합효소</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 세포-CT 제어 키트</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA Control</td><td></td><td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td><td></td></tr><tr>20x Xeno RNA Control TaqMan <td>Cells-to-CT Control Kit</td><td></td> 96.96 샘플/로딩 키트의 Invitrogen 4386995 Xeno<td>RNA Control Kit 20x Xeno RNA Control TaqMan Gene Expression Assay</td><td>Invitrogen</td> 4386995</tr><tr><td> 10개의 IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x 분석 로딩 시약</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>From 96.96 샘플/로딩 키트</td></tr><tr><td>20x GE 샘플 로딩 시약</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>From 96.96 샘플/로딩 키트</td></tr><tr><td>제어 라인 유체&nbsp;</td><td>96.96 샘플/로딩 키트의</td> <td>Fluidigm</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 동적 어레이 IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar TreeStar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플루이다임 실시간 PCR 분석</td><td>플루이다임</td> 플루<td>이디</td><td></td>엄</tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td></tr><tr><td>ACE</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00169233_m1</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL.52</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs03043652_ft</td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs03024541_ft</td><td></td></tr><tr><td>BMI1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00995536_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNA2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00996788_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01030099_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01084593_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNC</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNF</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10. MME</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00153510_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11a</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00174217_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD123. IL3RA</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs00608141_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD133. PROM1</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220. INSR</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs00961554_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD24. HSA</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26. DPP4</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00175210_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD274</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32. FCGR2B</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344. FZD4</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs00201853_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD352. SLAMF6</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41. ITGA2B</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56. NCAM1</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD9</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD97</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs00908458_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDK6</td><td>써모피셔 사이언티픽</td><td>Hs01026371_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1A</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs00355782_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1B</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDKN1C</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00175938_m1</td><td></td></tr><tr><td>CEBPa</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00269972_s1</td><td></td></tr><tr><td>CSF1r</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00911250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CSF2RA</td><td>Thermofisher 과학</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>CSF3RA</td><td>써모피셔 과학</td><td>Hs01114427_m1</td><td></td></tr><tr><td>E2A. TCF3</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00413032_m1</td><td></td></tr><tr><td>EBF1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td></tr><tr><td>ENG</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00923996_m1</td><td></td></tr><tr><td>EPOR</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00959427_m1</td><td></td></tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01554629_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00956711_m1</td><td></td></tr><tr><td>FLT3</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td></tr><tr><td>FOXO1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01054576_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>Thermofisher 과학</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>GATA3</td>, <td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00231122_m1</td><td></td></tr>, <tr><td>GFI1</td>, <td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr><td>HES1</td>, <td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01118947_g1</td><td></td></tr><tr><td>HLF</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00171406_m1</td><td></td></tr><tr><td>HMGA2</td>, <td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00171569_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00430330_m1</td><td></td></tr><tr><td>HOXB4</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00256884_m1</td><td></td></tr><tr><td>ID2</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs04187239_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td></tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01118009_m1</td><td></td></tr><tr><td>IKZF1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01565750_m1</td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01013729_m1</td><td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01032443_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>MPO</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00924296_m1</td><td></td></tr><tr><td>NFIB</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs02621230_s1</td><td></td></tr><tr><td>RAG2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Sterile.IgH</td><td>Thermofisher scientific</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher 과학</td><td>Hs00169795_m1</td><td></td></tr></tbody></table>

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 immunophenotypic이

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic 특성 및 분자 분석이 윤곽을 그리 다 뚜렷한 세포 인구를 정의 하 오랫동안 사용 되어 왔습니다. 그러나 FACS은 본질적으로 단일 세포 분석 실험, 분자 분석 하기 전에, 대상 셀은 종종 prospectively 절연 되어 대량, 따라서 단일 셀 해상도 잃고. 단일 셀 유전자 표정 분석 이종 세포 인구에 있는 개별 셀 사이의 분자 차이 이해 하는 수단을 제공 합니다. 대량 세포 분석에서 고유한 셀 형식의 overrepresentation 생물 학적 중요성으로 편견 및 희소 한 세포에서 신호 않기에 결과. FACS 인덱스 정렬 단일 셀 유전자 표정 분석을 결합 하 여 인구 조사 수 단일 셀 해상도의 손실 없이 중간 세포 표면 마커 식 세포 또한 점령 하 고, 하는 동안 평가 활성화 연속 표면 마커 식의 관련성입니다. 여기, 우리는 단일 셀 반전 녹음 방송 결합 하는 접근 방식을 설명 정량 PCR (RT-정량) 및 FACS 색인 동시에 분자의 특성을 정렬 하 고 셀 인구 내의 immunophenotypic이.
단일 셀 RNA 시퀀싱 방법, 달리 특정 대상 증폭 정량 Pcr 사용 하 여 동안 수 있습니다 적은 낙후, 낮은 풍부 성적표의 강력한 측정 셀 변화에 읽기에 관련 된 문제에 의해 혼동 하지는 깊이입니다. 또한,에 의해 직접 인덱스 정렬 단일-세포 세포의 용 해로,이 방법은 버퍼 수 있게 cDNA 합성 및 특정 대상 사전 증폭 세포 표면 분자 서명 이후에 파생된의 상관 관계 뿐만 아니라 한 단계에서 수행할 수 표식 식입니다. 기술된 접근, 조 혈 단일 세포를 조사 하지만 또한 다른 세포 유형에 성공적으로 사용 되었습니다 개발 되었습니다.
끝으로, 여기에 설명 된 접근 분자로 별개 부분 모집단의 후속 예비 격리 프로토콜을 개발 하 패널에 대 한 가능성과 함께 미리 선택 된 유전자의 mRNA 표현의 중요 한 측정에 대 한 수 있습니다.

설명 하는 프로토콜은 빠르고 쉽게 수행 하 고 신뢰할 수 있는. 실험 설정에 대 한 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 전체 프로토콜 특정 대상 확대, 유전자 식 측정 및 예비 분석 단일 셀의 정렬에서 3 일 동안에서 수행할 수 있습니다. 96 뇌관 및 만성 골수성 백혈병 (CML) 환자에서 96 셀 이나 건강 세 일치에서 96 셀을 사용 하 여 단일 셀 유전자 표정 분석에서 예비 분석 된 데이터를 나타내는 열 지도 형태로 분석된 결과의 예 제어는 그림 2에 표시 됩니다. 계층적 클러스터링을 사용 하 여, 분석 된 세포는 그들의 유전자 식 서명 기반 4 개의 하위 그룹으로 나눌 수 있습니다. 열 지도 시각화 분석 (예를 들어, 제어 우물)에서 제외 해야 하는 웰 스에 대 한 제어로 뿐만 아니라 데이터에 대 한 개요를 얻을 수 있는 편리한 방법입니다. <...

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

이 방법은 줄기 세포 이질성이 어떻게 보이는지 및 민감한 암세포에 있는 치료가 어떻게 고립될 수 있는지와 같은 줄기 세포 및 암 필드에 있는 중요한 질문에 대답할 수 있습니다. 이 연구의 주요 장점은 표적 하위 인구의 추가 하류 특성화를 위해 암시노시스와 함께 기술적으로 견고한 단세포 유전자 발현 분석을 결합한다는 것입니다. 이 방법은 암과 줄기 세포 이질성을 조사하기 위하여 이용될 수 있더라도, 또한 유전자 프라이밍 및 혈통 잠재력에 통찰력을 줄 수 있습니다.프로토콜을 시작하려면 RNA / DNA가없는 벤치에서 390 마이크로 리터 뉴클레아제 프리 워터, 10 %NP-40, 2.8 마이크로 리터 10 밀리미터 dNTP, 10 마이크로 리터 0.1 μg DTT 및 5.3 개의 미세 리터를 혼합하여 96 개의 우물에 대한 충분한 용해 버퍼를 준비하십시오. 소용돌이와 튜브 아래로 회전. 다음으로, 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 용해 버퍼 4개를 배포하고 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.플레이트아래로 회전하여 하단의 액체를 수집합니다. 셀이 최대 24시간 동안 정렬될 때까지 접시를 얼음 위에 보관하십시오. FACS 기계가 제대로 설정되면, 얼룩 버퍼의 100 마이크로 리터와 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 적어도 100 대상 세포를 정렬하여 대상 인구의 재분석을 수행합니다.FACS는 정렬된 샘플을 기록하여 정렬된 셀을 분석하고 정렬 게이트에서 작동하는지 확인합니다. 그런 다음 96웰 플레이트에서 잘 A1의 드롭을 중심으로 단일 셀 플레이트 정렬을 설정합니다. 중앙에 있는 경우, 빈 96웰 플레이트 의 가장자리 주변의 모든 우물에 50~106마이크로미터 입자를 정렬하여 모든 우물이 각 우물의 중앙에 세포를 얻을 수 있도록 합니다.플레이트에서 접착제 필름을 제거합니다. Lin-CD34 플러스 CD38 마이너스 셀의 단일 셀을 96 개의 우물 중 92개로 정렬합니다. FACS 선별 소프트웨어에서 인덱스 정렬을 활성화하여 각 단일 셀에 대해 CD45RA, CD49F 및 CD90의 면역페노티픽 프로파일을 저장합니다.PCR 증폭에서 선형 도급 제어를 위해 각각 10 및 20 셀로 두 개의 우물을 정렬합니다. 웰스 H1과 H2는 일반적으로 사용됩니다. 템플릿 컨트롤없이 두 개의 우물을 유지, 일반적으로 우물 H3와 H4. 선명한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 300배 의 중력으로 1분 동안 회전시합니다.스냅은 마른 얼음에 접시를 동결. 그런 다음 영하 80도에서 보관하십시오. 대조RNA에서 스파이크된 2회 반응 믹스 632.5 마이크로리터, 101.2 마이크로리터 Taq/SuperscriptIII, 151.8 마이크로리터 프라이머 믹스, 0.7 마이크로리터를 첨가하여 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스를 만듭니다.용액을 소용돌이치고 아래로 회전하여 튜브 바닥에 있는 액체를 수집합니다. 샘플에 추가 될 준비가 될 때까지 얼음에 믹스를 유지합니다. 다음으로, 얼음에 용해 판을 해동.이전에 준비된 역전사 및 특정 표적 증폭 믹스의 8.75 마이크로리터를 선형성 및 템플릿 컨트롤 없음을 포함하여 92개의 우물에 추가합니다. 나머지 4개의 우물에 역전사 제어 믹스가 없는 8.75 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 명확한 접착제 필름으로 플레이트를 밀봉하고 바닥에 액체를 수집하기 위해 판을 회전.프리앰프 프로그램에 따라 PCR 기계에서 플레이트를 실행하여 역전사 및 특정 표적 증폭을 수행합니다. 분석 적재 판을 96웰 플레이트의 각 웰에 분석 적재 시약 3마이크로리터를 배관하여 준비합니다. 각 프라이머의 마이크로리터 3개를 분석 적재 플레이트의 개별 우물에 추가합니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 플레이트를 회전한 후, 뉴클레아제 자유물의 8마이크로리터를 96웰 플레이트의 모든 우물로 배관하여 희석판을 준비한다. 희석 플레이트에 증폭된 시료 2개를 추가합니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉합니다. 접시를 10초 동안 소용돌이로 섞는다. 그런 다음 접시를 아래로 회전합니다.다음으로, 35.2 마이크로리터의 마스터 믹스를 35.2 마이크로리터의 시료 로딩 시약과 신중하게 혼합하여 시료 적재 믹스를 준비한다. 96웰 플레이트의 각 웰에 3.3 마이크로리터의 적재 믹스를 알리싱하여 시료 적재 플레이트를 준비한다. 희석된 샘플에서 2.7 마이크로리터를 샘플 로딩 플레이트의 각 웰에 넣습니다.접착제 필름으로 접시를 밀봉하고 아래로 회전. 96 마이크로 유체 칩에 의해 새로운 96을 꺼내. 캡이 달린 주사기로 입구를 찔러 서 서 움직일 수 있는지 확인합니다.칩을 45도로 기울이고 밸브를 누르는 동안 각 밸브에 주사기의 전체 볼륨을 추가합니다. IFC 컨트롤러로 칩을 프라임합니다. 각 분석 입구에 4.25 마이크로리터를 적재하여 각 우물에서 분석 적재 플레이트에 적재하고 거품을 피하십시오.거품이 우물에 나타나면 파이펫 팁으로 제거합니다. 시료 적재 판의 각 우물에서 4.25 마이크로리터로 각 샘플 입구를 계속 적재하고 거품을 피하고 피펫 팁으로 거품이 제거되는 것처럼 보입니다. 통합 유체 회로 컨트롤러 또는 IFC 컨트롤러로 칩을 로드합니다.칩이 균일하게 보이고 모든 챔버가 로드되었는지 확인합니다. 테이프로 터치하여 칩 표면에서 먼지를 제거합니다. 마지막으로, 멀티플렉스 미세 유체 유전자 발현 플랫폼에서 칩을 실행한다.성공적인 실행의 열 맵은 약 7~25개의 CD의 강력한 신호로 샘플 전체의 균일하게 확산된 식을 표시합니다. 제어 RNA에서 스파이크의 이 증폭 곡선은 모든 우물이 거의 또는 전혀 변이없이 약 10 CT의 명확한 발현을 가지고 있음을 확인, 사전 증폭 및 qPCR 반응이 모든 세포에 성공했다는 것을 검증. 치수 감소를 사용하여 세포 그룹 간의 유사성을 시각화하는 원리 성분 분석 또는 PCA는 4개의 하위 그룹을 식별하는 여기에서 분자적으로 구별되는 세포의 클러스터를 구별하는 데 유용할 수 있다.다른 분자 클러스터에서 세포의 면역 페노형을 식별하려면 인덱스 FCS 파일을 FlowJo에 로드합니다. 스크립트 편집기를 열고 인덱스 스크립트를 붙여 넣은 다음 실행을 누릅니다. 각 셀은 이제 별도의 게이트에 있게 됩니다.각 셀을 레이아웃 편집기에 추가하고 파일 sample_complete_data.xls 사용할 수 있는 SCXV의 분자 정의 그룹에 따라 색상을 지정합니다. FACS 플롯은 군집을 구별하고 기능 분석을 위해 이를 격리하는 데 사용할 수 있는 조혈 줄기 세포 마커 CD90 및 CD45RA에 대한 세포 표면 마커 발현을 보여준다. 이 절차에 따라, 새로 발견 된 하위 집단의 RNA 시퀀싱 또는 시험관 내 및 생체 내 실험과 같은 다른 기술은 분자 메커니즘이 이 이질성을 일으키는 원인이 되는 것과 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있으며 하위 집단은 기능적으로 어떻게 다른지.이 전략은 연구원이 정상 및 악성 조혈증에서 이질성을 조사할 뿐만 아니라 발견 된 하위 집단을 장래 분리하여 추가 연구를 하는 데 사용할 수있는 길을 열었습니다.

a-combinatorial-single-cell-approach-to-characterize-molecular

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

식별 하 고 자석의 조합 및 형광 정렬 (맥 및 FACS)를 사용 하 여 murine 골에서 골수성 창시자의 6 하위 집합을 격리 하는 방법을 보여 줍니다. 이 프로토콜은 생체 외에서 문화 분석 (스 또는 액체 문화), 입양 전송 실험 vivo에서 및 RNA/단백질 분석에 대 한 사용할 수 있습니다.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

여기에서 우리는 쥐 골수 세포를 표현형 조혈 줄기 및 전구 세포와 함께 지지하는 틈새 내피 및 중간엽 줄기 세포로 분리 및 염색하기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 내골 및 중앙 골수 영역에 위치한 세포를 풍부하게 하는 방법도 포함됩니다.

쥐 골수, 조혈 줄기 및 전구 세포, 기질 틈새 세포의 유세포 분석

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

single-cell/single-nuclei transcriptomics 및 multi-omics의 성공은 세포/핵의 품질에 크게 좌우됩니다. 따라서 조직에서 세포/핵을 분리하고 정제하는 것은 고도로 표준화되어야 합니다. 이 프로토콜은 다운스트림 단일 핵 다중체 분석을 위해 뇌와 골수에서 핵을 준비하는 방법을 설명합니다.

단일 핵 멀티옴 분석을 위한 고품질 뇌 및 골수 핵 준비

이 프로토콜은 단일 세포 분류 방법을 사용하여 인간 중간엽 줄기 세포의 형광 활성화 세포 분류를 사용하는 방법을 설명합니다. 특히, 단일 세포 분류를 사용하면 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합할 때 이종 집단에서 면역표현형 세포의 99% 순도를 달성할 수 있습니다.

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 질량 세포분석을 통한 근육 줄기 및 전구 세포의 식별 및 고차원 분석을 가능하게 하고 FACS에 의한 정제를 통해 기능에 대한 심층적인 연구를 가능하게 합니다. 이 접근법은 질병 모델의 재생 역학을 연구하고 약리학적 중재의 효능을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다.

High-dimensional Single-Cell Mass Cytometry에 의한 급성 골격근 손상 중 In Vivo의 Myogenic Progenitors 식별 및 분석

배우세요 단일세포 유전자 발현 분석과 FACS를 결합한 방법으로 줄기세포 및 암세포 이질성을 규명하고 면역표현형을 특성화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 세포 다양성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

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