Name: 표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 배우세요 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화 방법을 HEK293F 세포에서 발현하고 니켈 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 분리하는 기술입니다. 이 방법은 망막 질환 연구와 이온 채널 생물물리학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.

1. 생산 BacMam 식 Baculoviruses
<ol><li>BacMam 벡터 GFP 10 다음 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 인식 순서18 못에 원하는 포유류 bestrophin 단백질의 코딩 시퀀스를 삽입 그의 태그는 단백질의 C-말단에 x.</li>
	<li>접착제 HEK293 세포19,20,21,,2223에 식 플라스 미드를 transfect 정도. 10 배 또는 20 배 확대, 488 nm 여기 소스와 510 nm 방출 필터 (그림 1A) 형광 현미경 GFP 융해 단백질의 식을 확인 합니다. 참고: 고분자에 기초를 둔 transfection HEK293 세포의 35 m m 음식에 대 한 플라스 미드 DNA의 1 μ g 정기적으로 수행 됩니다.</li>
	<li>앞에서 설명한16,17Sf9 곤충 세포에서 baculoviruses를 생성 합니다. 참고: 통로 3 (P3) 바이러스, 단백질 생산을 위한 F HEK293 세포를 감염 하는 데 사용 됩니다, 4 ° C에서 1 달 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>플 라크 형성 분석 결과16,17여 P3 바이러스 titer (전염 성 단위)를 결정 합니다. 참고: 관심사의 단백질 GFP와 태그는로 감염 단위를 확인 하기 위한 빠른 방법 바이러스의 직렬 희석 Sf9 세포를 감염 하 고 48 h 후 형광 세포의 수를 계산 하는.</li>
</ol>2. 단백질 표정
<ol><li>8% CO2와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 HEK293 F 식 매체와 현 탁 액 문화에서 HEK293 F 세포를 유지 합니다. 일회용 문화 플라스 크를 2-2.5 시간 더 큰 문화 볼륨 보다 135 rpm에서 궤도 플랫폼에 문화를 회전을 사용 합니다. 참고: 구절 5와 30 사이 때 세포를 감염 하 고 셀 문화 후드 아래이 작업을 수행할 수 것이 좋습니다.</li>
	<li>바이러스 성 감염, 전에 24 시간 세포 배양의 15 μ 약 수에 Trypan 블루의 15 μ를 추가 하 고 셀 밀도 및 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 생존 확인. 각 매체의 500 mL와 함께 미리 37 ° c.에 따뜻하게 하는 2 x 2 L 플라스 크에 106 셀/mL x 0.6 셀 희석 참고: 죽은 세포는 얼룩이 블루 여 Trypan 블루. 원하는 세포 생존 능력은 &gt; 95%.</li>
	<li>감염의 날, 셀 밀도 생존 (2.2 단계)를 확인 합니다. 참고:의 높은 세포 생존 능력 &gt; 95%는 효율적인 감염 및 단백질 식을 위해 필수적 이다. 예상된 셀 밀도 ~1.0 x 106 셀/mL (성장된 하룻밤 106 셀/mL 세포 배양 x 0.6의 2 x 500 mL에서). 셀의 예상된 총 수는 ~1.0 x 109.</li>
	<li>P3 baculoviruses 5의 감염 (MOI)의 다양성에 있는 셀에 추가 합니다. 바이러스 예방의 금액을 확인 하려면 다음 식을 사용 하 여: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57832/57832eq1.jpg">
</li>
	<li>24 h에 대 한 8% CO2 습도 37 ° C 배양 기에서 135 rpm에서 궤도 플랫폼에서 세포를 흔들어.</li>
	<li>10mm 나트륨 낙 산 염의 세포 배양에 추가 하 고 48 h에 대 한 배양을 계속. 참고: 일부 단백질에 대 한 감소 셀 문화 온도 30 ° C를 후 식 및 안정성 나트륨 낙 산 염 또한 향상 시킬 수 있습니다.</li>
	<li>10 배 또는 20 배 확대, 488 nm 여기 소스 및 510 nm 방출 필터 형광 현미경, 백분율 및 직접 단백질 (bestrophin-GFP-10xHis) 수익률 (그림 1B)를 대표 하는 녹색 셀의 밝기를 확인 합니다. 참고: 녹색 세포의 비율에 의해 계산 됩니다: (녹색 셀/총 셀) x 100. 좋은 단백질 표정 수준 강한 녹색 형광 현미경으로 표시 됩니다.</li>
	<li>20 분 제거는 상쾌한 4 ° C에서 1000 x g에서 centrifuging 여 세포를 수확 하 고 다시 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) ~ 80 mL의 최종 볼륨을 가진 셀 펠 릿을 일시 중단. 분할 2 x 50 mL 원뿔 튜브 및 20 분에 4 ° C에서 1000 x g에서 원심 분리기에 세포 현 탁 액 셀 펠 릿-80 ° c.에 저장</li>
</ol>3. 단백질 정화
<ol><li>그렇게 그들은 녹여 10-15 분 동안 실 온에서 교 반 물 욕조에 셀 펠 릿을 포함 하는 원뿔 튜브를 품 어. 다시 0.1-1.0에 가수분해 억제제 (Aprotinin, Leupeptin, Pepstatin와 phenylmethylsulfonyl 불)와 보완의 버퍼는 (표 1) (예를 들어, 버퍼의 20 mL 펠 릿 셀의 10 g) (w/v) 볼륨 x 2에 셀 중단 m m. 위쪽 및 아래쪽 피펫으로 동종 세포 현 탁 액을 얻기 위해 광범위 하 게.</li>
	<li>고압 균질 화기를 사용 하 여 셀 lyse 셀 서 스 펜 션의 총에 대 한 7-10 MPa에서 균질 화기를 통해 실행 3-4 회 완전 한 균질 화를 달성 하기 위해. 얼음 2-3 분 라운드 사이 세포 lysate 유지.</li>
	<li>세포 lysate를 세제 [예를 들어, 2 %w / v 솔 급 n-라우릴-β-D-Maltopyranoside (DDM)]를 추가 합니다. 막 단백질을 추출 하 20 ° C에서 1 시간에 대 한 동요와 함께 품 어. 참고: 세제의 종류는 각 단백질 대상18,24에 대 한 최적화가 필요 합니다.</li>
	<li>1 시간에 4 ° C에서 ultracentrifuge에 150000 x g에서 원심. 참고: 다음 단계를 모두 4 ° c.에 수행 됩니다.</li>
	<li>5 mL의 트랩 Ni2 +-NTA 선호도 열 통해 미리 버퍼 (표 1) equilibrated 흐름과 명확한 세포 lysate를 수집 합니다. 참고: 원심, 후 명확한 세포 lysate 것입니다 수에 끼워 넣으면 하단에 펠 릿 및 위에 흐린 층 사이. 10 mL 전송 피펫으로 사용 하 여 신중 하 게 명확한 lysate를 수집 하 고 다음 지난 1 mL 피펫으로 전환할 lysate의 몇 밀리 리터. Ni2 + 열;을 방해할 수 있는 펠 릿을 방지 그러나, 최상위 계층의 작은 금액을 괜 찮 아 요 또는 1.5 μ m 필터 밖으로 필터링 할 수 있습니다.</li>
	<li>세척 후에 버퍼 C의 40 mL는 버퍼 B의 25 mL로 열 (테이블 2 및 3, 각각). 참고:이 휴식을 취하는, 총 정화 12 h까지 걸릴 수 있습니다 그리고 단백질 하룻밤 열에 연결 하는 동안 안정적으로 유지 수 있는 좋은 장소입니다.</li>
	<li>고속 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC) 시스템에 열을 연결 하 고 단백질의 버퍼 D 13 mL와 열에서 (표 3) 분류와 함께 elute. UV 흡수도 판독에 따르면 단백질 농축 분수를 수집 합니다. 참고:: 는 FPLC 조건은 다음과 같습니다: 1.0 mL 분수 크기, 0.3 MPa, 그리고 0.5 mL/min의 유량을 설정 사전 열 압력 경보.</li>
	<li>Microvolume 분 광 광도 계에 eluted 단백질 제품 농도 측정 합니다. 280에서 흡 광도 읽고 nm.</li>
	<li>(선택 사항) GFP 10xHis 태그를 제거 하려면 대량 비율 1:1 TEV 프로 테아 제를 추가 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 품 어. 참고: 태그 되거나 함수 또는 순화 된 채널의 구조에는 영향을 미치지 수 있습니다. 볼륨 및 3.7-3.8 단계에서 수집 된 단백질의 농도에서 TEV 금액을 계산 합니다. 예를 들어, 경우 차입 제품의 10 mL를 수집 하 고 총 단백질 0.1 mg/mL에서 측정 된 질량은 10 x 0.1 = 1 밀리 그램, 그리고 1 mg TEV의 소화에 대 한 사용 됩니다.</li>
	<li>(50 또는 100 kDa) 15 mL를 원심으로 단백질을 집중 (FPLC에 2 mL 샘플 로드 루프)에 대 한 400-500 μ의 최종 볼륨을 4 ° C에서 4000 x g에서 회전에 의해 필터 단위. 참고: 농도 centrifuging 시간 집중력과 단백질의 크기에 따라 다릅니다. -집중을 방지 하는 수 있습니다 단백질 강 수, 처음에 10 분 동안 회전 다음 나머지 볼륨을 관찰 원인과 예상 후속 스핀에 대 한 시간 (예: 2-5 분), 최종 볼륨을 얻을. 피펫으로 필터의 아래쪽을 뽑아 단백질 분산 회전 사이.</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브 집중된 제품에서 어떤 침전 또는 거품 제거 집중된 단백질을 전송 합니다. 에 스핀 &gt; 12000 x g 4 ° C와 수집 새로운 1.5 mL 튜브에 상쾌한에 5-10 분.</li>
	<li>크기-배제 열 버퍼 E (표 5)와 함께 미리 equilibrated 1 mL 주사기와 라운드 팁 바늘 FPLC 시스템에 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 최종 제품을 로드 합니다. 참고:: 는 FPLC 조건은 다음과 같습니다: 0.5 mL 분수 크기, 2.50 mpa 설정 사전 열 압력 경보, 버퍼 E의 30 mL로 설정 흐름 볼륨 (표 5), 0.5 mL/min 흐름 속도 설정.</li>
	<li>Note 품행 단백질 (그림 2A) 단일 피크로 실행 하 고 수집 단백질 fraction(s)에 해당 하는 피크 (그림 2A).</li>
	<li>4 mL 또는 0.5 mL 원심 필터 단위 (3.10 단계 에서처럼 동일한 분자량 컷오프)와 스핀에서 5-10 μ g/μ의 최종 농도에 4 ° C에서 4000 x g 단백질을 집중 한다. 분 광 광도 계를 사용 하 여 최종 제품 농도 (3.8 단계)을 확인 하. 참고: 원심 분리 시간이 다릅니다, 최종 제품 볼륨 정화 실험 사이 다 수 있습니다. 일반적으로, 원심 분리는 10-20 분 걸립니다. 피펫으로 필터의 아래쪽을 뽑아 단백질 분산 회전 사이 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>새로운 1.5 mL 튜브에 집중된 단백질을 전송. centrifuging 여 어떤 침전 제거 &gt; 12000 x g 4 ° c.에 5-10 분 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송. -80 ° C에서 10 μ aliquots 스토리지를 만들고 저장 한 2-5 μ 작은 약 수 9 V/cm (그림 2B)에 4-15% 그라데이션 SDS 페이지 젤에서 실행.</li>
	<li>질량 분석8여 순화 된 단백질의 id를 확인 합니다. 참고: 함수 분석 생체 외에서 그리고 순화 된 단백질의 구조는 평면 지질 bilayer와 엑스레이 결정학, 각각5,8통해 수행할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+bestrophins%3A+multifunctional+membrane+proteins+linked+to+best+disease+and+other+retinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies.</a> Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Tsunenari, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+the+bestrophin+family+of+anion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).</li>
<li>Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+insights+into+the+function+of+a+Ca%282%2B%29-activated+Cl%28-%29+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel.</a> Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Johnson, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28153808">Bestrophin 1 and retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).</li>
<li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Boyce, F. M., Bucher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus-mediated+gene+transfer+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).</li>
<li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).</li>
<li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nature Communications. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> Public Library of Science One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li>
<li>Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+and+cross-linking+mass+spectrometry+%28CX-MS%29+for+structural+elucidation+of+large+protein+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Opinions+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies.</a> Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).</li>
<li>Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+and+development+for+rare+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Medical+Genetics+Part+A%22%5BJournal%5D)">Drug discovery and development for rare genetic disorders.</a> American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 표현과 미래 생체 외에서 분석에 사용할 포유류 bestrophin 이온 채널의 정화에 대 한 유용한 파이프라인을 설명 합니다. FPLC 장치는 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 필요, 주사기 펌프는 친화성 크로마토그래피 바인딩 하 고, 세척, 하 고, 방출 하는 등의 모든 단계에 대 한 충분 한 이다. 푸시 솔루션 (주사기)에 열을 통해 주사기 펌프를 사용할 때는 열에 공기 방울을 밀어 피하기 위해 봄 측면 아래에 배치 필수적 이다. 친화성 크로마토그래피 후 단백질의 순도, 후속 실험에 대 한 충분 한 이미 경우 FPLC 장치 되지 않을 수 있습니다 필요한 모든 있도록 크기 배제 크로마토그래피를 생략할 수 있습니다.
PBacMam 플라스 미드에서 baculoviruses를 만들기 위해 약 2 주 걸립니다, 효율을 품행 단백질 homologs에 대 한 초기 화면 실시 될 수 있습니다 정도 transfected HEK293 세포를 수확 하 여 (예...

Bestrophins은 박테리아에서 인 간에1다양 한 종족을 통해 보존 하는 이온 채널의 가족 이다. 인간에서는, BEST1 유전자, 염색체 11q12.3에 있는 막 단백질 Bestrophin-1 (BEST1) 주로 눈2,3 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 basolateral 막에 표현 되 인코딩 ,4. 585 아미노산의 첫 번째 ~ 350 높은 종 중 보존 하 고는 막 횡단 영역을 포함, 구성 BEST1 인간1,,56CaCC 역할을 합니다. 또한, 닭에 BEST1 homologs와 Klebsiella 균 으로 작동 homopentamers7,8, 진화를 통해 환경 보호의 높은 수준을 제안.
인간에서는, 200 개 이상의 돌연변이 BEST1 유전자에서 임상 bestrophinopathies1,9라는 망막 변성 질환의 그룹에 연결 되었습니다. 5 특정 bestrophinopathies 보고 되었습니다, 등 최고의 질병, 성인-발병 vitelliform 영양 장애, 상 염색체 지배적인 vitreoretinochoroidopathy, 상 염색체 열성 bestrophinopathy, 망막 화3,4 ,,1011,12,,1314. 이러한 질병 감소 시력 및 심지어 실명으로 이어질 현재 치료할 수 없습니다. 치료 트리 트 먼 트 및 잠재적으로 맞춤된 의학을 개발 하기 위하여 어떻게 이러한 BEST1 질병 유발 돌연변이 영향 BEST1 채널15의 구조와 기능 이해에 중대 하다. 이러한 목적을 위해 연구원 순화 bestrophin (와일드 타입이 돌연변이) 채널 시험관에서 분석5,8실시를 해야 합니다.
첫 번째 주요 단계는 포유류 세포에 높은 종에서 bestrophin 채널의 표현 이다. F HEK293 세포 (BacMam 시스템)의 잠재 변환 heterologously 막 단백질16,17를 표현 하는 강력한 방법으로,이 프로토콜의 강력한 표현에는 최적화 된 BacMam 벡터 (pEG BacMam)을 활용 하 여는 이 경우에 포유류 bestrophin 체 단백질18, 대상. 이 벡터는 G-단백질 결합 수용 체, 핵 수용 체, 그리고 다른 이온 채널18를 포함 하 여 다양 한 막 단백질의 표정을 위해 사용 되었습니다. 또한 생산된 단백질 결정학18적합 증거가 있다. HEK293 F 세포에서 식의 높은 수준, 단백질 수 다음 정화 크로마토그래피;를 사용 하 여 특히, bestrophins, 경우 선호도 크기 배제 크로마토그래피 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 bestrophin 채널에 대 한 미세 조정, 일단 순화 된 단백질의 기능 및 평면 지질 bilayer와 엑스레이 결정학, 각각5,8통해 구조에 대 한 다음 분석할 수 있습니다. 이러한 기술을 bestrophins 및 다른 이온 채널의 기능 및 구조 조사에 대 한 강력한 파이프라인을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC327265000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC446212500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC301870010</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC197530010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AA4058704&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AAJ63039MA</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AAJ61188MB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>펩스타틴 A</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AAJ20037MB</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>AC215740050</td><td></td></tr><tr><td>DDM 솔 그레이</td><td>드 아나트레이스</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>DDM 아나</td><td>그레이드 아나트레이스</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher</td><td>10902179</td><td></td></tr><tr><td>프리스타일 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 분광 광도계</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>고압 균질화 장치</td><td>Avestin</td><td>Emulsiflex-C5</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap 컬럼</td><td>GE</td><td>17-5248-01</td><td></td></tr><tr><td>Superdex-200 컬럼</td><td>GE</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Pure</td><td>GE</td><td>29018224</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-15 원심 필터 장치</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-4 원심 필터 장치</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-0.5 원심 필터 장치</td><td>Millipore</td><td>UFC505024</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 프리캐스트 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler,</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet 트랜스펙션 시약</td>, <td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>pEG BacMam 벡터</td><td></td><td></td>, <td>Vollum Institute의 Gouaux 실험실에서 획득</td></tr></tbody></table>

표현과 포유류 bestrophin 이온 채널의 정화

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

인간 게놈 4 bestrophin paralogs를, 즉 BEST1, BEST2, BEST3, 및 BEST4 인코딩합니다. BEST1, BEST1 유전자에 의해 부호화는 캘리포니아2 +-Cl- 채널 (CaCC) 주로 망막 안료 상피 (RPE) 표시를 활성화. BEST1의 생리 및 병 적인 의미 BEST1 유전자에서 200 개 이상의 독특한 돌연변이 최고의 vitelliform 등 적어도 5 망막 퇴행 성 장애의 스펙트럼에 유전자 연결 되었다는 사실에 의해 강조 표시 됩니다. 황 반 영양 장애 (최고의 질병) 따라서, bestrophin 채널을 단일 분자 수준에서의 물리학을 이해 엄청난 의미를 보유 하고있다. 그러나, 순화 된 포유류 이온 채널을 얻는 것은 종종 어려운 작업입니다. 여기, 우리는 BacMam 잠재 유전자 전달 시스템 및 친 화력과 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 정화와 포유류 bestrophin 단백질의 표현에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 순화 된 단백질 지질 bilayers에 결정학 electrophysiological 녹음 등 후속 기능 및 구조 분석에 활용 될 가능성이 있다. 중요 한 것은,이 파이프라인 함수 및 다른 이온 채널의 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

뚜렷이 페 접착제 HEK293 세포 (그림 1A)의 형광 강도 서 스 펜 션 F HEK293 세포 (그림 1B)에 예상된 단백질 표정 수준에 대 한 좋은 지표입니다. 대상 단백질은 잘 표현 또는 과도 transfection 후 HEK293 세포에서 잘못 지역화, 것이 좋습니다 고려 식 구조를 수정 하는 (예., GFP 태그의 위치를 변경 또는 돌연변이/잘림 에 대상 단백질). 작은 HEK293 F 현 탁 액 문화 (예를 들어, 25 mL 문화)는 단백질 표정, 중 감염 나 배양 온도 되었습니다 이전 경험에서 가장 중요 한 조건을 최적화 하는 데 사용 됩니다.
성공적인 정화 단일 주요 피크 크기 배제 크로마토그래피 (<stron...

이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl- 채널을 활성화.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

이 방법은 베스트로핀 계열의 이온 채널을 포함하되 이에 국한되지 않는 포유류 이온 채널의 생물물리학과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다른 유형의 이온 채널에 적용할 수 있고 다양한 다운스트림 체외 분석을 위한 핵심 산물을 생성할 수 있다는 것입니다. 정제된 단백질을 사용하는 분석법은 베스트로핀 채널이 망막에서 어떻게 작용하는지, 그리고 BEST1 유전자의 돌연변이가 어떻게 황반변성을 유발하는지에 대한 지식에 기여하기 때문에 이 기술의 의미는 베스트로피노병증 치료로 확장됩니다.바이러스 감염 24시간 전에 15마이크로리터의 HEK293F세포 배양 분취액에 동일한 부피의 트리판 블루를 첨가하고 현미경으로 혈구계를 사용하여 세포 밀도와 생존율을 확인합니다. 세포 계수를 수행한 후, 일회용 2리터 플라스크 2개 각각에 500ml 부피의 10배10배의 6번째 세포를 플레이트합니다. 플라스크를 이산화탄소 8%가 함유된 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 넣습니다.궤도 플랫폼에서 배양물을 135rpm으로 회전합니다. 감염 당일에는 이전과 같이 배양액의 15마이크로리터 분취액의 세포 밀도와 생존력을 확인합니다. 95% 이상의 높은 세포 생존율은 효율적인 감염 및 단백질 발현에 필수적입니다.예상 셀 밀도는 밀리리터당 6번째 셀의 약 10 곱하기 이고, 예상되는 총 셀 수는 10의 9 곱하기 약 1입니다. P3 바큘로바이러스(P3 Baculovirus)를 5의 감염 배수로 세포에 추가합니다. 접종할 바이러스의 양을 결정하려면 화면에 표시된 방정식을 사용하십시오.그런 다음 접종된 세포를 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, 각 세포 배양액에 최종 농도 10밀리몰까지 부티레이트나트륨을 첨가하고 48시간 동안 섭씨 37도 또는 섭씨 30도로 설정된 인큐베이터로 돌아갑니다. 48시간 후, 형광 현미경으로 단백질을 직접 나타내는 녹색 세포의 비율과 밝기를 확인합니다.1, 20 분 동안 4 섭씨 온도에 g 원심분리해서 세포를 가을걷는다. 상층액을 제거하고 인산염 완충 식염수로 세포 펠릿을 약 80ml의 최종 부피로 재현탁합니다. 2개의 50 밀리리터 원뿔 관 및 분리기 사이에서 각 세포 현탁액을 1개, 000배 g 및 4 섭씨 온도에 20 분 동안 나누십시오.단백질 정제 절차를 시작하려면 먼저 실온의 교반 수조에서 세포 펠릿을 해동합니다. 펠릿이 10-15분 후에 해동되면 proteinase

expression-and-purification-of-mammalian-bestrophin-ion-channels

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

에 낭성 섬유증의 transmembrane의 전도성 조정기 (CFTR)를 표현하는...

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

지질 세포막에 프로토 타입 전압 문이 칼륨 채널의 완전한 재구성에 대한 절차를 설명합니다. 재구성 채널은 생화학 적 분석, 전기 녹음, 리간​​드 스크리닝 및 전자 결정학 연구에 적합합니다. 이러한 방법은 다른 막 단백질의 구조 및 기능 연구에 일반적으로 응용 프로그램이있을 수 있습니다.

구조 및 기능 연구를위한 지질 막에 Kv 값 채널의 재구성

biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

여기서 설명하는 낭포 성 섬유증에 결함이 클로라이드 채널에 대한 활성을 유지 정제 야생형 및 돌연변이 CFTR 단백질의 기능적 재구성을위한 신속하고 효율적인 절차이다. CFTR 의해 매개 재구성 테오에서 요오드화 유출 채널 활성의 연구 및 작은 분자의 효과를 허용한다.

정제 된 야생형과 돌연변이 체 CFTR 단백질의 기능의 재구성 및 채널 활동 측정

이것은 분비된 당화(glycosylated mammalian protein)의 생산 및 X선 결정학 및 기타 생물물리학 연구를 위한 균질한 단백질의 충분한 수율을 가진 후속 1단계 정제를 위한 빠르고 비용 효율적인 프로토콜입니다.

효율적인 포유 동물 세포 발현 및 결정화에 대한 세포 외 당 단백질의 단일 단계 정화

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

이 프로토콜 cryo 전자 현미경 검사 법, 효율적으로 최소한의 노력 및 독성, 단백질 추출, 정화, 포유류 세포에 있는 유전자를 표현 하는 데 사용 되는 잠재 시스템을 포함 하 여 이온 채널 구조를 결정 하는 데 사용 하는 기법을 설명 합니다. 그리고 품질 검사, 샘플 그리드 준비 및 심사, 뿐만 아니라 데이터 수집 및 처리.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

여기 우리가 제시 익스프레스, solubilize, 누 룩을 사용 하 여 SLC4 운송업 자 가족에 상 동으로 여러 진 핵 borate 전송기를 정화 하는 프로토콜. 우리는 또한 multimeric 어셈블리에 대 한 정화 homomeric 단백질을 평가 하기 위해 화학 가교 분석 결과 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 다른 도전 막 단백질에 대 한 적용할 수 있습니다.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

인간 막 수송체의 구조 및 생화학적 연구에는 밀리그램 단위의 안정적이고 온전하며 균질한 단백질이 필요합니다. 여기서는 코돈 최적화 유전자를 사용하여 인간 용질 운반체 수송체를 스크리닝, 발현 및 정제하는 확장 가능한 방법을 설명합니다.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

배우세요 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화 방법을 HEK293F 세포에서 발현하고 니켈 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피로 분리하는 기술입니다. 이 방법은 망막 질환 연구와 이온 채널 생물물리학 연구에 활용됩니다.

표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화

더 많은 동영상 탐색