Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

이 방법은 저산소 조건에서 전사 인자와 전사 공동 조절자 사이의 내인성 및 고유 상호 작용과 같은 저산소 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저산소 세포가 저산소 조건에서 수확되고 핵 분획이 동시 면역침전에 사용된다는 것입니다. 이 프로토콜은 4개의 10cm 접시에서 자란 인간 배아 신장 293A 세포를 사용합니다.

10%FBS, L-글루타민, 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 10밀리리터의 둘베코의 변형된 독수리 배지에 접시당 10-6번째 세포를 3-5배 파종합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 파종 후 24 시간 후 세포가 80-90 % 포화도에 도달하면 4 시간 동안 섭씨 37도에서 1 % 산소와 5 % 이산화탄소가 함유 된 인큐베이터 글로브 박스의 저산소증 하위 챔버에 두 개의 접시를 넣습니다.

다른 두 요리는 노목시아에 보관하십시오. 저산소증 처리된 세포를 수확하기 전날, DPBS로 채워진 덮개가 없는 100ml 실험용 유리 시약 병을 저산소증 챔버에 24시간 동안 놓아 DPBS를 저산소 상태로 사전 평형화합니다. 세포를 채취하기 약 1시간 전에 얼음이 들어있는 아이스박스를 산소 1%와 이산화탄소 5%로 평형을 이룬 글로브박스의 처리실에 넣습니다.

사전 평형화된 저산소성 DPBS가 들어 있는 병을 저산소증 하위 챔버에서 처리 챔버로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 저산소증 처리 다음 4 시간, 저산소증 하위 챔버에서 1% 산소 및 5% 이산화탄소로 사전 평형화된 처리 챔버로 세포를 이동합니다. 흡인에 의해 배양 배지를 제거하고 10ml 피펫으로 10ml의 얼음처럼 차가운 사전 평형 저산소 DPBS로 세포를 한 번 헹굽니다.

5ml 피펫을 사용하여 5ml의 얼음처럼 차가운 사전 평형 DPBS를 추가하고 셀 스크레이퍼로 긁어 셀을 제거합니다. 세포 배양 플레이트를 기울이고 10ml 피펫을 사용하여 분리된 세포를 수집한 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.

글로브 박스의 처리 챔버와 완충 챔버 사이의 문을 열며, 둘 다 1% 산소와 5% 이산화탄소로 사전 평형을 이룹니다. 저산소증 처리된 세포가 들어 있는 얼음 위의 15ml 원뿔형 튜브를 처리 챔버에서 버퍼 챔버로 옮깁니다. 버퍼 챔버의 도어를 열고 글로브 박스에서 셀을 완전히 제거합니다.

저산소 세포와 정상 산소 세포를 모두 섭씨 4도에서 5분 동안 1000배 g의 원심분리로 펠렛화합니다. 이 절차에는 핵 추출 키트가 사용됩니다. 먼저 500마이크로리터의 용해 완충액 NL에 각 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시키고, 위아래로 여러 차례 피펫팅하여 0.1몰 DTT에 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 보충합니다.

25마이크로리터의 세제 용액 NP를 최대 속도로 10초 동안 셀 현탁액과 와류에 추가합니다. 1000 곱하기 10g의 원심 분리기, 섭씨 4도에서 5 분 동안 원심 분리기. 상등액과 핵 펠릿을 모두 저장하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 상등액을 수집 및 저장한 후, 펠릿 함유 세포핵을 500마이크로리터의 용해 완충액 NL에 재현탁하고, 최대 속도로 5초 동안 볼텍싱하여 1X 프로테아제 억제제 칵테일 및 0.1몰 DTT를 보충합니다. 50마이크로리터의 추출 완충액 NX1에 핵 펠릿을 재현탁시키고, 펠릿을 위아래로 여러 차례 피펫팅하여 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 보충합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

5분마다 최대 속도로 10초 동안 소용돌이칩니다. 12, 000 x g에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리기. 상층액을 모아 탈염을 위해 장치당 최대 부피가 100마이크로리터인 미니 투석 장치로 옮깁니다.

미니 투석 장치의 뚜껑을 닫고 부양 장치에 넣습니다. 부양 장치를 500ml의 사전 냉각 투석 버퍼가 들어 있는 비커에 넣습니다. PMSF가 포함되어 있으므로 피부에 직접 접촉하거나 투석 완충액을 흡입하지 않도록 주의하십시오.

섭씨 4도에서 30분 동안 부드럽게 저어주면서 배양합니다. 30분 후, 미니 투석 장치 모서리에서 검체를 채취하여 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 12,000 번 g으로 10 분 동안 원심 분리기.

각 상등액 25마이크로리터를 1.5마이크로리터 원심분리기 튜브에 분취하고 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 면역 편찬에 사용할 단백질 AG sepharose bead를 준비합니다. 4개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브 각각에 50마이크로리터의 비드를 피펫팅하고 튜브당 500마이크로리터의 DPBS 버퍼를 추가합니다.

원심분리로 비드를 펠렛화합니다. 상등액을 버리고 비드를 100마이크로리터의 TBS 완충액에 다시 현탁시킵니다. 500마이크로리터의 TBS 완충액에 0.7mg의 마우스 IgG를 재구성하여 제조한 2마이크로리터의 마우스 단클론 항-ARNT 항체 또는 마우스 면역글로불린 G를 추가합니다.

비드가 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 차가운 방으로 가져갑니다. 튜브 로테이터에 넣고 10rpm으로 2시간 동안 배양합니다. 2 시간 후에, 분리기 분리에 의하여 구슬을 펠릿 하고 상등액을 버리십시오.

800마이크로리터의 면역침전 완충액에서 이전에 준비된 핵 단백질 용해물 200마이크로그램을 희석합니다. 하룻밤 동안 항체 결합 비드와 함께 용해물을 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음 날에, 3000 번 g의 원심 분리에 의해 구슬을 4 섭씨 온도에서 2 분 동안 펠릿화합니다.

상등액을 버리십시오. 각 튜브에 0.2%NP-40을 함유한 얼음처럼 차가운 TBS 1ml를 넣고 스핀다운합니다. 이런 식으로 0.2%NP-40을 함유한 얼음처럼 차가운 TBS로 비드를 세 번 세척합니다.

50마이크로리터의 Laemmli 샘플 버퍼에 비드를 넣고 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다. 구슬을 섭씨 4도에서 10,000 번 g으로 5 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 모으고 구슬을 버립니다.

저산소증 치료 후 HIF-1 복합체 구성 요소의 세포 내 국소화에서의 발현 수준을 HEK293A 세포에서 검사했습니다. 예상한 대로, 총 HIF-1a 수치는 저산소증에 의해 상향 조절된 반면, 총 세포 용해물의 ARNT 수치는 유의하게 변화하지 않았습니다. 또한, 저산소증은 HIF-1a와 ARNT의 핵 축적을 유도했습니다.

공동 면역침전 실험은 정상 산소 또는 저산소 조건에 노출된 HEK293A 세포의 핵 추출물을 사용하여 수행되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, HIF-1a는 저산소 HEK293A 세포의 핵 추출물에서 ARNT와 함께 동시 면역침전되었으며, 이는 HIF-1a가 저산소 조건에서 ARNT와 상호 작용함을 나타냅니다. 개발 후 이 기술은 저산소증 분야의 연구자들이 내인성 핵 단백질 단백질 상호 작용과 저산소 상태를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.