Name: Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 학습하세요 저산소 상태에서 HEK293A 세포의 핵 단백질 상호작용을 공동 면역침전법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 전사인자와 보조조절인자의 상호작용 연구에 활용됩니다.

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우리는 hypoxia 워크스테이션의 사용에 대 한 assoc. 교수 죄 Tiong 옹 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 지원 되었다: 싱가포르의 교육부, 모 1T1-02/04 MOE2015-t 2-2-087 (Y.A.)를, 의학, 난 양 기술 대학 시작 하기 위해 그랜트를 M4230003 (P.O.B.)의 리 홍콩 Chian 학교 스웨덴 연구 위원회는 가족 Erling 페르손 재단, Novo Nordisk 기초, Stichting af Jochnick 재단, 스웨덴 당뇨병 협회, Scandia 보험 회사, 당뇨병 연구와 복지 재단, 정박 폰 Kantzow의 기초는 카롤 린스 카 Institutet, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단에서 당뇨병에 전략적 연구 프로그램.

인간 미 발달 신장 293A를 사용 하 여이 프로토콜 섹션 (HEK293A) 셀 s 난 양 기술 대학교, 싱가포르에서 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1입니다. HEK293A 세포에서 산소의 유도
<ol><li>준비 4 10 cm 요리와 씨 3-5 Dulbecco의 수정 보충 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 2 m L-글루타민, m이 글의 중간 (DMEM, 4.5 g/L 포도 당) 10 mL에 접시 당 106 HEK293A 셀 x 110 mg/L 나트륨 pyruvate, 100 U/mL 페니실린 및 100 mg / mL 스입니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 세포 문화. 참고: 셀 시드 실행 되어야 한다 밖으로 생물 안전 캐비닛 (BSC)에. BSC에 배치 하는 모든 자료의 표면 70% 에탄올으로 닦아 해야 합니다.</li>
	<li>시드, 후 24 h 세포 80-90 %confluency 도달 했습니다 때 넣어 두 요리 인큐베이터 글러브에서 hypoxia subchamber ( 재료의 표참조) 1% O2 와 37 ° C, 및 계속 다른 두 normoxia (21 %O 요리 5% CO2 2, 5% CO2 37 ° C에서) 4 헤를 사용 하 여 1 세트의 normoxic와 hypoxic 셀 서쪽 오 점 하 여 저 산소 증 치료를 평가 하 고 공동-immunoprecipitation 실험에 대 한 셀의 다른 세트를 활용. 참고: 산소 수준을 설정할 수 있습니다 0-5%, 산소 치료의 기간 셀 유형에 따라 변화 될 수 있고 목표를 공부.</li>
</ol>2. 전체 셀 및 핵 추출
참고:이 프로토콜에 사용 되는 버퍼에 대 한 내용은 표 1 을 참조 하십시오.
<ol><li>
Normoxia 제어 셀을 수확.
	<ol>
<li>포부에 의해 문화 미디어를 제거 하 고 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) 셀 린스 10 mL 피 펫을 사용 하 여. 참고: 피펫으로와 셀 단층을 만지지 마십시오. 세척, 동안 세포 손실을 방지 하기 위해 셀 문화 판의 벽 아래로 DPBS 플라스틱 부드럽게.</li>
		<li>5 mL를 플라스틱 접시에 얼음 처럼 차가운 DPBS 셀 스 크레이 퍼와 얼음 처럼 차가운 PBS에 격판덮개의 표면에서 세포를 다쳤어요.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 얼음에 계속.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포를 수확.
	<ol>
<li>미리 사전에 24 h는 발견된 100 mL 실험 유리 시 약 병으로 가득 DPBS hypoxia subchamber (1% O2 와 37 ° C에서 5% CO2 )에 배치 하 여 hypoxic 조건 DPBS equilibrate.</li>
		<li>저 산소 증 치료 세포를 수확 전에 약 1 h 1% O2 , 5% CO2equilibrated 되었습니다 글러브의 처리 챔버로 얼음을 포함 하는 얼음 상자를 놓습니다. 포함 하는 처리 챔버에 산소 subchamber에서 미리 equilibrated hypoxic DPBS 병을 전송 하 고 얼음에 두십시오.</li>
		<li>저 산소 증 치료, 다음 4 h 1% O2 , 5% CO2미리 equilibrated 되었습니다 처리 챔버 hypoxia subchamber에서 셀 전송.</li>
		<li>포부에 의해 문화 미디어를 제거 하 고 10 mL와 10 mL와 함께 차가운 미리 equilibrated hypoxic DPBS 플라스틱 일단 셀 린스.</li>
		<li>5 mL와 함께 차가운 미리 equilibrated DPBS 플라스틱 및 셀 스 크레이 퍼와 된다고 하 여 세포를 꺼내 5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>세포 배양 접시를 기울기 고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 된 세포를 수집 합니다. 15 mL 원뿔 튜브로 DPBS에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 얼음에 계속.</li>
		<li>처리 및 버퍼 챔버는 글러브의 둘 다 1% o 2와 5% CO2미리 equilibrated 되었습니다 사이 문을 엽니다. 버퍼 실로 처리 실에서 산소 치료 세포를 포함 하는 얼음에 15 mL 원뿔 튜브를 전송 합니다. 버퍼 챔버의 문을 열고는 글러브에서 세포를 완전히 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.1에서 normoxic 세포와 2.2에서 hypoxic 세포 모두에서 1000 x g 4 ° c.에서 5 분 동안 원심 분리 하 여 펠 렛</li>
	<li>
추출 물에서 전체 셀을 준비 합니다.
	<ol>
<li>Resuspend 얼음 라디오 immunoprecipitation (RIPA)의 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 50mm Trisaminomethane 염 산 염 (Tris HCl) pH 8.0, 150 m m 염화 나트륨 (NaCl), 1 %tergitol 형 NP-40 (NP-40), 0.5% 나트륨 deoxycholate, 포함 된의 500 µ L에서 셀 펠 릿 및 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1 보충 ( 재료의 표참조) 몇 번 위아래로 셀 펠 릿 pipetting으로.</li>
		<li>새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 세포 lysates 전송 및 가끔 vortexing와 함께 30 분 동안 얼음에 계속.</li>
		<li>13000 x g 4 ° c.에서 10 분 동안에 세포 lysates 원심</li>
		<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브는 상쾌한의는 표면에 뜨는, aliquot 50 µ L를 수집 하 고-80 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
핵 적 출을 사용 하 여 핵 추출 준비 키트 (재료의 표 참조).
	<ol>
<li>부드럽게 위아래로 여러 번 셀 펠 릿 pipetting으로 세포의 용 해 버퍼 NL 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 0.1 m M dithiothreitol (DTT) x 1와 보충의 500 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>세포 현 탁 액 및 10에 대 한 소용돌이에 세제 솔루션 NP의 25 µ L를 추가 최대 속도에서 s.</li>
		<li>4 ° c.에서 5 분 동안 10000 x g 에서 원심 분리기</li>
		<li>상쾌한 (세포질 추출 물), 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 상쾌한의 aliquot 50 µ L를 수집 하 고-80 ° c.에 저장</li>
		<li>세포 세포의 용 해 버퍼 NL 5 vortexing에 의해 프로 테아 제 억제 물 칵테일 및 0.1 M DTT x 1와 보완의 500 µ L에 핵을 포함 하는 펠 릿 resuspend 최대 속도에서 s.</li>
		<li>4 ° C에서 5 분 동안 10000 x g 에서 centrifuge 고 핵 펠 릿을 저장 합니다.</li>
		<li>추출 버퍼 NX1 pipetting 여러 번 왔다 갔다 펠 릿에 의해 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1와 보충의 50 µ L에서 핵 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>얼음에 30 분, 10 vortexing 품 어 s 최대 속도로 5 분 마다.</li>
		<li>4 ° c.에서 10 분 동안 12000 x g 에서 원심 분리기</li>
	</ol>
</li>
	<li>
핵 추출 desalt
	<ol>
<li>단위 당 100 µ L의 최대 볼륨 미니 투 석 장치에는 상쾌한 단계 2.5.9 및 전송에서 수집 합니다.</li>
		<li>미니 투 석 장치 모자 하 고 부양 장치에 그들을 배치.</li>
		<li>미리 냉장된 투 버퍼 (20 mM Tris HCl pH 7.4, 20% 글리세롤, 100 m m 염화 칼륨 (KCl), 0.2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.2 m m phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF) 및 0.5 mM DTT)의 500 mL를 포함 하는 비 커에 부양 장치를 넣어 그리고 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 30 분 동안 품 어. 주의: PMSF 위험입니다. 흡입 또는 피부와 직접 접촉을 하지 마십시오.</li>
		<li>미니 투 석 장치의 코너에서 샘플을 수집 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송.</li>
		<li>4 ° C, 1.5 mL microcentrifuge 관으로 각 상쾌한의 aliquot 25 µ L에서 10 분 동안 12000 x g 에서 centrifuge 그리고-80 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 단백질 표정 및 HIF 1α의 Subcellular 지 방화의 탐지에 의해 산소 치료의 평가
<ol><li>전체 셀의 단백질 농도 결정 또는 핵/세포질 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 실험 키트 제조 업체의 지침18따라 microplate 분석 결과 사용 하 여 추출.</li>
	<li>1 x Laemmli 샘플 버퍼 5 %2-Mercaptoethanol을 포함 하는 세포 lysates 희석 하 고 5 분 동안 95 ° C에 종 기. 주의: 화상을 일으킬 수 있습니다 이후 난방 블록의 표면을 만지지 마십시오.</li>
	<li>
나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 하 여 단백질을 분리 합니다.
	<ol>
<li>분자량 마커의 3 µ L 함께 SDS 페이지 캐스트 그라데이션 젤 (4-20%)의 각 음에 동일한 양의 단백질 (25 µ g)를 로드 합니다.</li>
		<li>2.5 m m 0.01 %SDS, 19.2 m m 글리신, 트리 스 PH8.3 200 V에서 30 분을 포함 하는 버퍼를 실행에 젤을 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤에서 단백질을 니트로 막에 전송 합니다.
	<ol>
<li>양극 측에는 카세트의 음극 쪽에 막 젤으로 전송 샌드위치 (필터 종이-젤-멤브레인-필터 종이)를 조립.</li>
		<li>2.5 m m trisaminomethane (트리 스), 19.2 m m 글리신과 20% 메탄올을 포함 하는 전송 버퍼가 가득 전송 탱크에 카세트를 넣습니다. 주의: 메탄올 가연성 이며 가연성 액체 스토리지 캐비닛 내부 저장 한다.</li>
		<li>추운 방에 100 V에 1 시간에 대 한 전송을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>50 mM Tris-Cl (pH 7.6) 150 mM NaCl, 0.1 트윈 20, 5% 비-지방 우유 통에 실 온에서 1 h 포함 된 10 mL 차단 버퍼에 오를 차단 합니다.</li>
	<li>안티-HIF-1α 항 체 (1/500 희석) 4 ° c.에 하룻밤 같은 블로킹 버퍼에 함께 오를 품 어</li>
	<li>워시 50ml TBS. 각 시간 3 시간 5 분 동안 오</li>
	<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 오 품 어-실 온에서 1 h 10 mL TBS T 포함 5% 비 지방 건조 우유에 활용 된 이차 항 체 (1/1000 희석).</li>
	<li>워시 50ml TBS. 각 시간 3 시간 5 분 동안 오</li>
	<li>믹스 500 µ L 각 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 소용돌이 짧게 향상 된 chemilumescent (ECL) 시 약 A와 B의.</li>
	<li>오 점 ECL 기판 적용 하 고 실 온에서 1 분 동안 품 어.</li>
	<li>
전 하 결합 소자 (CCD) 카메라 기반 이미징 시스템을 사용 하 여 chemiluminescent 신호를 캡처.
	<ol>
<li>티슈 페이퍼와 막의 가장자리를 만져 초과 ECL 기판 배수와 시트 보호 대에 막 배치.</li>
		<li>카메라 기반 이미징 시스템은 CCD의 샘플 트레이에 멤브레인을 놓습니다.</li>
		<li>이미지 프로세싱 소프트웨어를 실행 ( 재료의 표참조) 다음 설정 사용 하 여 이미지 캡처: → 새로운 프로토콜 → 채널 → 프로토콜 설정 → 젤 영상 파일 (응용 프로그램: 화학; 이미지 영역: 생물 라 드 준비 젤; 이미지 노출: 소프트웨어 강렬한 밴드에 대 한 노출 시간을 최적화 자동으로 됩니다) → 실행 프로토콜 참고: 노출 시간 최적의 이미지를 달성 하기 위해 수동으로 설정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunoprecipitation 및 Immunoprecipitated 단백질의 검출
<ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브에 TBS 버퍼의 500 µ L에서 단백질 A/G sepharose 구슬의 50 µ L를 세척 하 고 작은 공의 구슬 4 ° c.에 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 TBS 버퍼의 100 µ L에 구슬 resuspend.</li>
	<li>마우스 안티 ARNT 단일 클로 널 항 체 (1.4 mg/mL) 또는 마우스 500 µ L TBS 버퍼에 0.7 mg 마우스 IgG를 재구성 하 여 준비 된 면역 글로불린 G (IgG) (1.4 mg/mL)의 2 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>튜브 회전에서 구슬 포함 1.5 mL microcentrifuge 튜브 놓고 추운 방에 10 rpm에서 2 h에 품 어. 참고: 튜브를 부드럽게 처리 하 고 튜브의 하단에 비즈를 포함 하는 정지를 유지.</li>
	<li>4 ° C에서 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 구슬을 펠 렛 하 고는 supernatants 삭제.</li>
	<li>50 mM Tris HCl (pH 7.4), 180 m m NaCl, 20% 글리세롤, 0.2 %NP-40 및 1 x 프로 테아 제 억제 물 칵테일 구성 된 IP 버퍼의 단계 2.6.5에 800 µ L에서 얻은 핵 단백질 lysate의 200 µ g을 희석. 4.5 하룻밤 4 ° c.에 단계에서 얻은 항 체 결합 구슬과 lysate 품 어</li>
	<li>작은 공의 구슬 4 ° C에서 2 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리 하 여, 삭제는 supernatants 및 세척 3 번 1 mL와 구슬 0.2%를 포함 하는 얼음 처럼 차가운 TBS NP-40.</li>
	<li>5 분 동안 95 ° C에서 50 µ L Laemmli 샘플 버퍼에 비즈를 끓인 다.</li>
	<li>10000 x g 4 ° C에서 5 분 동안에 구슬 원심, 상쾌한, 수집 하 고 구슬 삭제. 참고:는 상쾌한 저장할 수 있습니다 짧은 기간에 대 한 또는-20 ° C에 4 ° C에서 긴 기간에 대 한.</li>
	<li>서쪽 오 점 이전 단계 3.3 이후에서 설명한에 의해 immunoprecipitated 단백질 복합물에서 HIF 1α의 존재를 감지 합니다. 참고: 단백질 부 량이이 단계에 대 한 필요 하지 않습니다. SDS 페이지 캐스트 그라데이션 젤 (4-20%)의 각 음에 각 샘플의 상쾌한의 전체 볼륨 (50 µ L) 로드</li>
</ol>

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<li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma%3A+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li>
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<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

HIF 1 복잡 한 세포 산소 항상성의 마스터 레 귤 레이 터 이며 hypoxia 다른 세포질 적응 응답에 관련 된 유전자의 과다를 조절 합니다. 소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 hypoxic 신호 변환의 이해를 위해 중요 하다. Co immunoprecipitation 실험 세포 신호 변환 통로 윤곽을 그리 다 PPIs 연구 일반적으로 사용 됩니다. 그러나, 단백질 overexpression 여전히 널리 사용 되 고이 실험 부작용으로 이어질 수 있습니다. 또한, HIF 1α 매우 불안정 한 단백질 이며 그것은 다시 산소11동안에 급속 하 게 저하 된다. 또한, hypoxia 대부분 포유류 세포 라인 구성 요소 HIF 1의 핵 전 좌를 트리거합니다. 따라서, 기존의 공동-immunoprecipitation 프로토콜 산소 치료 다음과 순수 관련 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별을 위해 최적화 해야 합니다. 여기, 우리는 hypoxia에서 HIF 1α와 ARNT 간의 상호 작용을...

Hypoxia는 부적당 한 산소 세포와 신체의 조직에 제공 될 때 발생 합니다. 그것은 줄기 세포 분화, 염증 및 암1,2등 다양 한 생리 및 병리학 프로세스에서 중요 한 역할을 한다. 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 (HIFs) heterodimers는 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위와 constitutively 표현된 β 소 단위 라고도 ARNT3의 구성으로 작동 합니다. HIF α 소 단위 (HIF 1α, HIF 2α 및 HIF 3α) 및 3 개의 HIF β 소 단위 (ARNT/HIF-1β, ARNT2 및 ARNT3)의 3 개의 isoforms 날짜 확인 되었습니다. HIF 1α 및 ARNT는 표현 편 반면 HIF 2α, HIF-3α, ARNT2 및 ARNT3는 더 제한 된 표현 패턴4. 복잡 한 HIF 1 단백질은 저 산소 증 응답의 키 레 귤 레이 터 이다. Hypoxic 조건 하에서 HIF 1α 안정 된다, 핵에 translocates 그리고 ARNT5dimerizes. 그 후,이 복잡 한 저 산소 증 응답 성분 (HREs)으로 알려진 특정 뉴클레오티드를 한다 신생, 적혈구 및 분해6을 포함 하 여 다양 한 프로세스에 관련 된 타겟 유전자의 표현을 규제. 이 "정식" 응답 뿐만 아니라 hypoxia 신호 통로 또한 알려져 누화를 노치 등 핵 인자-카파 B (NF κB) 통로 신호 하는 여러 세포 응답7,8,9.
소설 HIF 1 상호 작용 단백질의 식별 통로 신호 하는 산소의 더 나은 이해를 위해 중요 하다. ARNT 산소 수준에 둔감 하 고 constitutively 표현 되는 달리 HIF 1α 단백질 수준 세포 산소 수준에 의해 밀접 하 게 통제 된다. Normoxia (21% 산소), HIF 1α 단백질은 빠르게 저하10,11. Normoxia에서 HIF 1α의 짧은 반감기에는 HIF 1α 상호 작용 단백질의 식별을 위해 뿐만 아니라 셀 추출에서 단백질의 검출에 대 한 특정 기술적인 도전을 선물 한다. 또한, 여러 전사 인자 HIF 1 단지 포함 한 hypoxic 조건12,13,14에서 핵으로 이동. PPI 연구에 사용 되는 현재 방법의 대부분은 단백질의 생리 적 비 overexpression를 사용 하 여 수행 됩니다. 이러한 단백질 overexpression 리소스 오버 로드, 화학 량 론 불균형, 무차별 상호 작용 및 통로 변조15,16를 포함 하 여 여러 메커니즘을 통해 다른 세포 결함을 일으킬 수 보고 되었습니다. PPI 연구에서 단백질 overexpression 거짓 긍정적인, 또는 심지어 거짓 부정, 단백질 속성과 overexpressed 단백질의 기능에 따라 결과 발생할 수 있습니다. 따라서, PPI 연구에 대 한 현재 메서드 hypoxic 조건 하에서 순수 관련 PPIs를 공개 하기 위해 수정할 수 있다. 우리는 이전 HIF 1 Ets 가족 녹음 방송 요인 조지아-의무적인 단백질 (GABP) hypoxic P19 셀에서 hypoxia17 Hes1 발기인의 반응에 기여 하는 상호 작용을 시연 했다. 여기, 우리는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 PPIs를 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜을 설명 합니다. HIF 1α ARNT의 상호작용 개념의 증거로 서 표시 됩니다. 이 프로토콜은 hypoxic 조건 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용을 보여주는 적합 하지에 국한 HIF 1 상호 작용 단백질의 id.

<table><tbody><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4&nbsp;</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A/G 세파로스 비드</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>천연 마우스 IgG 단백질</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인 &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 등급 차단제</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>웨스턴 블로팅 애플리케이션을 위한 비지방 건조 우유</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL 시약</td><td>Cell Signaling</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 beta 항체&nbsp;</td><td>노부스 바이오로직스</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>농도 : 1.4 mg / mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alpha 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>농도: 1.0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 항체</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>농도: 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome 핵 단백질 키트</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>용해 버퍼 NL 및 추출 버퍼 NX1은 키트에서 제공됩니다</td></tr><tr><td>GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>농도: 0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>글리세롤 (&ge; 99%)</td><td>: 시그마</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨, <td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr>, <tr><td>RIPA 완충액</td>, <td>시그마</td><td>R0278</td><td></td></tr>, <tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마</td><td>71376</td><td></td></tr>, <tr><td>NP-40</td>, <td>시그마</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr>, <tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' </td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A 세포주</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>메탄올&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 프로테아제 억제제 정제&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP 젤 로딩 팁&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Equipment/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; 미니 프리캐스트 젤용 테트라 수직 전기영동 셀, 미니 트랜스-블롯 포함&nbsp; 모듈 및 PowerPac 기본 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>장갑</td><td>BioSpherix</td><td>장갑</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX 다중 모드 마이크로플레이트 리더&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL 스트라이프 혈청학 피펫</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL 스트라이프 혈청학 피펫</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL 스트라이프 혈청학 피펫</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Clear Bottom Black 폴리스티렌 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL High Clarity PP 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>소형 셀 스크래퍼</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Pipetman L 4-피펫 키트&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 및 액세서리</td></tr><tr><td>1.5mL 폴리프로필렌 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 피펫터</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite 가연성 액체 보관 캐비닛</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커</td><td>스튜어트</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>튜브 로테이터 SB3</td><td>스튜어트</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R 마이크로 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 원심분리기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0.1 mL</td></tr><tr><td>플로트 부표 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE 디지털 건식 수조 히터</td><td>Thermo Fisher 사이언티픽</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>써모 사이언티픽&nbsp; 1300 시리즈 A2 Class II, Type A2 바이오 안전 작업대</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

낮은 산소 수준 (hypoxia) 저 산소 증 유도할 수 있는 요인 1 (HIF 1) 복잡 한 마스터 레 귤 레이 터 역할 적응 응답의 다양 한 트리거. HIF 1는 heterodimeric 산소 레 귤 레이트 된 α 소 단위 (HIF-1α)의 구성 및 constitutively β 소 단위 (HIF-1β)로 알려진 aryl 탄화수소 수용 체 핵 translocator (ARNT), 신생을 포함 한 다양 한 프로세스에 관련 된 유전자 조절 표현 적혈구 및 분해. HIF 1 상호 작용 단백질의 id 신호 전달 경로 hypoxia의 이해에 열쇠 이다. HIF 1α 안정성의 규제 외 hypoxia 또한 ARNT HIF 1α 등 많은 녹음 방송 요인의 핵 전 좌를 트리거합니다. 특히, 같은 단백질 단백질 상호 작용 (PPIs)를 공부 하는 데 사용 하는 현재 방법의 대부분은 단백질 overexpression 통해 단백질 레벨은 인위적으로 증가 하는 시스템 기반으로 합니다. 종종 단백질 overexpression 시간적, 공간적 유물에서 발생 하는 비 생리 적 결과를 리드. 여기 우리가 설명 하는 수정 된 co immunoprecipitation 생 핵 단백질를 사용 하 여 저 산소 증 치료 하 고 개념, HIF 1α와 ARNT 간의 상호 작용을 보여 증명 프로토콜. 이 프로토콜에 hypoxic 세포 hypoxic 조건 하에서 수확 했다 및 Dulbecco의 Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS) 워시 버퍼는 또한 복잡 한 단백질 또는 단백질 저하를 완화 하기 위해 사용 하기 전에 hypoxic 조건에 미리 equilibrated reoxygenation 중 분리입니다. 또한, 핵 분수 이후에 집중 하 고 내 생 핵 단백질 안정화 고 단백질 overexpression 동안 자주 본 가짜 결과 방지 추출 되었다. 이 프로토콜은 녹음 방송 요인과 hypoxic 조건 transcriptional 공동 레 귤 레이 터 간의 내 인 성 및 기본 상호 작용을 보여 주기 위해 사용할 수 있습니다.

Hypoxia, 식에 세포질 응답을 평가 하는 수준 및 HIF 1 복잡 한 다음 산소 치료의 구성 요소의 subcellular 지 방화 시험 되었다. HEK293A 셀 4 h hypoxic 조건 하에서 경작 또는 normoxia 컨트롤로 유지. HIF 1α 및 ARNT 단백질 수준 전체 셀에 시험 되었다 또는 서쪽 오 점 여 핵/세포질 추출. 으로 예상, 총 HIF 1α 레벨 upregulated hypoxia, 여 총 세포 lysates ARNT 수준을 크게 없었던 반면 (그림 1A)를 변경 합니다. 또한, hypoxia HIF 1α 및 세포질 표현의 ARNT 테스트 셀 라인19의 일부에서 검색 되지 않습니다 있지만 이전 보고서와 일치는 HEK293A 셀 (그림 1B)에 ARNT의 핵 축적을 유도 한다.
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여기는 hypoxic 조건 하에서 생 핵 단백질 사이의 단백질-단백질 상호 작용을 공부 하는 공동-immunoprecipitation 프로토콜에 설명 합니다. 이 메서드는 hypoxia에서 transcriptional 공동 규제 및 녹음 방송 요인 사이 상호 작용의 데모에 적합 합니다.

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

이 방법은 저산소 조건에서 전사 인자와 전사 공동 조절자 사이의 내인성 및 고유 상호 작용과 같은 저산소 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 저산소 세포가 저산소 조건에서 수확되고 핵 분획이 동시 면역침전에 사용된다는 것입니다. 이 프로토콜은 4개의 10cm 접시에서 자란 인간 배아 신장 293A 세포를 사용합니다.10%FBS, L-글루타민, 피루브산나트륨, 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충된 10밀리리터의 둘베코의 변형된 독수리 배지에 접시당 10-6번째 세포를 3-5배 파종합니다. 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 파종 후 24 시간 후 세포가 80-90 % 포화도에 도달하면 4 시간 동안 섭씨 37도에서 1 % 산소와 5 % 이산화탄소가 함유 된 인큐베이터 글로브 박스의 저산소증 하위 챔버에 두 개의 접시를 넣습니다.다른 두 요리는 노목시아에 보관하십시오. 저산소증 처리된 세포를 수확하기 전날, DPBS로 채워진 덮개가 없는 100ml 실험용 유리 시약 병을 저산소증 챔버에 24시간 동안 놓아 DPBS를 저산소 상태로 사전 평형화합니다. 세포를 채취하기 약 1시간 전에 얼음이 들어있는 아이스박스를 산소 1%와 이산화탄소 5%로 평형을 이룬 글로브박스의 처리실에 넣습니다.사전 평형화된 저산소성 DPBS가 들어 있는 병을 저산소증 하위 챔버에서 처리 챔버로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 저산소증 처리 다음 4 시간, 저산소증 하위 챔버에서 1% 산소 및 5% 이산화탄소로 사전 평형화된 처리 챔버로 세포를 이동합니다. 흡인에 의해 배양 배지를 제거하고 10ml 피펫으로 10ml의 얼음처럼 차가운 사전 평형 저산소 DPBS로 세포를 한 번 헹굽니다.5ml 피펫을 사용하여 5ml의 얼음처럼 차가운 사전 평형 DPBS를 추가하고 셀 스크레이퍼로 긁어 셀을 제거합니다. 세포 배양 플레이트를 기울이고 10ml 피펫을 사용하여 분리된 세포를 수집한 다음 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 세포 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.글로브 박스의 처리 챔버와 완충 챔버 사이의 문을 열며, 둘 다 1% 산소와 5% 이산화탄소로 사전 평형을 이룹니다. 저산소증 처리된 세포가 들어 있는 얼음 위의 15ml 원뿔형 튜브를 처리 챔버에서 버퍼 챔버로 옮깁니다. 버퍼 챔버의 도어를 열고 글로브 박스에서 셀을 완전히 제거합니다.저산소 세포와 정상 산소 세포를

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서 우리는 문화의 hypoxic 상태를 평가하는 세포 문화와 간단한 테스트에 hypoxia를 유발하는 간단한 방법을 제안합니다.

세포 배양의 유도와 Hypoxia의 시험

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

우리의 해마 CA1 영역과 슬라이스 tetanized 영역으로부터 핵 농축 분획의 분리 이후에 장기간 상승 작용의 유도에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 활성보기 학습 및 기억의 세포 모델에 의존하는 핵 단백질 수입을 결정하기 위해 사용될 수있다.

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

우리는 촬상을 사용 저산소증 글로벌 RNA 합성의 분석을위한 기술을 설명한다. RNA의 클​​릭 - 화학 라벨은 이전에 저산소증에서 수행하고 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA 변화의 시각화를 허용하지 않았습니다. 이 접근법은 해외 RNA 합성 세포 간 변화의 직접적인 시각화를 허용하며, 기존의 평균화 RNA 기술을 보완한다.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

이 원고는 특정 올리고뉴클레오티드 유도 농축을 통해 진핵 세포에서 형성된 동족 RNP를 선별하는 방법을 설명합니다. DHX9/RNA 헬리카제 A로 구성된 레트로바이러스 5' 미번역 영역에 결합된 동족 RNP를 분리하여 이 접근법의 적용 가능성을 입증합니다.

올리고 뉴클레오티드 지시 용출을 사용하여 세포에서 동족 RNA 단백질 단지의 분리

단백질-단백질 상호 작용은 세포의 핵과 세포질 모두에서 발생할 수 있습니다. 이러한 상호 작용을 조사하기 위해 기존의 동시 면역침전과 현대의 근접 결찰 분석법이 적용됩니다. 이 연구에서는 이 두 가지 방법을 비교하여 핵과 세포질에서 NF90-RBM3 상호 작용의 분포를 시각화합니다.

공동 면역 침전에 의한 핵 및 세포질 분수에서 단백질 - 단백질 상호 작용의 시각화 및<em&gt; 현장에서</em&gt; 근접 내고 분석

여러 조사, 생 포스트 번역 상 수정 대상 단백질에 대 한 매우 도전 수 있습니다. 여기에 설명 된 기술 개발 특정 PTM 타겟팅, 선호도 행렬 acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, 및 티로신 인 산화 수정 대상에 대 한 검색에 최적화 된 세포의 용 해 버퍼 및 필터 시스템 활용 간소화 된 단일 시스템을 사용 하 여 단백질입니다.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

기재된 단백질 은 관심 있는 주어진 단백질및 무표지 질량 분석법의 면역친화성 농축을 사용하여 핵 세포 분획으로부터 단백질 상호작용 파트너를 식별하기 위한 프로테오믹스 워크플로우이다. 워크플로우에는 세포외 분획, 면역 침전, 필터 보조 시료 준비, 오프라인 정리, 질량 분석 법 및 다운스트림 생물 정보학 파이프라인이 포함됩니다.

대규모 핵 상호 작용 프로파일링을 위한 라벨 없는 면역 침전 질량 분광 워크플로우

여기서는 고대사성 근위 소관 상피 세포에서 저산소증/산소 재산화 손상을 모델링하는 시험관 내 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 대사 스트레스 유발 손상을 유도하도록 설계되었으며, 근위 세뇨관 손상 지표의 발현과 미토콘드리아 호흡 기능 평가를 통해 측정할 수 있습니다.

근위 관 상피 세포에서 저산소증/재산소화 손상 모델링

학습하세요 저산소 상태에서 HEK293A 세포의 핵 단백질 상호작용을 공동 면역침전법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 전사인자와 보조조절인자의 상호작용 연구에 활용됩니다.

Hypoxic 조건 하에서 경작 하는 세포에서 내 생 적인 핵 단백질을 사용 하 여 공동 immunoprecipitation 분석 결과

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