Name: 원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 학습하세요 형광 표지된 원형질 막 주변 단백질의 정량적 분석 방법을 사용하여 세포 신호 전달 경로를 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 고급 현미경 없이도 단백질 분포를 효율적으로 평가할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 NPU에 의해 지원 되었다 I, LO1417 (교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국).

1입니다. 생물 자료의 준비
<ol><li>붙일 태그가 단백질 세포질 마커 뿐 아니라 관심의 표현 하는 생물 학적 자료를 준비 합니다. 소개에서 언급 하는 절차를 따릅니다.</li>
</ol>2. confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법
<ol><li>4-64 염료7제 1 fm 준비 자료를 얼룩.<ol>
<li>공부 자료에 대 한 적합 한 얼룩 프로토콜을 적용 합니다. 담배 BY-2 셀, 10mm FM의 0.2 μ와 200 μ 셀 서 스 펜 션의 dimethylsulfoxide에서 4-64 솔루션 얼룩. 참고: FM의 전형적인 착 색 농도 4-64 염료는 10 m m 재고 솔루션을 사용 하 여 dimethylsulfoxide에서 10 μ M에 대 한. 적절 한 얼룩에 대 한 FM 4-64의 가능한 가장 낮은 농도 사용 하 고 셀 얼음 (FM 4-64와 저온 수 플라즈마 멤브레인 속성에 영향을 미칠)에 품 어 하지 마십시오. 관찰 즉시 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 계속 합니다. 얼룩 및 이미지 수집 간격; 10 분 이상 하지 않아야 그렇지 않으면, 염료의 endocytosis 4-64 얼룩 FM 적용 됩니다.</li>
		<li>연속적으로, 여러 개의 샘플을 처리 하 고 실험의 시작 부분에 모든 샘플 얼룩이 되지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 셀 당 한 적도 confocal 섹션을 캡처하십시오.<ol>
<li>(첫 번째 채널에 있어야) 단백질 태그와 FM 4-64 (두 번째 채널에 있어야)로 사용 하는 발 색 단에 대 한 순차적 2 채널 스캔 설정 합니다. (10-20 픽셀/μ m) 높은 광학 해상도 설정 합니다. 예를 들어 설정: 63 X 기름 침수 목표, NA 1.3, 이미지 크기 1024 x 1024 픽셀. 원형질 막 비행기 획득된 이미지에 confocal 섹션 평면에 수직인 인지 확인 합니다.</li>
		<li>캡처 통계 평가 대 한 충분 한 데이터를 견본 당 적어도 20 셀 (가공된 소재에서 신호 변화에 따라 달라 집니다).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 필요한 소프트웨어 설치
<ol><li>피지 ImageJ 배포8와 주변 필요한 매크로 설치 합니다.<ol>
<li>사이트 https://fiji.sc/#download에서 소프트웨어를 다운로드 하 고 그들을 풀고 여 설치.</li>
		<li>압축 푼된 "Fiji.app" 디렉터리에 "ImageJ(.exe)" 파일을 두 번 클릭 하 여 피지를 시작 합니다.</li>
		<li>"주변" 매크로 다음 사이트에서 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/Peripheral_.ijm입니다.</li>
		<li>피지에 플러그인을 선택 | 매크로 | 설치... 메인 메뉴에서 "Peripheral_.ijm" 다운로드 한 파일의 경로를 지정 하 고 참고: 설치 매크로 "주변 장치"의 두 가지 새로운 도구 피지 도구 모음에 표시 됩니다: "받아 프로필 도구"와 "주변 단백질 메뉴."</li>
	</ol>
</li>
	<li>R 프로젝트 소프트웨어9및 필요한 패키지를 설치 합니다.<ol>
<li>R 프로젝트 설치에 대 한 사이트 https://cloud.r-project.org/에 지시를 따릅니다. 참고: 전체 분석 피지에서 수행 됩니다. R 소프트웨어만 내부적으로 호출할 수 것입니다 피지 매크로 계산 "주변 장치"에 의해.</li>
		<li>R GUI를 실행, 패키지를 선택 | 설치 패키지를... 메인 메뉴에서 가장 가까운 저장소 및 설치 패키지 "ggplot2" 지정. 참고: 또는, r 명령줄 입력: install.packages("ggplot2").</li>
		<li>대상에서 주변 R 패키지를 다운로드: http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz. 패키지를 선택 하 여 설치 | 로컬 파일에서 패키지를 설치. 참고: 또는 R 명령줄에이 명령을 입력: install.packages ("http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/source/peripheral_latest.tar.gz", repo NULL 입력 = = "소스").</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 피지 이미지 분석
<ol><li>세포질 마커의 confocal 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>플러그인을 사용 하 여 피지를 가져오기는 이미지 | 바이오-형식 | 바이오-형식 가져오기 기본 설정으로 피지 메뉴에서.</li>
		<li>바이오-형식 가져오기 이미지 보정을 제대로 인식 경우 확인 하십시오. 상단 왼쪽된 정보 필드 이미지 창에 표시 된 그림 차원 원래 그림 크기를 같아야 합니다.</li>
		<li>치료는 잘못에서 잘못 된 이미지 보정 대화 창 분석에에서 올바른 매개 변수를 설정 하 여 개별적으로, 예를 들어, 크기 | 설정 규모... 피지 메뉴에서: 까지의 거리를 픽셀 단위로 필드와 거리 알려진 필드에 적절 한 길이 단위로 실제 너비에 이미지 너비 (픽셀) 입력). 참고: Leica LCS LEI 파일 잘못 교정 단계 4.2.1를 따라 라.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 설정에 대 한 가져오기 옵션 매크로 실행 합니다. 세 가지 방법 중 하나에 의해 매크로 활성화: 플러그인을 선택 | 매크로 | 가져오기 옵션 [f1] 주 피지 메뉴에서 선택 같은 메뉴 도구 주변 단백질 메뉴, 클릭 한 후 항목을 누르거나 키보드 지름길 F1. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>Leica LCS LEI 형식 경우 Leica.lei 이미지 확인란을 활성화 하 여 부적 절 한 보정 해결. 이 옵션은 제대로 "lei" 확장자를 가진 파일에서 이미지 크기를 가져옵니다.</li>
		<li>가우스 블러 반경 (픽셀)필드에 적절 한 값을 정의 합니다. 이 그림 스무 딩 및 소음 감소 영향. 낮은 값 (1 픽셀) 충분 하 고 모든 이미지 정보 손실이 발생 하지 않습니다.</li>
		<li>프로 파일 선 두께 (픽셀)필드에 값을 설정 합니다. 두꺼운 라인 프로 파일 곡선의 높은 다듬기 발생 합니다. 기본값 10 픽셀 것이 좋습니다.</li>
		<li>"샘플 구분 기호" 와 "수출 항목." 의 정의 의해 구문 분석 이미지 제목 설정 참고: 이미지 제목 ( 예:확장명 없이 파일 이름: "실험-1_line-02_cell-11") "샘플 구분 기호" 필드에 나열 된 모든 문자가 주위 분할 됩니다 (예: "-_") 항목의 집합으로 ("실험", "1"," 라인","02","셀", 및"11") 요소를 그룹화 (샘플, 셀, 행, 또는 치료 정체성)에 다음과 같은 분석으로 사용할 수 있습니다. 항목을 "내보낸 항목." 출원으로 그들의 시퀀스 번호 ("0"의 첫 번째 항목에 대 한)를 입력 하 여 사용 됩니다 정의 공백으로 형식, 예를 들어, "3 5."을 사용 하 여 이 예제에서 항목 "02", "11" 참조 됩니다 "Fac_0" 및 "Fac_1" 라는 요소를 그룹화 하는 것으로 서 또한, 각 측정의 id로 "나" 요소를 메시지를 지칭 합니다.</li>
		<li>또는 빈 샘플 구분 기호 를 유지 하 고 전체 이미지 제목 유지 될 수 있습니다 경우 수출 항목 에 0을 입력.</li>
		<li>Windows 운영 체제에서 R 소프트웨어를 경로에 있을 것입니다 잘못 자동 검색 필드 R.exe 경로확인 합니다. 그렇지 않으면, 시스템 (예:"C:\Program Files\R\bin\R.exe")에서 R.exe 파일에 전체 경로 지정 합니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 다음 대화 창에서 구문 분석 하는 제목을 확인 하 고 확인 또는 다시 재설정을 클릭 합니다. 참고: 모든 사진은 자동으로 부드럽게 그리고 결국 recalibrated 될 것입니다. 모든 내보낸된 그룹화 요인의 목록이 결과 창에 표시 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>처리 된 이미지의 원형질 막 지역에 걸쳐 선형 선택 수행 하 고 형광 프로 파일을 측정.<ol>
<li>피지 도구 모음에서 직선 피지 도구를 선택 합니다. 이미지를 클릭 하 고 원형질 막 지역 선 끌어. 선 세포 외 공간에서 시작 해야 하며 플라즈마 멤브레인에 수직 이어야 한다. 대뇌 피 질의 세포질의 두꺼운 및 더 균질 층으로 영역을 선택 합니다. 선형 선택의 최적의 길이 5-10 μ m입니다.</li>
		<li>4.2 (단축키 "x") 단계에서 비슷한 방법으로 또는 프로필 도구 걸릴 피지 도구 모음에서 클릭 하 여 프로 파일 매크로 받아 실행 합니다. 두 채널에 형광 프로필의 자동 측정 수행 됩니다 하 고 데이터는 결과 창에 표시 됩니다.</li>
		<li>"X" 키를 사용 하 여 생소 간주 됩니다, 경우 텍스트 편집기에서 매크로 소스 파일 Peripheral_.ijm 를 열고, 줄에 "x" 기호 대체 ' 매크로 "걸릴 프로필 [x]" {' 더 유리한 기호 (하지로 피지 환경에서 사용 되는 활성 키보드 지름길) 저장 합니다. 매크로 (3.1.4 단계)를 재설치 하 고 이미지 가져오기에서 분석을 시작.</li>
		<li>개별 신호 변화에 따라 각 셀에 대 한 프로필의 대표 번호를 가져가 라.</li>
		<li>파일을 통해 데이터 저장 | 저장 다른 이름으로. 항상 사용 "csv" 확장; 그것은 적절 한 데이터 형식이 필요 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로필 데이터 매크로 플롯 (지름길 F5) 측정 된 프로필의 그래픽 시각화에 대 한 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 합니다.<ol>
<li>체크 상자 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택 되지 않은.</li>
		<li>줄거리는 단일 CSV 파일 또는 모든 CSV 파일에서 적절 한 라디오 단추를 클릭 하 여 지정된 된 디렉터리에 있는 결과 창에서 최근 데이터 에서 만들 수 경우 지정 합니다. 참고: 최근 결과에서 줄거리를 만드는 경우 데이터 저장 됩니다 먼저 (다른 이름으로 저장 대화 상자는 자동으로 활성화).</li>
		<li>그룹화 요소 는 적절 한 체크 박스를 선택 하 여 그래프에 사용 됩니다 지정 합니다. 모든 프로 독특한 플롯에 표시 해야 하는 경우 "i." 요소를 선택 합니다. 하나의 플롯에서 플롯 모든 데이터에 의해 해야 하는 경우 선택 하지 않은, 체크 박스를 유지. 주의: 플롯 작성 중 처리 결과 원인 오류에 존재 하지 않는 그룹화 요소의 선택 합니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드에서 음모를 저장할 때 파일 이름 지정 하 고 파일 높은 줄거리 와 플롯 폭에 그림 이미지 치수 를 정의 합니다. 참고: 결과 플롯 저장 됩니다 소스 데이터 디렉토리에 PNG 파일로.</li>
		<li>선택은 Pdf 출력? 확인란 추가 PDF 출력 생성 될 수 있습니다.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 결과 대 한 경로 지정 가져오거나 결국 데이터에 대 한 다음 대화 창에서. 분석 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에서 열 것 이다 음모 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>만약 일부 플롯된 프로필 과도 한 신호 (태그 단백질)에 대 한 세포 외 공간에 나 (4-64의 FM 신호)에 대 한 세포내 공간에서 프로 파일 필터링 설정 매크로 (지름길 F2) 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오. 참고: 필터링 지정 된 x 좌표에서 최대 허용된 강도 임계값에 따라 가난한 프로 파일의 제거를 수 있습니다.<ol>
<li>각 채널에 대 한 과도 한 세포 외 (세포내) 신호 측정을 제거하는 파일에 적절 한 강도 임계값을 설정 합니다. X 좌표에서 (보다) 낮은필드에서 강도 임계값 적용 될 영역을 지정 합니다.</li>
		<li>체크 상자는 프로필 데이터 매크로 플롯 (단계 4.4) 다시 실행 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 선택; 모든 탈 프로필 성공적으로 제거 되었습니다 확인 하십시오. 그렇지 않으면, 필터링 매개 변수 (4.5.1 단계) 개선.</li>
	</ol></li>
	<li>실행 만들기 모델 매크로 (지름길 f 3) 원형질 막 및 교정 데이터에 따라 세포질 형광 분포 모델을 만듭니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수를 설정 하 여 따르십시오.<ol>
<li>지정 하는 경우 입력된 데이터를 선택 하 여 필터링된 (4.5 단계) 있어야는 사용 하 여 필터링 입력 데이터? 체크 박스.</li>
		<li>4.4.2 단계 에서처럼 analogically 원본 데이터 를 지정 합니다.</li>
		<li>Μ m에서 간격 을 모델 "시작", "끝"의 정의 의해 예측 될 것 이다 하 고 "단계" 값을 지정 합니다. 참고: 모든 프로 파일 측정 지정 된 간격 보다 더 이상 이어야 한다.</li>
		<li>적절 한 분야에서 사용 chromophores의 형광의 파장 여기 및 방출 맥시 마를 지정 합니다. 4-64 조합 GFP와 FM에 대 한 기본값을 설정 합니다. 참고: "GFP" 단백질 (GFP, CFP, YFP, 등), 태그에 사용 되는 발 색 단을 나타내고 "FM4" 발 색 단 (일반적으로 4-64 FM) 얼룩 원형질 막에 대 한 사용을 나타냅니다.</li>
		<li>출력 파일 접두사 필드를 지정 합니다. 접두사 원본 데이터 디렉터리로 RData 파일 결과 모델 저장에 대 한 사용 됩니다.</li>
		<li>체크 박스를 선택 음모 모델? 그래픽 출력 필요한 경우. 경우와 또한 PDF 파일 PNG로 줄거리 저장 됩니다는 Pdf 출력? -확인란을 선택.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다. 입력을 지정 또는 다음 대화 창에서 경로 출력 하 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 줄거리는 모델의 세포질 및 주변 관련 단백질 형광의 막 화합물에에서 표시 됩니다 새 이미지 창 고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>관심사의 단백질을 표현 하는 셀의 이미지를 처리 합니다.<ol>
<li>4.1 단계 에서처럼 analogically 이미지를 가져옵니다.</li>
		<li>4.2 단계 에서처럼 analogically 분석을 설정 합니다. 부드럽게 하 고 선 폭 동일 해야 합니다.</li>
		<li>측정 단계 4.3 에서처럼 analogically 프로필.</li>
		<li>(단계 4.4)을 그려서 프로필의 정확성을 확인 하 고 (4.5 단계) 원하는 경우 필터링 설정.</li>
	</ol></li>
	<li>원형질 막 사이 및 세포질 단백질 분할의 계산에 대 한 계산 배포 매크로 (지름길 F4)를 실행 합니다. 호출된 매크로 대화 창에서 매개 변수 설정에 따라.<ol>
<li>Analogically 이전 단계 (단계 4.4), 데이터 원본, 필터링 및 파일 이름 접두사를 지정 합니다.</li>
		<li>피지 (선택 체크 박스 최근 결과)에 "주변" 매크로의 최근 인스턴스에서 마지막 모델 계산 또는 RData 파일 (단백질 분포 계산에 대 한 모델 로드 됩니다 지정 "파일"에서체크 박스 선택) 합니다.</li>
		<li>확인란 활성화 원하는 결과 필터링 하는 경우 잔여 가변성 보다 큰 결과 제거 하십시오. 최대 허용 잔류 프로 파일 측정의 신호 분해에 의해 설명할 수 없는 수 있는 임계값을 지정 합니다. 예: 0.200 나타냅니다 프로필에 형광 강도의 총 다양성의 설명할 수 없는 변화 20% 보다 높은 모든 측정 삭제 됩니다.</li>
		<li>샘플 그룹화 요소, 상자-플롯 만들기 (단계 4.4)에 사용할 수 있습니다를 선택 합니다.</li>
		<li>체크 박스를 활성화 Pdf 출력? PDF 파일로 상자 그림을 저장 하기 위한.</li>
		<li>확인을 클릭 합니다, 그리고 지정 하는 입력 또는 출력 경로, 고 수행된 R 코드를 보여주는 대화 창에서 확인 을 클릭 하 여 분석을 확인 합니다. 참고: 새 이미지 창에 표시 됩니다 주변 관련 단백질 플라즈마 막과 세포질 사이 분할의 상자 그림 그리고 R 분석 출력 텍스트 창에 나열 됩니다.</li>
		<li>파일을 통해 결과 창에 표시 하는 결과 저장 하는 외부 처리에 대 한 | 저장 다른 이름으로... 창 메뉴.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 설명 하는 방법을 원형질 막 형광 강도5측정에 따라 다른 방법에 비해 주변 관련된 단백질에 대 한 분할의 더 정확한 견적을 생성 합니다. 이 방법의 주요 향상은 그것 계정에 빛의 회절 및 원형질 막의 세포질 신호 중첩입니다. 비록 이러한 메서드 결과 평균 세포질 막 위치에서 형광 강도의 비교에 기반 하는 간단한 방법의 결과와 상관 관계에는 신호 (같이 이전6),이 새로운 방법의 주요 장점은 특히 플라즈마 멤브레인 신호가 세포질 신호 보다 낮은 결과의 관련성의 추정 수 있도록 (신호 분해에 의해 정체 불명의) 잔여 가변성의 결심이 이다. 설명 방법은 또한 신호 잡음에 더 강력한 단백질 분할의 계산만 한 지점에 기반 하지 않은 때문에.
분석 단일 2 채널 confocal 이미지만 필요합니다. FRAP 접근18 이상 시간 창에서 단백질 보급 역학의 측정...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
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Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

주변 관련 된 플라즈마 막 단백질은 세포 신호 통로의 주요 구성 요소. 그들의 과도 플라즈마 멤브레인 협회와 분리, 플라즈마 막과 세포질 사이 신호 변환에 대 한 중요 한 그들의 기본적인 역할 중 하나입니다. 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 지질 앵커 (N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation) 또는 지질 바인딩 도메인 (phosphatidylinositol 인산 염, phosphatidic 산, 와 상호 작용 하 여 원형질 막에 붙어 있을 수 있다 등).
이 단백질의 속성 수 플라즈마 멤브레인 바인딩 검사 vivo에서, 예를 들어, 붙일 태그가 단백질 핵심 아미노산의 사이트 감독 mutagenesis에 의해 수정 될 때 또는 때 그것에 영향을 미치는 다양 한 억제제 처리 됩니다. 지질 신호입니다. 주변 플라즈마 막 단백질의 분포는 주로 되 고 질적으로, 경우에 특히 때 평가 단백질 다시 메일은 분명 합니다. 제시 방법은 상황에 대 한 최적의 단백질 다시 배포만 부분 이며 양적 평가 필요한 때입니다. 플라즈마 멤브레인 협회 confocal에서 추정 되는 때 자주 사용된 접근 레이저 스캐닝 현미경 이미지의 원형질 막에 및 세포질1,2, 형광 강렬 비율 아니다 간단 하지만 정확한. 원형질 막에 형광 강렬 특정 형광 현미경 검사 법 기술과 사용 하는 광학 요소3에 대 한 빛의 회절 특성 때문 원형질 막 및 세포질 신호의 중첩을 반영합니다. 따라서, 세포질 신호 막 지역에도 포함 됩니다. 이러한 이유로, FM 4-64 얼룩 패턴 막 신호 선택4마스크로 사용할 수 없습니다. 또한, 막 신호 FM 4-64 항상 체계적으로 최대 얼룩에 의해 정의 된 위치에서의 간단한 측정 평가의 중첩으로 인해 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질의 진짜 플라즈마 막 신호는 막 그리고 세포질 화합물입니다. 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 관찰 된 신호의 최대 또한 공동 플라즈마 멤브레인 마커 (즉, FM 4-64 styryl 염료), 최대를 지역화 하지 않습니다 하지만 세포질 쪽으로 이동 된다. 또 다른 한계는 FM 4-64 방출 피크는 빛 회절3의 파장 의존성 때문 GFP 같은 녹색 형광 성 단백질을 위한 방출 봉우리에 비해 넓은 사실에 기반입니다.
여기에 설명 된 메서드에서 태그 단백질 신호 원형질 막 세포질 신호를 가상 배포를 설명 하는 것은 각각의 경험적 함수 두 개 장착 되어 있습니다. 이 신호 분해 수직 붙일 태그가 단백질 표현 confocal 섹션 일반, 2 채널 소스 이미지에서 원형질 막으로 세포 표면에 적용 되는 선형 형광 프로필에 적용 됩니다. 셀 FM 4-64 염료와 함께 표시입니다.
피팅을 사용 하는 첫 번째 함수는 셀 가장자리에 세포질 신호의 회절을 설명 합니다. 그것은 관심의 원형질 막 주변 관련 된 단백질으로 같은 발 색 단에 의해 표를 붙인 세포질 단백질 마커를 표현 하는 셀에 측정 되었다 이전 취득된 형광 프로필에서 얻은 것입니다. 원형질 막 신호의 회절을 설명 하는 두 번째 함수는 FM 4-64의 형광에서 파생 됩니다. 이 신호는 점 광원의 빛 회절의 대략적인 모델링에 사용 되는 가우스 함수에 의해 첫째로 직선 근사 줄. 둘째,이 모델, 빨간 FM 4-64 방출에 유효 수학적으로 원형질 막에 대 한 관심의 주변 관련 단백질의 태그에 사용 되는 발 색 단의 방출 파장에 대 한 관련 된 형식으로 변환 됩니다. 두 함수 모두 최대 강도 및 FM 4-64 신호 및 세포질 단백질 신호에 대 한 가장 높은 값의 10%에서 평균 각각 정규화 됩니다. 이 신호 분해 (비-선형 최소 평방 피팅 방법), 원형질 막의 비율과 시험된 단백질의 세포질 분수 수 수 추정 쉽고 정확 하 게. 분할 계수 계산된의 실제 물리적 차원은 세포질 볼륨 농도 표면 농도 플라즈마 멤브레인에 비해 마이크로미터의 범위입니다. 같은 양의 단백질은 원형질 막의 인접 한 지역에서 지역화 된 세포질에 플라즈마 막에서 거리를 정의 합니다. 이 값은 분할 계수 K2 도입 이전5. 방법은 매우 빠르고, 일상적인 confocal 레이저 스캐닝 현미경를 사용 하 여 인수만 단일 confocal 단면도 요구 하 고 그것은 계산 요구 하지. 분석 핵심 휴대용 R 패키지에 구현 된 고 추가 ImageJ 매크로에서 직관적인 대화 상자는 분석을 실행 하려면 그래픽 사용자 인터페이스를 제공 하기 위해 작성 되었습니다. 소프트웨어 및 방법의 자세한 설명 (이전 출판6) http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/에서 찾을 수 있습니다.
방법은 절연된 셀, protoplasts, 및 조직에 대 한 적합 한 개별 세포의 원형질 막 명확 하 게 구별할 수 어디에, 주변에 관련 된 단백질 검사의 붙일 태그 구문 표현. 발 색 단 호환 FM 4-64 얼룩을 사용 해야 합니다. FM 4-64에서 빨간 형광; 따라서, 검사 단백질 파란색, 녹색, 또는 황색 방출 (예를 들어, GFP, CFP, YFP)와 형광 단백질에 의해 태그가 될 수 있습니다. 생물학 물자의 안정적인 변화 단백질 분포의 덜 인공 하 고 쉽게 재현 가능한 관측을 수 있기 때문에 것이 좋습니다. 그것은 시험된 단백질 상대적으로 균질 세포질 배포 필요입니다. 바인딩과 그물 또는 다른 세포내 막 구획에 있는 단백질의 지 방화는 인공 결과 생성할 수 있습니다.
또한, 동일한 생물학 물자 세포질 마커를 표현 비교에 사용 해야 합니다. 셀 폐지 막 바인딩 용량 무료 chomophore (같은 사용 되는 태그, 예를 들어, 무료 GFP 주변 단백질)에 의해 또는 관심사의 태그 단백질에 의해 변환할 수 있습니다. 막 바인딩 용량 수 수 폐지, 예를 들어 막 바인딩 도메인의 트리밍 또는 주요 아미노산 잔류물 (예를 들어, 사이트에 대 한 N-myristoylation, S-acylation, 또는 prenylation, 등)의 사이트 감독 mutagenesis.
공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 법, 대 한 세포 FM 4-64 염료 처럼 막 마커로 표시 해야 합니다. FM (때문에 간섭 autofluorescence, 불 쌍 한 염료 침투 등) 공부 자료에 적합 하지 않으면 4-64 얼룩, 원형질 막 수 표시, 예를 들어 적절 한 chomophore (태그 통합 플라즈마 막 단백질에 의해 mCherry, RFP, 등). 마커 세포내 막 구획 (endomembranes)에서 무시할 현지화가 필수적 이다.
고정된 샘플 및 항 체를 사용 하는 경우 고칠 수 아날로그 FM 4-64FX 또는 플라즈마 멤브레인 라벨 적절 한 대상에 대 한 항 체에 의해 사용할 수 있습니다. 이 경우에, 고정 절차 단백질의 선택적 손실 세포질과 원형질 막에서 이어질 수 있기 때문에 매우 신중 하 게 결과 평가에 필수적 이다.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>플라즈마 멤브레인 염료</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540 시그마</td><td>염료 용매</td></tr><tr><td>일반 장비(현미경 슬라이드, 피펫, 팁, 튜브)</td><td></td><td></td> <td>세포 라벨링 및 현미경 검사용 장비</td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 컴퓨터</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

이 메서드는 원형질 막 어떤 붙일 태그가 주변 관련 단백질의 원형질 막에 걸쳐 형광 강도의 프로필을 사용 하 여 분할의 결정에 대 한 빠른 접근을 제공 합니다. 측정 된 형광 프로필 셀 주변에 수직으로 적용 하는 선 따라 막과 세포질 형광 분배 모델에 적합 하다. 이 모델은 FM 4 64 표시 된 원형질 막과 세포질 붙일 태그 마커를 표현 하는 참조 셀의 형광 강도 값에서 생성 됩니다. 다양 한 세포 유형 및 유기 체; 메서드를 적용할 수 있습니다. 그러나, 비 이웃 세포의 플라즈마 막만 평가할 수 있습니다. 이 빠른 현미경-기반 방법은 실험, 플라즈마 멤브레인 관련 마커의 미묘 하 고 동적 변화가 예상 된다 고 양이 정해질 필요가, 예를 들어, 억제제 치료 단백질의 돌연변이 체 버전의 분석에 적합 그리고 신호 변환 관측. 메서드는 사용자 친화적인 인터페이스 역할 ImageJ 매크로와 결합 된 멀티 플랫폼 R 패키지에 구현 됩니다.

DREPP10 식물 관련 주변 관련 된 플라즈마 막 단백질 N-myristoylation와 phosphatidylinositol 인산 염11, 와 정전기 상호 작용을 통해 플라즈마 막으로 연결 되는 12. DREPP으로 식물 세포에서 칼슘 신호 기계 구성 요소 설명 했다 그리고 또한 골격13,14와 상호 작용. 제시 실험에서 야생-타입 담배 DREPP2 및 그것의 비 myristoylated 돌연변이 버전 (Gly2 날개에 의해 대체) GFP 태그6 되었고 담배 BY-2 현 탁 액 셀15 CaMV 35S promotor<sup class...

여기, 선물이 붙일 태그가 주변 관련 된 단백질에 대 한 원형질 막 협회의 레벨의 정량 분석을 수행 하는 프로토콜. 방법은 막의 전산 분해와 세포 원형질 막 형광 표식으로 표시에서 관찰 된 신호의 세포질 구성 요소를 기반으로 합니다.

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

이 방법은 세포 신호 경로를 밝히는 것을 포함하여 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 가장 큰 장점은 실제로 정교하고 미시적인 접근 방식이 필요하지 않다는 것입니다. 또한 매우 빠르기 때문에 세포 내 단백질 분포를 실시간으로 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.말초 관련 단백질의 막 분할에 대한 평가 및 정량화는 현미경 하에서 원형질막과 세포질 형광의 혼합을 유발하는 광 회절로 인해 복잡합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생물학적 물질을 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 연구된 재료에 적합한 염색 프로토콜을 적용하여 준비된 재료를 FM 4-64 염료로 염색합니다.담배 BY-2 세포의 경우, 200마이크로리터의 세포 현탁액을 0.2마이크로리터의 10밀리몰 FM 4-64 용액으로 디메틸 설폭사이드로 염색합니다. 세포 1개당 하나의 적도 공초점 단면을 캡처하려면 단백질 태그로 사용되는 발색단과 FM 4-64에 대한 순차적 2채널 스캔을 설정합니다. 또한 더 높은 광학 해상도를 설정하십시오.예를 들어 개구수가 1.3이고 이미지 크기가 1, 024 x 1, 024 픽셀인 63배 오일 이멀젼 대물렌즈가 있습니다. Fiji ImageJ Distribution 및 필요한 매크로 주변 장치를 설치합니다. 피지에서는 플러그인을 선택한 다음 매크로를 선택한 다음 메인 메뉴에 설치하고 ImageJ 매크로 주변 장치를 사용하여 다운로드한 파일의 경로를 지정합니다.R 프로젝트 소프트웨어 및 필요한 패키지를 설치합니다. R 그래픽 사용자 인터페이스를 실행하고, packages를 선택한 다음, 메인 메뉴에서 패키지를 설치하고, 가장 가까운 저장소와 설치를 위한 ggplot2 패키지를 지정합니다. R 패키지 주변 장치를 다운로드합니다.패키지를 선택하여 설치한 다음 로컬 파일에서 패키지를 설치합니다. 세포질 마커의 컨포칼 이미지를 처리합니다. 이렇게 하려면 플러그인을 사용하여 이미지를 피지로 가져온 다음 bioformats를 사용한 다음 기본 설정으로 Fiji 메뉴에서 bioformats importer를 사용합니다.해석 설정을 위해 가져오기 옵션 매크로를 실행합니다. 메뉴 도구인 peripheral protein menu를 클릭한 후 동일한 항목을 선택하여 매크로를 활성화합니다. gaussian blur radius pixel 필드에 적절한 값을 정의합니다.이는 사진 매끄럽게 하기 및 노이즈 감소에 영향을 줍니다. 낮은 값으로도 충분하며 이미지 정보 손실이 발생하지 않습니다. 이제 필드 프로필 선 너비 픽셀에 값을 설정합니다.선이 두꺼울수록 프로파일 곡선이 더 매끄럽게 됩니다. 기본값은 10픽셀을 사용하는 것이 좋습니다. 이미지 제목을 설정하고, 샘플 구분 기호와 내보낸 항목의 정의에 따라 구문 분석합니다.확인을 클릭합니다. 다음 대화 상자 창에서 제목 구문 분석을 확인하고 확인을 클릭하거나 뒤로 재설정합니다. 다음으로, 처리된 이미지에서 원형질막 영역을 가로질러 선형 선택을 수행하고 형광 프로파일을 측정합니다. 이렇게 하려면 Fiji 도구 모음에서 Fiji 도구의 직선을 선택합니다.이미지를 클릭하고 원형질막 영역을 가로지르는 선을 드래그합니다. 선은 세포 외 공간에서 시작해야 하며 원형질막에 수직이어야 합니다. 더 두껍고 더 균질한 피질 세포질층이 있는 영역을 선택하십시오.선형 선택의 최적 길이는 5-10미크론입니다. 피지 도구 모음에서 take profile 도구를 클릭하여 take profile 매크로를 실행합니다. 두 채널에서 형광 프로파일의 자동 측정이 수행되고 데이터가 결과 창에 표시됩니다.개별 신호 변동성에 따라 각 셀에 대한 프로파일의 대표 번호를 취합니다. 측정된 프로파일의 그래픽 시각화를 위해 플롯 프로파일 데이터 매크로를 실행합니다. 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정합니다.입력 데이터에 대한 필터링 사용 확인란을 선택하지 않은 상태로 유지합니다. 적절한 라디오 버튼을 클릭하여 결과 창의 최근 데이터, 단일 CSV 파일 또는 지정된 디렉토리의 모든 CSV 파일에서 플롯을 생성해야 하는지 지정합니다. 적절한 확인란을 선택하여 플로팅에 사용할 그룹화 계수를 지정합니다.모든 프로파일이 고유한 플롯에 표시되어야 하는 경우 요인 I을 선택합니다. 모든 데이터를 단일 플롯에 플롯해야 하는 경우 확인란을 선택하지 않은 상태로 유지합니다. 확인을 클릭합니다. 결과를 저장하거나 다음 대화 상자 창에서 최종 데이터를 가져올 경로와 파일 이름을 지정합니다.대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 수행된 R 코드를 표시하여 분석을 확인합니다. 일부 플롯된 프로파일에 세포외 또는 세포 내 공간에서 과도한 신호가 있는 경우 프로파일 필터링 설정 매크로를 실행합니다. 그런 다음 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정합니다.각 채널에 대해 파일에서 적절한 intensity threshold를 설정하고 과도한 extracellular 또는 intracellular 신호가 있는 측정값을 제거합니다. intensity threshold가 필드에 적용될 영역을 X 좌표보다 낮거나 큰 값으로 지정한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 데이터 입력에 필터링 사용 확인란을 선택한 상태에서 플롯 프로파일 데이터 매크로를 다시 실행합니다. 이제 이전에 저장한 파일의 데이터를 추가합니다.모든 이상 프로파일이 성공적으로 제거되었는지 확인하고, 그렇지 않으면 필터링 매개변수를 개선합니다. create model 매크로를 실행하여 보정 데이터를 기반으로 원형질막과 세포질 형광 분포의 모델을 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정한 후 확인을 클릭합니다. 다음 대화 상자 창에서 입력 파일 경로와 이름을 지정하고 수행된 R 코드를 표시하는 대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 분석을 확인합니다.다음으로, 관심 단백질을 발현하는 세포의 이미지를 처리합니다. 이미지를 가져오고 이전과 같이 분석을 설정합니다. 매끄럽게 하기와 선 너비는 동일해야 합니다.프로필 측정을 진행합니다. 플로팅하여 프로파일의 정확도를 확인하고 원하는 경우 앞에서 설명한 대로 필터링을 설정합니다. 원형질막과 세포질 사이의 단백질 분할을 계산하기 위해 calculate distribution 매크로를 실행합니다.입력 데이터 및 모델 소스를 지정하고 최종적으로 데이터 필터링을 설정합니다. 결과 필터링이 필요한 경우보다 잔류 변동성이 더 큰 결과를 제거하려면 확인란을 활성화된 상태로 유지합니다. 개별 프로파일 측정의 신호 분해로 설명할 수 없는 최대 허용 잔류 변동성의 임계값을 지정합니다.상자 그림을 만드는 데 사용할 수 있는 표본 그룹화 요인을 선택합니다. 확인을 클릭하고, 입력 또는 출력 경로를 지정하고, 수행된 R 코드를 표시하는 대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 분석을 확인합니다. 여기에 표시된 것은 식물 단백질을 발현하는 FM 4-64 염색 세포의 이미지이며, 이는 N-미리스토일화 및 포스포이노시티드에 대한 정전기 상호 작용을 통해 원형질막과 관련이 있습니다.이러한 상호 작용은 워트마닌에 의해 실험적으로 방해되었습니다. N-미리스토일화의 중요성은 N-미리스토일화 부위 역할을 하는 두 번째 아미노산 위치에서 글리신의 돌연변이에 의해 테스트되었습니다. 두 원형질막 결합 능력의 제거 효과는 단백질의 N-말단 도메인을 절단하여 테스트되었습니다.결과 상자 플롯은 N-미리스토일화 부위의 돌연변이 후 및 약물 처리 후 원형질막 친화도의 감소를 보여줍니다. 이들의 상호 효과는 N-말단 도메인을 제거하는 효과와 비슷합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분석의 주요 단계를 적절한 순서로 수행하는 방법과 매개변수를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.이 분석에 따라 얻은 데이터의 통계적 평가를 위해 ANOVA와 같은 통계적 방법을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 식물 부유 세포를 위해 개발되었지만, 매끄럽고 명확하게 구별할 수 있는 원형질막이 있는 다른 세포나 조직에도 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

규제 endocytosis는 막 단백질의 대부분의 세포 표면 발현 수준을 관리합니다. 여기서 우리는 도파민 전송 (DAT), polytopic 멤브레인 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 줄이할 수있는, 멤브레인 impermeant biotinylation의 시약을 사용합니다. 방법은 대부분의 플라즈마 막 단백질의 endocytic 속도를 측정하는 직접적인 접근을 용이하게합니다.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

살아있는 세포의 플라즈마 막의 형광 단백질 지질 뗏목의 파티션을 알아내기 위해 기술이 설명되어 있습니다. 그것은 지질 보트 내부 또는 외부에있는 단백질의 확산시기에 불균형을 이용합니다. 취득이 통제 조건이나 약물 이외 후에 동적으로 수행할 수 있습니다.

지질 뗏목의 결정은 형광 상관 분광학 (FCS)에 의해 살아있는 세포에서 Fluorescently 태그가 추가된 프로브의 파티션

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

여기에서는 살아있는 세포에서 일체형 막 단백질의 방향과 토폴로지를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 간단한 프로토콜은 관심 단백질과 GFP 사이의 키메라의 선택적 단백질 분해 효소 민감도에 의존합니다.

형광 단백질 분해 효소 보호를 사용하여 막 단백질 토폴로지를 결정 (FP​​P)

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

이 기사는 살아있는 세포의 원형질막에서 분자 확산을 측정하기 위해 스팟 변이 형광 상관 분광법 (svFCS) 현미경을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.

살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법

이 문서는 칸디다 알비칸스 ABC (ATP 결합 카세트) 단백질 Cdr1의 특성화를위한 소규모 플라즈마 막 격리 프로토콜을 제시, 사카로미세스 cerevisiae에서 과발현. 프로테아제-클레이블 C-단말 mGFPCdr1과 태그 사이에 16잔류 링커를 장착한 이중 태그는 Cdr1의 정제 및 세제 스크리닝을 용이하게 하도록 설계되었습니다.

칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

학습하세요 형광 표지된 원형질 막 주변 단백질의 정량적 분석 방법을 사용하여 세포 신호 전달 경로를 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 고급 현미경 없이도 단백질 분포를 효율적으로 평가할 수 있습니다.

원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

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