원형질 막 주변 관련 된 단백질에 대 한 분할 결정

이 방법은 세포 신호 경로를 밝히는 것을 포함하여 세포 생물학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 가장 큰 장점은 실제로 정교하고 미시적인 접근 방식이 필요하지 않다는 것입니다. 또한 매우 빠르기 때문에 세포 내 단백질 분포를 실시간으로 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

말초 관련 단백질의 막 분할에 대한 평가 및 정량화는 현미경 하에서 원형질막과 세포질 형광의 혼합을 유발하는 광 회절로 인해 복잡합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 생물학적 물질을 준비하는 것으로 이 절차를 시작합니다. 연구된 재료에 적합한 염색 프로토콜을 적용하여 준비된 재료를 FM 4-64 염료로 염색합니다.

담배 BY-2 세포의 경우, 200마이크로리터의 세포 현탁액을 0.2마이크로리터의 10밀리몰 FM 4-64 용액으로 디메틸 설폭사이드로 염색합니다. 세포 1개당 하나의 적도 공초점 단면을 캡처하려면 단백질 태그로 사용되는 발색단과 FM 4-64에 대한 순차적 2채널 스캔을 설정합니다. 또한 더 높은 광학 해상도를 설정하십시오.

예를 들어 개구수가 1.3이고 이미지 크기가 1, 024 x 1, 024 픽셀인 63배 오일 이멀젼 대물렌즈가 있습니다. Fiji ImageJ Distribution 및 필요한 매크로 주변 장치를 설치합니다. 피지에서는 플러그인을 선택한 다음 매크로를 선택한 다음 메인 메뉴에 설치하고 ImageJ 매크로 주변 장치를 사용하여 다운로드한 파일의 경로를 지정합니다.

R 프로젝트 소프트웨어 및 필요한 패키지를 설치합니다. R 그래픽 사용자 인터페이스를 실행하고, packages를 선택한 다음, 메인 메뉴에서 패키지를 설치하고, 가장 가까운 저장소와 설치를 위한 ggplot2 패키지를 지정합니다. R 패키지 주변 장치를 다운로드합니다.

패키지를 선택하여 설치한 다음 로컬 파일에서 패키지를 설치합니다. 세포질 마커의 컨포칼 이미지를 처리합니다. 이렇게 하려면 플러그인을 사용하여 이미지를 피지로 가져온 다음 bioformats를 사용한 다음 기본 설정으로 Fiji 메뉴에서 bioformats importer를 사용합니다.

해석 설정을 위해 가져오기 옵션 매크로를 실행합니다. 메뉴 도구인 peripheral protein menu를 클릭한 후 동일한 항목을 선택하여 매크로를 활성화합니다. gaussian blur radius pixel 필드에 적절한 값을 정의합니다.

이는 사진 매끄럽게 하기 및 노이즈 감소에 영향을 줍니다. 낮은 값으로도 충분하며 이미지 정보 손실이 발생하지 않습니다. 이제 필드 프로필 선 너비 픽셀에 값을 설정합니다.

선이 두꺼울수록 프로파일 곡선이 더 매끄럽게 됩니다. 기본값은 10픽셀을 사용하는 것이 좋습니다. 이미지 제목을 설정하고, 샘플 구분 기호와 내보낸 항목의 정의에 따라 구문 분석합니다.

확인을 클릭합니다. 다음 대화 상자 창에서 제목 구문 분석을 확인하고 확인을 클릭하거나 뒤로 재설정합니다. 다음으로, 처리된 이미지에서 원형질막 영역을 가로질러 선형 선택을 수행하고 형광 프로파일을 측정합니다. 이렇게 하려면 Fiji 도구 모음에서 Fiji 도구의 직선을 선택합니다.

이미지를 클릭하고 원형질막 영역을 가로지르는 선을 드래그합니다. 선은 세포 외 공간에서 시작해야 하며 원형질막에 수직이어야 합니다. 더 두껍고 더 균질한 피질 세포질층이 있는 영역을 선택하십시오.

선형 선택의 최적 길이는 5-10미크론입니다. 피지 도구 모음에서 take profile 도구를 클릭하여 take profile 매크로를 실행합니다. 두 채널에서 형광 프로파일의 자동 측정이 수행되고 데이터가 결과 창에 표시됩니다.

개별 신호 변동성에 따라 각 셀에 대한 프로파일의 대표 번호를 취합니다. 측정된 프로파일의 그래픽 시각화를 위해 플롯 프로파일 데이터 매크로를 실행합니다. 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정합니다.

입력 데이터에 대한 필터링 사용 확인란을 선택하지 않은 상태로 유지합니다. 적절한 라디오 버튼을 클릭하여 결과 창의 최근 데이터, 단일 CSV 파일 또는 지정된 디렉토리의 모든 CSV 파일에서 플롯을 생성해야 하는지 지정합니다. 적절한 확인란을 선택하여 플로팅에 사용할 그룹화 계수를 지정합니다.

모든 프로파일이 고유한 플롯에 표시되어야 하는 경우 요인 I을 선택합니다. 모든 데이터를 단일 플롯에 플롯해야 하는 경우 확인란을 선택하지 않은 상태로 유지합니다. 확인을 클릭합니다. 결과를 저장하거나 다음 대화 상자 창에서 최종 데이터를 가져올 경로와 파일 이름을 지정합니다.

대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 수행된 R 코드를 표시하여 분석을 확인합니다. 일부 플롯된 프로파일에 세포외 또는 세포 내 공간에서 과도한 신호가 있는 경우 프로파일 필터링 설정 매크로를 실행합니다. 그런 다음 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정합니다.

각 채널에 대해 파일에서 적절한 intensity threshold를 설정하고 과도한 extracellular 또는 intracellular 신호가 있는 측정값을 제거합니다. intensity threshold가 필드에 적용될 영역을 X 좌표보다 낮거나 큰 값으로 지정한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 데이터 입력에 필터링 사용 확인란을 선택한 상태에서 플롯 프로파일 데이터 매크로를 다시 실행합니다. 이제 이전에 저장한 파일의 데이터를 추가합니다.

모든 이상 프로파일이 성공적으로 제거되었는지 확인하고, 그렇지 않으면 필터링 매개변수를 개선합니다. create model 매크로를 실행하여 보정 데이터를 기반으로 원형질막과 세포질 형광 분포의 모델을 생성합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 호출된 매크로 대화 상자 창에서 매개 변수를 설정한 후 확인을 클릭합니다. 다음 대화 상자 창에서 입력 파일 경로와 이름을 지정하고 수행된 R 코드를 표시하는 대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 분석을 확인합니다.

다음으로, 관심 단백질을 발현하는 세포의 이미지를 처리합니다. 이미지를 가져오고 이전과 같이 분석을 설정합니다. 매끄럽게 하기와 선 너비는 동일해야 합니다.

프로필 측정을 진행합니다. 플로팅하여 프로파일의 정확도를 확인하고 원하는 경우 앞에서 설명한 대로 필터링을 설정합니다. 원형질막과 세포질 사이의 단백질 분할을 계산하기 위해 calculate distribution 매크로를 실행합니다.

입력 데이터 및 모델 소스를 지정하고 최종적으로 데이터 필터링을 설정합니다. 결과 필터링이 필요한 경우보다 잔류 변동성이 더 큰 결과를 제거하려면 확인란을 활성화된 상태로 유지합니다. 개별 프로파일 측정의 신호 분해로 설명할 수 없는 최대 허용 잔류 변동성의 임계값을 지정합니다.

상자 그림을 만드는 데 사용할 수 있는 표본 그룹화 요인을 선택합니다. 확인을 클릭하고, 입력 또는 출력 경로를 지정하고, 수행된 R 코드를 표시하는 대화 상자 창에서 확인을 클릭하여 분석을 확인합니다. 여기에 표시된 것은 식물 단백질을 발현하는 FM 4-64 염색 세포의 이미지이며, 이는 N-미리스토일화 및 포스포이노시티드에 대한 정전기 상호 작용을 통해 원형질막과 관련이 있습니다.

이러한 상호 작용은 워트마닌에 의해 실험적으로 방해되었습니다. N-미리스토일화의 중요성은 N-미리스토일화 부위 역할을 하는 두 번째 아미노산 위치에서 글리신의 돌연변이에 의해 테스트되었습니다. 두 원형질막 결합 능력의 제거 효과는 단백질의 N-말단 도메인을 절단하여 테스트되었습니다.

결과 상자 플롯은 N-미리스토일화 부위의 돌연변이 후 및 약물 처리 후 원형질막 친화도의 감소를 보여줍니다. 이들의 상호 효과는 N-말단 도메인을 제거하는 효과와 비슷합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 분석의 주요 단계를 적절한 순서로 수행하는 방법과 매개변수를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 분석에 따라 얻은 데이터의 통계적 평가를 위해 ANOVA와 같은 통계적 방법을 수행할 수 있습니다. 이 방법은 식물 부유 세포를 위해 개발되었지만, 매끄럽고 명확하게 구별할 수 있는 원형질막이 있는 다른 세포나 조직에도 적용할 수 있습니다.