Name: 감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 배우세요 GABA A 수용체 리간드 발견을 위한 선별 캐스케이드 방법을 Xenopus oocyte와 설치류 뇌 조각을 활용한 전기생리학 기록 기법으로. 이 방법은 선택적이고 효능 높은 화합물 식별에 활용됩니다.

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저자 주 디스 Lengyel, 마리아 Karg, 그레고리우스 Friz, 레이첼 Haab, 로슈에서 마리 클레어 Pflimlin Tifany Schaer 그리고 HiQScreen에서 데보라 Paolucci 그들의 우수한 기술 지원에 대 한 감사.

Xenopus laevis 보관 되어 있으며 제네바 구획 동물 지침에 따라 처리 됩니다.
1. Radioligand 바인딩
<ol><li>
분석 결과 접시의 준비
	<ol>
<li>5mm KCl, 1.25 m m CaCl2, 1.25 m m MgCl2, 120 mM NaCl, 그리고 15 mM Tris; 분석 결과 버퍼의 1.5 L를 준비 HCl로 pH 7.4에 조정 합니다.</li>
		<li>(예를 들어, microcentrifuge 튜브에 980 µ L 분석 결과 버퍼에 10 mM에서 복합 5 µ L) 50.76 µ M에서 테스트할 화합물을 준비 합니다. 잘 사용 하 여 그들 소용돌이 기계 고속 2-5에 대 한 믹스.</li>
		<li>화합물 (10 mM)의 pipetting 1 µ L에 의해 분석 결과 버퍼의 1970 µ L 참조 복합 flumazenil의 사전 희석을 준비 합니다. 잘 사용 하 여 그들 소용돌이 기계 고속 2-5에 대 한 믹스.</li>
		<li>4 4 ° C에서 분석 결과 버퍼 [3H] flumazenil 재고 솔루션을 희석 50ml 폴 리 프로필 렌 튜브에 nM.</li>
		<li>피펫으로 50 µ L/1, 3-11의 96-잘 microplate 접시 레이아웃 그림 2에서 같이 열으로 분석 결과 버퍼의 음.</li>
		<li>플라스틱 50.76 µ M에서 희석 하는 화합물의 73.2 µ L (단계 1.1.2 참조) 접시의 열 12에.</li>
		<li>9 단계를 통해 기하학적 진행을 사용 하 여 각 화합물을 희석 (1E-10 -1E-06 M), 23.12 µ L 전송 볼륨 및 채우기 열 3-11. 철저 하 게 혼합 희석. 모든 희석 후 끝을 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 막 희석
	<ol>
<li>이전는 HEK293 overexpressing 인간의 GABAA 수용 체에서 분리 된 세포 막을 녹여 (0.025-0.15 mg/mL) 실 온 (RT)에서 80 mL 4 ° c.에 분석 결과 버퍼에 정지를 전송 하</li>
		<li>10000-12000 rpm에서 30-40 s 조직 균질 화기와 4 ° C에서 여전히 막 솔루션을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다이아 제 팜 비 특정 바인딩 (NSB) 제어에 대 한 희석
	<ol>
<li>4 m m 다이아 제 팜 5 ml에서 40 µ M의 농도를 분석 결과 버퍼 재고 솔루션을 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반응 시작
	<ol>
<li>4 nM [3H] flumazenil의 50 µ L 96 잘 접시의 각 음에 플라스틱 하 고 얼음 물 용기에 그것을 유지.</li>
		<li>GABAA 수용 체 하위 막 준비 0.5 mg/mL의 단백질 농도를 100 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>50 µ L 40 µ M 다이아 제 팜의 열 2에 플라스틱.</li>
		<li>얼음에 1 시간을 위한 접시를 품 어.</li>
		<li>이후 막 분리 및 방사능 측정을 위한 96-잘 필터 플레이트의 각 잘에서 분석 결과 버퍼의 50 µ L을 추가 하 고 나중에 반응을 중지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
반응을 중지합니다
	<ol>
<li>50 mM Tris HCl, pH 7.4와 세척 버퍼를 준비 합니다.</li>
		<li>96-잘 셀 수확기를 사용 하 여 솔루션을 필터링 합니다. 3 접시를 씻고 잘 당 차가운 세척 버퍼의 300 µ L x.</li>
		<li>플라스틱 필름으로 접시의 바닥을 밀봉 하 고 섬광 액체에 대 한 칵테일의 40 µ L 추가 섬광 각 계산 잘 하 고 70% 에탄올으로 그것을 닦아.</li>
		<li>실시간에서 적어도 1 시간에 대 한 접시를 부드럽게 흔들어 그것은 실시간에 적어도 다른 시간 동안 서 보자</li>
		<li>섬광 카운터에 접시를 두어서 (CPM)에서 방사능을 측정 합니다. 잘 당 3 분에 대 한 측정을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 분석
	<ol>
<li>8에 대 한 평균 비 특정 바인딩 (NSB)과 총 바인딩 (TB) 또한 중복 또는 샘플의 triplicates의 복제를 확인 합니다. 다음 식에 따라 각 샘플의 평균에 대 한 % 특정 바인딩 (SB)을 계산. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> 여기, 총 SB NSB 의미뺀 평균 TB =.</li>
		<li>억제제 농도 abscissa %SB 대 누진에 플롯 합니다. 단일 사이트 경쟁 분석 방정식을 사용 하 여 데이터를 맞춤: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> 여기, y = SB, % A = y, 최소 B = y, 최대 C = IC50 X = 경쟁 화합물의 농도의 로그10 D = (힐 계수) 곡선의 기울기.</li>
		<li>계산 절반 최대한 억제 농도 (IC50)를 사용 하 여 바인딩 선호도 (기)의 각 막9, 및 [3H]의 농도 [3H] flumazenil 분리 상수 (Kd) 다음 데이터를 사용 하 여 방정식에 따라 분석 결과에서 flumazenil: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 수용 체 표현과 Xenopus Oocytes에서 레코딩
<ol><li>수확 하는 난소와 oocyte 준비
	<ol>
<li>준비와 88 mM NaCl, 1 m KCl m, 2.4 m m NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.82 m m MgSO4.7H2O, 0.33 m m Ca (3)2.4H2O, 0.41 m m CaCl2.6H2O, pH 7.4에 살 균 바르트 솔루션 페니실린, 100 µ g/mL 스 고 암포 b 0.25 µ g/mL의 100 단위/mL으로 보충</li>
		<li>88.5 mM NaCl, 2.5 m m KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6H2O, pH 7.4에서 1 x OR2 매체 (없음 CaCl2)를 준비 합니다.</li>
		<li>냉각 (150 mg/L, pH 7.4에 조정의 농도)에서 Tricaine methanesulfonate 및 나트륨 중 탄산염 (300 mg/L)에 20 분에 대 한 깊은 마 취에 의해 여성 Xenopus Laevis 잘린 뒤 희생.</li>
		<li>깨끗 한가 위, 집게와 빠르게 난소를 수확 하 고 배치 2-접시 (10 cm)에 바스 솔루션 및 항생제/antimycotic x 1의 40 mL로 가득.</li>
		<li>4 ° c.에 바스 솔루션에서 최대 2 주 동안 비 해리 난소를 저장</li>
		<li>분리, 작은 분수 (1-2 cm3)에 깨끗 한 면도날으로 난소를 잘라 고 CaCl2 (OR2-noCaCl2) 없이 OR2 매체의 50 mL에 0.2% 콜라를 포함 하는 그들을 품 어 (유형 I) 100 mL 회전자에 17-19 ° c 4-5 헤 마그네틱 바는 확인에 대 한 느린 동요와 플라스 크는 oocytes 분쇄 피하기 위해 회전자 술병의 바닥 위에 약 3-5 cm 배치.</li>
		<li>Oocytes는의 대부분이 그들의 뿌리에서 해제 확인 후 4-5 h (즉, 그들은 주위에 수영 개별적으로). 그들을 세척 5 x 1.8 m m CaCl2보충 OR2의 200 mL와 함께.</li>
		<li>전송 defolliculated-접시 (10 cm)에 oocytes 바르트 솔루션 및 항생제/antimycotics 채워지고 적어도 하룻밤 cDNA 또는 mRNA 주입 전에 17 ° C에서 그들을 유지.</li>
		<li>다음 하루 선택, 쌍안경, 건강 oocyte는 명확 하 고 뚜렷한 동물 대 식물성 극 (식물성 극에 대 한 밝은 노란색 대 동물 극에 대 한 짙은 갈색) 제시 아래. 깨끗 한 파스퇴르 펫을 사용 하 고 살 균 원뿔 주입 96 잘 접시에 하나 하나 oocytes를 처분. 참고: mRNA 주사; oocytes의 배치에 특별 한 관심 필요 반면, cDNA 주사는 oocytes 위 동물 극 방향에 없어서는 아니다.</li>
	</ol></li>
	<li>mRNA 또는 cDNA 자동 주입
	<ol>
<li>권장된 지침에 따라 상용 키트를 사용 하 여 mRNAs를 음성 합성. 악기와 RNase와 테이블을 청소 하 고 적절 한 보호 장갑을 착용. 참고:는 mRNA의 품질 좋은 식 수익률 결정 이며 주입 절차 동안 mRNA 저하를 방지 하기 위해 불가결 이다.</li>
		<li>CDNAs 상용 키트를 사용 하 여 준비 하 고 0.2 µ g / µ L의 농도에서 bidistilled 물에 원하는 금액을 디졸브.</li>
		<li>0.02-0.2에서 배열 하는 농도에서 cDNA 솔루션의 0.2 µ g / µ L, 또는 10 nL의 농도에 mRNA 솔루션의 10-50 nL 주사 µ g / µ L, 95 oocytes의 일괄 처리에 좋습니다.</li>
		<li>막에 대 한 여러 소 단위 (즉, heteromeric α1β2γ2 GABAA 수용 체), 필요한 단백질 혼합 해당 mRNAs 또는 cDNAs 원하는 비율에 (즉, 1:1:1 또는 1시 10분: 1).</li>
		<li>oocyte oocytes;에 의해 열 충격 단백질의 표현을 방지 하 17 ° C에서 유지 미 판 온도 제어 저장 영역에 저장 합니다.</li>
		<li>OR2 바인딩 분석 결과 0.1-1000에 긍정적인 테스트는 테스트 화합물 분해 electrophysiological 녹음을 위한 µ M 96 잘 플랫 바닥 폴 리 프로필 렌 플레이트에 떨어져 그들을 처분.</li>
	</ol></li>
	<li>식에 대 한 플라스 미드
	<ol>
<li>세균성 T7 또는 T6 promotors와 mRNA 합성에 대 한 상용 키트의 사용 설명서에 따라 고 솔루션의 20 µ L에서 0.2 µ g / µ L RNase 무료 물에.</li>
		<li>20 µ L 일반적으로 0.2 µ g / µ L bidistilled 물에 용 해에 cDNA 식에 대 한 진핵생물 식 벡터를 포함 하는 솔루션의 준비.</li>
	</ol></li>
	<li>Oocyte의 품질의 시각화에 microinjection
	<ol>
<li>플라스 미드를 포함 하는 솔루션의 10-50 nL 주사 (단계 2.3.1 또는 2.3.2 참조) micromanipulator 압력 방출 시스템 또는 자동된 주입 시스템을 장비에 장착 팁 직경 최대 100 µ m에 이르는 유리 마이크로 주입 바늘을 사용 하 여. 참고: 여기서 설명 하는 예제에 oocytes 95 cDNA 또는 mRNA와 함께 사용 하기 위해 적합 한 자동화 시스템의 배치에 의해 주입 됩니다.</li>
		<li>1% 메 틸 렌 블루 등 염료의 1 µ L로 주입 바늘을 oocytes (cDNA에 대 한 핵 또는 세포질 mRNA에 대 한) 표준 절차를 사용 하 여 주입.</li>
		<li>끓는 물에 약 1 분 동안 주입 된 oocytes를 삭제 합니다. oocytes는 눈 아래 면도날으로 반으로 잘라. 참고: 염료 그림 3E, 주사의 정확한 관찰을 수 있도록 지역화 된 남아 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2 전극 전압 클램프 녹음
	<ol>
<li>그림 4에 나와 있는 원칙을 사용 하 여 자동화 시스템에 oocytes를 포함 하는 잘 접시를 놓습니다. 참고: 그림 5에 나와 있는 패치 클램프 시스템 달리 셀의 진정한 막 잠재력은 읽을 전압 전극.</li>
		<li>예를 들어 그림 6 에 나와 있는 농도 활동 관계의 결정에 대 한 체계와 아이콘 기반 인터페이스를 사용 하 여 자동된 기록 시스템 프로그램.</li>
	</ol></li>
	<li>커브 피팅
	<ol>
<li>그림된 농도 활성화 곡선을 사용 하 여 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석, 주 작동 근 농도의 로그값의 기능으로 현재 진폭을 플롯 합니다.</li>
		<li>장착 하실 수 있습니다 이후에 경험적 힐 방정식 형태로 자형 곡선 관찰: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> 여기, Y= 갖는 전류, 분수 EC 50 = 50% 정품 인증에 대 한 농도 x 는 화합물의 농도 = nH = 힐 계수 또는 명백한 cooperativity.</li>
		<li>각 응답 대 값 셀의 시리즈에서 얻은 데이터를 분석 하는 가장 높은 농도에서 기록의 진폭을 분할 하 여 화합에 전류를 정상화.</li>
		<li>평균 및 표준 오류를 확인 하 고 실현 standardly 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여 커브 피팅.</li>
	</ol></li>
</ol>3. electrophysiological 녹음 뇌 조각
참고: Hippocampal 쥐 조각 국가 및 기관 지침에 따라 준비가 되어있습니다.
<ol><li>
해 마 조각의 준비
	<ol>
<li>준비와 124 m NaCl 124 m, 2.5 m m KCl, 1.25 m m KH2포4, 2mm MgSO4.7H2O, 2.5 m m CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, 포도 당 10 m m, 4 m m 절 개 인공 세리 척추 유체 (dACSF) 자당 95% O2 , 5% CO2의 혼합물과 병에 기름.</li>
		<li>준비와 124 mM NaCl, 5mm KCl, 1.25 m m KH2포4, 2mm MgSO4.7H2O, 2.5 m m CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3, 10 mM 포도 당 기록 인공 세리 척추 유체 (rACSF) 95% O2 , 5% CO2의 혼합물과 병에 기름.</li>
		<li>2.5 %isoflurane 순수한 산소의 혼합물을 사용 하 여 쥐를 anesthetize 하 고 그들을 목을 벨.</li>
		<li>가 위의 좋은 쌍 중간 선 다음 두 피를 잘라. 기본 조직 손상 없이 중간 선 따라 두개골을 잘라. 핀셋으로 두개골을 제거 하 고 정밀한 주걱을 사용 하 여 푸 두뇌 다.</li>
		<li>RT에 기름된 dACSF 솔루션에 두뇌를 놓고 잘 주걱으로 왼쪽된 hippocampal 형성을 해 부 합니다.</li>
		<li>조직 헬기와 해 마의 중간 부분에서 가로 분할 영역 (400 µ m 두께)을 잘라내어 그림 브러시를 사용 하 여 녹음 실로 그들을 전송. 45 분에 대 한 실시간에 슬라이스를 유지 합니다.</li>
		<li>35 ° C에서 기름된 rACSF와 조각 perfuse 그리고 1.5 mL/분의 속도로 거품 95% O2 , 5% CO2의 혼합물으로 솔루션. 참고:이 단계를 후 슬라이스 electrophysiological 실험 준비 되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
단일 인구 스파이크 녹음
	<ol>
<li>현미경 실장 챔버로 두뇌 슬라이스를 놓습니다.</li>
		<li>RACSF와 3 mL/min의 속도로 조각 perfuse</li>
		<li>~ 2 m ω의 저항을 데 피 펫 끌어당기는 사람와 붕 규 산 유리 제 micropipette를 당겨. 참고:이 micropipette 기록 전극으로 사용 되 고 전기적으로 증폭기에 연결.</li>
		<li>2 M NaCl을 포함 하는 솔루션으로는 micropipette와 앰프의 피 펫 홀더에 놓습니다.</li>
		<li>위치 기록 micropipette 지층 pyramidale CA1 지역에서 사용 하 여 오른쪽 micromanipulator hippocampal 조각의. 참고: 위치 개요로 그림 7에 표시 됩니다.</li>
		<li>절연된 바이 폴라 백 금/이리듐 전극을 홀더 왼쪽된 micromanipulator에 넣으십시오. 참고:이 전극 자극 전극으로 사용 되 고 전기 자극 발생기에 연결 된.</li>
		<li>자극 전극 CA1 영역의 Schaffer 민간인에의 위치 사용 하 여 오른쪽 micromanipulator hippocampal 슬라이스입니다. 참고: 위치 개요로 그림 7에 표시 됩니다.</li>
		<li>모든 30 자극 발생기를 사용 하 여 자극 전극에 전류 펄스를 전달 s (100 µs 기간, 10 µ A에서 시작) 인구 스파이크 (PS)이 나타날 때까지 자극 강도 점차적으로 증가 하 고.</li>
		<li>얻을 수 있는 최대 진폭의 45%에 해당 하는 PS를 보여주고 자극 강도 조정 합니다. PSs는 2.4 KHz에서 필터링 및 신호 증폭기를 사용 하 여 20 KHz에서 디지털화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
짝 펄스 억제
	<ol>
<li>뇌 조각 (3.1 단계)를 준비 하 고 앞에서 설명한 진행 (단계 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>모든 30 자극 전극에 2 개의 전류 펄스 (100 µs 기간 20 ms 간격) 전달 자극 발생기를 사용 하 여 s. 최대 진폭의 45%에 해당 하는 PS를 연상을 자극 강도 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
테스트 컴파운드
	<ol>
<li>기름된 실제에서 테스트 하는 화합물의 희석 하 게 되도록 하지 0.1% 보다 높은 DMSO의 최종 농도.</li>
		<li>복합 솔루션에서 보다 동일한 농도에서 제어 솔루션에 DMSO를 추가 합니다.</li>
		<li>(3.2 단계) 단일 기록 또는 쌍 펄스 (단계 3.3) PS Schaffer 부수적인 stimulations에 의해 갖는 모든 30 적어도 30 분에 대 한 s. PS 모양이 기준 기간 동안 안정 되어야 합니다.</li>
		<li>기름된 rACSF 포함 테스트할 화합물의 농도 고정된으로 비 커를 준비 합니다.</li>
		<li>여전히 단일 또는 펄스 쌍 추를 기록 하는 동안이 솔루션으로 hippocampal 조각 perfuse</li>
		<li>Perfusing 화합물 없이 기름된 rACSF와 슬라이스 하 여 복합 효과에서 복구를 평가 합니다. 참고: 가역 효과, PS 복합 응용 프로그램 전에 초기 기간 동안 관찰의 초기 모양에 되돌립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 분석
	<ol>
<li>평균 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 4의 블록에 실험 동안 PS 추적 기록.</li>
		<li>평균된 추적의 PS 진폭을 측정 합니다.</li>
		<li>화합물을 perfusing 하기 전에 10 분을 기록 하는 초기 계획 값의 백분율은 진폭을 정상화.</li>
		<li>± SEM. 의미는 데이터를 표현</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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프레데리크 Knoflach와 마리아 Clemencia 에르난데스 저자 F. 호프만-라 로슈 AG, 4070 바젤, 스위스, 제약 회사의 직원은. 저자 다니엘 Bertrand HiQScreen Sàrl 6, rte의 직원은 드 Compois, 1222 Vésenaz 제네바, 스위스, 제약 회사에 상영 시설을 제공.

소설 화합물 등 GABAA 수용 체 ligand 문을 단 이온 채널 활성의 개발 여러 방법 사용을 해야합니다. 일반적으로, 첫 번째 단계는 종종 사용 하 여 실시 바인딩 분석; 그러나, 이러한 측정 화합물 또는 그것의 정확한 약리학의 생리 적인 활동을 특성화 하기 위해 충분 하지 않습니다. 특히, 수용 체에 묶는 화합물 수 있습니다 강화의 기능을 억제 또는 아무 기능 효과 (자동 수)를 생산 (즉, 해당 기능을 수정 하지 않고 수용 체에 바인딩). 따라서, 기능 테스트는 전체 복합 특성화에 대 한 필요 합니다.
바인딩 분석: 바인딩 분석 결과의 주요 장점은 그것 수 효율적으로 실시 몇몇 수천까지 샘플의 많은 수와 활성 분자에 대 한 바인딩 선호도 제공 하. 여기에 설명 된 대로 첫 번째 단계는 원하는 수용 체의 평가 방법 구축 이루어져 있다. 즉, 분수 또는 전체 두뇌에서 네이티브 수용 체에 바인딩을 수행할 수 있습니다, 하는 동안 그러한 방법의 특정 수용 체의 하위에 선호도 결정이 되지 것입니다. 그것은, 따라서, 원하는 대상에 화면 분자 재조합 형 시스템을 사용 하는 데 필요한입니다. 요즘, 셀 라인에서 원하는 수용 체 소 단위 cDNAs의 일시적 또는 안정 되어 있는 transfection 관심(, GABAA α5β3γ2)의 수용 체 하위를 표현 하는 효율적이 고 안정적인 방법을 제공 합니다. 전통적인 바인딩 분석 실험을 사용 하지만 요즘 기술은 radioligands의 사용할 수 있는 방사능 (예를 들어, 양적 형광 기반의 ligand 바인딩) 처리의 불편 방지.
호스트 시스템에서 기능 식: 호스트 시스템에서 유전자를 표현 하기 위해 관심사의 코딩 순서는 적절 한 promotors를 포함 하는 플라스 미드에 삽입 되어야 합니다. 일반적으로 mRNA 합성 체 외에 세균성 T7 또는 T6 promotors 사용 된다. CDNA 표현에 대 한 관심사의 유전자의 전사는 CMV (세포) 또는 이와 동등한 등 진핵생물 promotor에 의해 규제 해야 합니다. 요즘, (즉, pUNIV, pCMV 6AC, psf-CMV/T7, pCI-네오, pcDNA), 2 명의 promotors를 포함 하 여 몇 plasmids mRNA의 생체 외에서 합성 또는 cDNA 식 그림 15와 같이 사용할 수 있습니다. 셀 라인 또는 Xenopus oocytes GABAA 수용 체의 식은 충실히 얻어질 수 있다. 후자의 주요 장점은 생 수용 체 식, 조작, 단순 하 고 마이크로 주사 및 기록에 대 한 자동화 된 시스템의 가용성의 부족입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 절차는 약 7 분에 96 oocytes의 주입을 허용 하며 micromanipulation 기술을 자동화 시스템의 효율성을 보여줍니다. Xenopus 에서 단일 난소 10000-30000 oocytes 사이 포함 기억, 그것은 분명 하나의 준비에 셀 측정의 많은 수를 수행할 수 있습니다. 또한, 식 cDNA 주사를 사용 하 여 실시 될 수, 바인딩 실험을 위해 개발 된 관심사의 유전자를 포함 하는 동일한 플라스 미드 사용할 수 있습니다 더 분자 생물학에 대 한 필요 없이 기능적 특성에 대 한 조작입니다.
그 큰 규모와 높은 표면 식을 감안할 때, 단일 oocyte는 약 35 mm 페 트리 접시에에서 confluent 세포 수용 체의 수를 생성 합니다. 그러나, oocytes 준비와 주입 실험 하지 않아도 특정 배양 및 무 균 조작으로 셀 라인의 비용의 일부만을 나타냅니다. GABAA 채널의 활성화 몇 picoamperes (10-12) 및 전류 되 (10-6)의 최대 수만 쉽게 확인의 몇몇 수백만의 부수적인 활동 단일 oocyte에서 기록 하나의 응답 중 수용 체입니다.
Ligand 문을 단 이온 채널의 특성에 첫 번째 단계는 종종 수용 체의 명백한 선호도의 결정입니다. 간단한 주 작동 근 테스트 펄스의 시리즈를 적용 하 고 진폭에서 evoked의 현재 또는, 특정 경우에 주 작동 근 농도의 로그값의 기능으로 (AUC) 곡선 아래의 영역을 계획 실시 하는 실험에 의하여 이루어져 있다. 그것은 쉽게 다른 플라스 미드 농도 및 비율 oocytes의 동일한 배치에서 microinject 가능한, 식의이 시스템은 특히 같은 특성화에 적합 합니다. 또한, 일괄 배치 비교 다른 EC50s에 대 한 안정성의 높은 학위를 밝혔다. 수용 체의 명백한 선호도에 소 단위 구성의 영향 쉽게 그림10에서 exemplified로 거미 플롯을 사용 하 여 시각 이다.
2 전극 전압 클램프 Xenopus oocytes에서 얻은 결과 패치 클램프 전극을 사용 하 여 만든 녹음 종종 비교 된다. 이러한 두 시스템 간의 자세한 비교로가이 작품의 범위를 넘어 갈 것 이라고, 반면 몇 가지 포인트는 시험 될 수 있다. 패치 클램프 셀에서 생물 특성 빠른 약물 응용 프로그램에 대 한 장점을 제공, 그 요구 사항을 Xenopus oocytes에서 두 전극 레코딩 보다 더 복잡 한 있습니다. 첫 번째 비 사소한 어려움을 세포 배양, 과도 또는 안정 되어 있는 transfection에의 필요와 원하는 구조를 표현 하는 셀의 식별 주어진된 단백질의 표현 이다. 또한, 고려 셀에 생 식의 가능한 기여 검사에 없어서는 아니다. 또한, 패치 클램프 기록 그 사람 또한 필요가 있다, 예를 들어 인감의 품질을 평가 하는 실험 기간 동안 적절 한 분석을 수행 하는 동안 고배율 현미경 micromanipulation를 수행 하는 숙련 된 사람이 필요 합니다. 액세스 저항 반면, 기록, 특히 하나는 자동화 된 electrophysiological 시스템을 사용 하 여 두 전극 전압 클램프 등 특정 능력을 필요로 하지 않습니다 그리고 실험실 기술자에 의해 실시 될 수 있습니다.
Electrophysiological 설정, 취득 하는 경우 비용 고려 사항은 확실히 신중 하 게 분석 되어야 하는 중요 한 요소 이다. 예를 들어 자동된 시스템의 비용이 상대적으로 높은 반면, 가까이 비교 보여 완전 한 electrophysiological 장비 설치는 관류, 증폭기, 눈 렌즈, 좋은 micromanipulators 장비 구매 포함 시스템, 고도 데이터를 수집 하 고 분석을 수행 하는 동안 진동 방지 테이블. 비용 비교는 2 전극 전압 클램프 설정 대 패치 클램프 설정 더욱 차이 보여준다. 또한, 자동화 시스템 완전 자동화 된 장비의 이점을 제공 하 고 주 야 무인 실행 됩니다.
화합물의 약리 속성은 수용 체에 행동의 모드에 의해 결정 됩니다. 예를 들어 경쟁 억제제는 동일한 바인딩 주머니, 또는 orthosteric 사이트를 입력할 수 있는 분자 자체 주 작동 근 발생 경쟁. 비 경쟁 억제제는 입력 하 고 예를 들어 이온 기를 차단 수 있는 ligand 문을 단 이온 채널의 경우, 그리고 다른 사이트에서 상호 작용 하 여 수용 체를 억제 하는 화합물. 그것은 상호 작용의 다른 메커니즘을 검사 하는이 작품의 범위를 넘어 갈 것 이라고 하지만 추가 정보 약리학 교과서에서 또는 베르트 랑과 베르트 랑의22등 다른 직장에서 얻을 수 있습니다.
Allosteric 변조기의 경우는 분자의 존재 하지만 orthosteric 사이트에서 사이트에 복합 바인딩 상태와 다른 상태 사이 에너지 장벽을 수정 합니다. 긍정적인 allosteric 변조기 (PAMs) 화합물을 활성 상태로 휴식에서 에너지 장벽을 줄일 수 있으며, 따라서는 주 작동 근의 효과 향상. PAM 효과 가능 하, 그것은, 따라서, 화합물에 노출 하는 주 작동 근 응답을 향상 시켜 고, 만약 그렇다면, 어떤 농도에서 결정 하는 데 필요한. 그림 11 및 그림 14 에 실험 GABAA 수용 체에 PAMs 특성에 대 한 성공적으로 사용할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다.
경우에 따라 혼자 PAM에 노출 수용 체를 활성화 하는 충분 한 수 있습니다. 이러한 활동은 여기에 제시 된 실험 프로토콜의 약간의 수정에 의해 확인할 수 있습니다. 즉, GABA에 노출 동안 변조기의 공동 응용 프로그램을 사용 하는 대신 프로토콜 수정할 수 있습니다 첫 번째 응용 프로그램에 대 한 혼자 그리고 GABA의 화합물. 직접 주 작동 근 활동의 특성 자체는 화합물에 의해 불러 일으켰다 고 GABA 갖는 전류에 비해 응답의 진폭의 결정에 의해 이루어집니다.
그림 7에 나와 같이 뇌 조각에서 실시 한 실험 동물 모델 및 임상 시험으로 통로 더 진행 하기 전에 명확한 억제 회로에 네이티브 수용 체에 복합 활동을 확인 하는 데 사용 됩니다. 비교적 간단한 데이터 기록 및 분석 프로토콜 PS 진폭에 그들의 차동 modulatory 효력을 평가 하 여 여러 화합물의 순위를 수 있습니다. GABA 시스템에 관련 되지 않는 화합물의 일반적인 효과 검색 (예를 들어, PS 모양에서 변화를 관찰 하는 때) 있을 수 있습니다. 직접, GABAergic neurotransmission 수 부과이 경우 전체 셀 패치 클램프 기술8를 사용 하 여 금지 postsynaptic 현재 (Ipsc)에 화합물의 효과 측정 하 여.

여기, 우리 생리학과 약리학을 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물의 발견에 대 한 프로토콜 제시. GABAA 수용 체에 대 한 특정 비 발한 분자에 대 한 검색, 그것은 정의에 중요 한, 가능한 한 정확히, 관심과 새로 확인된 된 화합물의 특이성의 평가의 하위 유형 (예, 검토를 위해 루돌프를 참조 및 Knoflach1또는 Sieghart2). 약물 발견 및 달성 하는 데 필요한 단계는 일반적인 경로 그림 1에 설명 됩니다.
바인딩 분석 실험 이었고 여전히 크게 약물 발견의 첫 번째 단계로 사용 됩니다. GABAA 수용 체의 경우 그들은 다이아 바인딩 사이트에 수용 체의 치료로 유용 하 고 안전한 약물 바인딩할 바인딩 하는 화합물을 식별 하기 위해 최적화 되어 있다. Fluorometric 이미징 플레이트 리더 (FLIPR) 막 잠재적인 붉은 염료 기반 분석3를 사용 하 여 다른 기술을 추가 하는 사이트를 보다 적게 바람직한 그들의 원치 않는 부작용 단면도 때문에 바인딩되는 바비 같은 화합물을 감지 합니다. 또한, 사용된 염료 직접 GABAA 수용 체, 따라서 약물 발견4에 대 한 이러한 분석의 유틸리티 질문을 활성화할 수 있습니다. 바인딩 분석만 주어진된 화합물은 특정 수용 체 클래스를 바인딩할 수 있는 증거를 제공할 수 있습니다. 생체 외에서 세포 막과 분석 선택적 인간의 GABAA α5β3γ2 수용 체 ligands를 식별 하기 위해 사용 됩니다. 인간의 GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2, 및 α3β3γ2 수용 체를 표현 하는 정도 transfected HEK293 세포는 이러한 분석에 대 한 막 준비 하는 데 사용 됩니다. ligands의 효과 [3H] flumazenil 막 수용 체 [3H] flumazenil 바인딩 (억제)에 바인딩된의 섬광을 측정 하 여 검출 된다. 이 기술의 주요 장점은 관심의 수용 체에서 화합물 바인딩 선호도의 신속 하 고 효율적인 결정 관심의 수용 체에서 제공 됩니다.
기능 연구는 화합물의 기능 활동을 평가 하 고 수용 체 화합물의 바인딩에 의해 발생 메커니즘의 생리 및 약리 설명을 제안 필수적입니다. 오늘, 그것은 잘 인식 기능 GABAA 수용 체 이온 기 공 및 5 개의 동일한 소 단위의 어셈블리에서 결과 의해 형성 하는 pseudosymmetry의 한 축을 5 subunits의 어셈블리에서 유래. GABAA 수용 체의 대부분 두 개 이상의 다른 소 단위 구성 됩니다. 주요 뇌 GABAA 수용 체, 예를 들어, 구성 된다 2, 2, 1의 산출할에서 α1, β2, 및 γ2 소 단위 각각5,6. Xenopus oocytes 또는 HEK293 세포 같은 호스트 시스템에 재구성 빠르게 수용 체의 약리학 적인 속성을 탐구의 가능성을 제공 합니다.
화합물의 약리 속성 다음 뇌 조각7에 extracellular 녹음으로 탐구 된다. 이 방법은 neurotransmission에 화합물의 효과의 탐사를 허용 하며 전체에서 네이티브 수용 체의 수준에서 분리 식 시스템에서 결정 하는 화합물의 기능 효과 확인 하는 효과적인 방법 신경 환경입니다. GABAergic neurotransmission 금지 postsynaptic 전류 (Ipsc)8에 화합물의 효과 측정 하 여 분자 수준에서 평가 될 수 있습니다. 그러나 여기에 사용 되 고 뇌 조각에 전체 셀 패치 클램프 기록에 따라 프로토콜 더 정교 하 고 낮은 처리량 생성.
마지막으로, 강점과 약점은 생체 외에서 α5β3γ2 선택 ligands의 식별을 위해 사용 하는 캐스케이드 차단의 다른 기술 그리고 그들의 본질적인 한계의 관점에서 설명 되어 있습니다. 이 작품은 전문가 비-전문가 도움이 검토 다른 시험관에 접근의 조합의 태 클이 ligand 문을 단 이온 채널의 새로운 변조기의 발견 하는 데 사용 하는 GABAA 수용 체의 분야에서 제공 해야 합니다.

<table><tbody><tr><td>General equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 웰 셀 하베스터 -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>결합 방사선 리간드가 있는 멤브레인을 필터링하려면</td></tr><tr><td>Microtiter 플레이트 액체 섬광 카운터(Top Count NXT)Packard</td><td></td><td></td> <td>Microplate 섬광 및 발광 계수기</td></tr><tr><td>바이알 액체 섬광 계수기(Beta-Couter 2500 TR)</td><td>Packard</td><td></td><td>바이알 섬광 및 발광 계수기</td></tr><tr><td>액체&nbsp; 핸들러(Biomek 2000)</td><td>Beckman 쿨터</td><td></td><td>화합물 희석액을 제조하려면</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>화합물 원료 용액을 혼합하려면</td></tr><tr><td>조직 균질화기(Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>멤브레인 제제를 재현탁하려면</td></tr><tr><td>XLfit5 소프트웨어</td><td>Microsoft Excel &nbsp; IDBS</td><td></td>의 애드온 <td>곡선 피팅 소프트웨어</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix</td><td>-</td><td>전극 풀러</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>다중 채널 시스템</td><td>-</td><td>자동 주입(Xenopus 난모세포)</td></tr><tr><td>HiClamp</td><td>다중 채널 시스템</td><td>-</td><td>자동 전압 클램프(Xenopus Ooocytes)</td></tr><tr><td>데이터마이닝</td><td>다중 채널 시스템</td><td>-</td><td>데이터 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Data</td> <td>Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>저잡음 데이터 수집 시스템</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 또는 동급의</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>프로그래밍 가능한 신호 컨디셔너</td></tr><tr><td>pClamp 프로그램 제품군</td><td>분자 장치</td><td></td><td>데이터 수집 및 분석을 위한 소프트웨어 소프트웨어</td></tr><tr><td>Antivibraton 테이블&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>미세 전극 진동을 피하기 위해&nbsp;</td></tr><tr><td>Patchstar Micromanipulators</td><td>Scientifica</td><td></td><td>뇌 절편에 미세전극을 정확하게 위치시키기 위해</td></tr><tr><td>Faraday Cage&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>소음으로부터 녹음을 격리하기 위해</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>뇌 조각을 준비하려면</td></tr><tr><td>붕규산 유리 마이크로피펫&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>뇌 절편에 세포 외 전위를 기록하기 위해</td></tr><tr><td>트위스트 페어, 백금 이리듐 와이어 자극 전극</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>전류로 뇌 절편을 자극하기 위해</td></tr><tr><td>전류 및 전압 구동 자극을 위한 자극 생성기</td><td>MultiChannel Systems</td><td>STG4000</td><td>자극 전극</td></tr><tr><td>에 전류를 전달합니다.Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter plate round bottom</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>결합 분석</td></tr><tr><td>GF/C 유리섬유 필터 바닥 96웰 microplate with 1.2 &micro; m poresize, 진공 매니폴드웰 필터를 사용한 세포 수확 분석용&nbsp;</td><td>패커드&nbsp;</td><td>결합</td><td>분석 50</td></tr><tr><td>mL 튜브</td><td>Falcon에 사용되는 #6005174;</td><td>결합 분석에 사용되는</td> <td>#352070</td></tr><tr><td>Safe-lock 튜브 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>결합 분석에 사용되는</td></tr><tr><td>Safe-lock 튜브 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>결합 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>선적 튜브 180 mL&nbsp;</td><td>세마데니 유럽 AG&nbsp;</td><td>#3722</td>는 <td>결합 분석에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>포니 바이알 폴리에틸렌 6 mL&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>결합 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>Top Seal&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>결합 분석</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco BELLCO</td><td># 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&nbsp; 웰 플레이트(원추형)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>난모세포용 주입 플레이트</td></tr><tr><td>96&nbsp; 웰 플레이트 (평평한 바닥)</td><td>Corning (Vitaris Switzerland)</td><td>3364-cor</td> HiClamp 유리 모세관 <td>용 복합 플레이트</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hilgenberg (독일)</td><td>-</td><td>붕규산 유리 1.2 O.D. 0.76 I.D. 필라멘트 포함</td></tr><tr><td>RNA 준비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>in vitro 합성</td></tr><tr><td>화학 물질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분석 버퍼: KCl 5mM; CaCl2 1.25 mM; MgCl2 1.25 밀리미터; 염화나트륨 120 mM; Tris 15 mM pH는 HCl로 7.4로 조정됩니다. 4°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.</td><td></td><td></td><td>결합 분석에 사용</td></tr><tr><td>세척 버퍼: Tris 50 mM -HCl pH 7.4, 4°C에서 보관.</td><td></td><td></td><td>결합 분석에 사용</td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td>에서 테스트 화합물의 재고 용액 <td>10 mM 결합 분석에 사용</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM DMSO</td><td></td><td></td>에서 Diazepam <td>바인딩 분석에 사용</td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td></td>에서 4 mM <td>결합 분석에 사용</td></tr> <tr><td>[3H]-Flumazenil 60-85 Ci / mmol in Ethanol; -20 °C에서 보관; C</td><td></td><td></td><td>결합 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>패커드&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>결합 분석에 사용됨</td></tr><tr><td>Ultima Gold&nbsp;</td><td>퍼킨 엘머&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>결합 분석에 사용됩니다</td></tr>: <tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>항생제 / 항진균제</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma Sigma</td><td># C1030</td><td>Collagenase Type I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>인공뇌척수액용 염(NaCl, KCl 등)</td><td></td> 다른 인간 GAB<AA 수용체 아형을 과발현하는 일시적 또는 안정적으로 형질주입된 HEK293의 Sigmastrong<td></td><td></td></tr><tr><td>>Membranes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frozen membranes: &alpha; 1&베타; 3&감마; 2, &알파; 2&베타; 3&감마; 2, &알파; 3&베타; 3&감마; 2, &알파; 5&베타; 3&감마;2. 자세한 방법은 Ballard et al. 2009를 참조하십시오.</td><td></td><td></td><td>결합 분석에 사용</td></tr></tbody></table>

감마-aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 neurotransmission 입력

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

심사에 대 한 단계별 프로토콜 감마 aminobutyric에서 화합물이 원고 선물 산 입력 (GABAA) 수용 체와 소설 분자 생체 외에서 재조합에서 전 임상 분석 실험에서 활성의 id로 사용 설치류 두뇌 조각에서 네이티브 수용 체에 그들의 약리 효과 수용 체 화합물은 수용 체의 다이아 사이트에서 바인딩에 대 한 첫 단계는 주요 GABAA 하위를 표현 하는 세포 막에 radioligand 바인딩 분석 실험 개발으로 구성 된 기본 화면 설정입니다. 다음, Xenopus oocytes 또는 HEK 293 세포에서 설치류와 인간의 GABAA 수용 체의 분리 식의 이용, 그것 가능 하다 electrophysiological 분석에 다른 수용 체의 생리 적인 속성을 탐구 하 하위 및 확인 된 화합물의 약리 속성. Xenopus oocyte 시스템이 나타납니다 여기는 oocytes 그리고 2 전극 전압 클램프를 사용 하 여 약리 특성까지 다른 mRNAs와 그들의 microinjection의 격리로 시작. 마지막으로, 설치류 두뇌 조각에서 실시 하는 녹음 설명 합니다 보조 생리 테스트로 잘 정의 된 신경 회로에 그들의 네이티브 수용 체에 분자의 활동을 평가 하기 위해 사용 되는. 여러 뉴런의 인구 응답을 사용 하 여 세포 외 녹음 가지 약물 응용 프로그램 함께 보여 줍니다.

여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

이 비디오의 전반적인 목표는 새로운 GABA-A 수용체 리간드를 발견할 수 있는 스크리닝 캐스케이드를 설명하는 것입니다. 방사성 리간드 결합, xenopus 난모세포 및 설치류 뇌 절편에서 전기생리학적 기록을 문학적 방식으로 사용하는 이점은 화합물의 프로필을 개선할 수 있다는 것입니다. 궁극적으로 강력한 아형, 선택성 및 효과적인 화합물이 확인됩니다.이 시연은 쿠미코 캄바라(Kumico Kambara)와 제나 토그나치니(Jenna Tognaccini), HiQScreen의 소니아(Sonia)와 다니엘 베르트랑(Daniel Bertrand), 로슈(Roche)의 마리 클레어 플림린(Marie Claire Pflimlin)이 수행합니다. 압력 배출 시스템 또는 자동 주입 시스템이 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 팁 직경이 최대 100마이크로미터인 유리 미세 주입 바늘을 사용하여 플라스미드를 함유한 용액 10-50나노리터를 주입합니다. 이 절차를 시작하려면 난모세포를 섭씨 17도로 유지하여 열 충격 단백질의 발현을 방지해야 합니다.마이크로플레이트를 열 조절이 가능한 보관 장소에 보관하십시오. 그런 다음 OR2의 결합 분석에서 양성 반응을 보인 테스트 화합물을 전기생리학적 기록을 위해 0.1 및 1000마이크로몰로 용해하고 96웰 평평한 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 폐기합니다. 두 개의 전극 전압 클램프 기록을 수행하려면 난모세포가 포함된 플레이트를 자동화 시스템에 놓습니다.집중 활동 관계의 적절한 결정을 위해 이 체계와 함께 아이콘 기반 인터페이스를 사용하여 자동 기록 시스템을 프로그래밍합니다. 곡선 피팅의 경우, 그림에 표시된 농도 활성화 곡선을 사용하여 현재 진폭을 작용제 농도의 로그 함수로 플롯합니다. 전기생리학적 기록을 위해 실온에서 탄수화물이 거품이 일도록 한 dACSF 용액에 뇌를 보관하십시오.그런 다음 미세한 주걱으로 왼쪽 해마 형성을 해부합니다. 그 후, 조직 초퍼로 해마의 중간 부분에서 400마이크로미터 두께의 횡단 슬라이드를 절단합니다. 페인팅 브러시를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 실온에서 45분 동안 유지합니다.그 후, 섭씨 35도에서 분당 1.5밀리리터의 속도로 탄수화물로 거품이 일게 된 rACSF로 슬라이스를 관류합니다. 단일 집단 급증을 기록하려면 현미경 장착 챔버에 뇌 절편을 놓습니다. 분당 3밀리리터의 속도로 rACSF로 슬라이스를 관류합니다.피펫 풀러를 사용하여 약 2메가옴의 저항으로 붕규산 유리 마이크로피펫을 당깁니다. 마이크로피펫에 2몰 염화나트륨이 함유된 용액을 채우고 피펫 홀더에 넣습니다. 오른쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 피라미드층(stratum pyramidale)에 기록 마이크로피펫을 배치합니다.그런 다음 절연된 바이폴라 백금 이리듐 전극을 왼쪽 마이크로 매니퓰레이터의 홀더에 놓습니다. 왼쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 Schaffer 측부에 자극 전극을 배치합니다. 자극 생성기를 사용하여 30초마다 자극 전극에 전류 펄스를 전달하고 인구 급증이 나타날 때까지 자극 강도를 점차적으로 증가시킵니다.얻을 수 있는 최대 진폭의 45%에 해당하는 개체군 급증을 유발하도록 자극 강도를 조정합니다. 쌍을 이루는 펄스 억제를 수행하려면 자극 생성기를 사용하여 30초마다 두 개의 전류 펄스를 자극 전극에 전달합니다. 최대 진폭의 45%에 해당하는 인구 급증을 유발하도록 자극 강도를 설정합니다.화합물을 테스트하려면 DMSO의 최종 농도가 0.1%보다 높지 않도록 ACSF에서 테스트할 화합물을 희석합니다.화합물 용액과 동일한 농도로 대조 용액에 DMSO를 추가합니다. Schaffer 측부 자극에 의해 유발된 단일 또는 쌍의 펄스 집단 스파이크를 최소 30분 동안 30초마다 기록합니다. 인구 급증 모양은 이 기준 기간 동안 안정적이어야 합니다.다음으로, 테스트할 화합물의 고정 농도를 포함하는 발암화 rACSF가 있는 비커를 준비하고 단일 또는 쌍 펄스 집단 스파이크를 기록하는 동안 용액으로 해마 절편을 관류합니다. 또한 화합물 없이 발탄화된 rACSF로 슬라이스를 관류하여 복합 효과로부터의 회복을 평가합니다. 여기에 표시된 것은 쥐 해마 절편의 개략적인 표현이며, CA1 피라미드 뉴런의 수지상 수목화에 돌출된 CA3 피라미드 세포 축삭에서 유래한 Schaffer 담보입니다.마이크로피펫은 개체군 급증을 기록하기 위해 피라미드층(stratum pyramidale)에 배치되었고, 필드 흥분성 시냅스후 전위(field excitatory postsynaptic potentials)의 수상돌기 기록을 위해 방사층(stratum radiatum)에 배치되었습니다. 자극 전극은 Schaffer 담보 내에 배치되었습니다. 이 그림은 20밀리초 간격으로 동일한 자극 전극을 통해 가해지는 쌍의 자극에 의해 유발되는 인구 급증을 보여줍니다.두 번째 자극에 대한 집단 반응은 첫 번째 자극에 대한 반응보다 진폭이 더 작습니다. 개체군 급증은 비선택적 GABA A 수용체 NAM인 베타 CCM의 부재 및 존재 여부에 따라 기록되었습니다. 베타 CCM은 피드포워드 가베르직 억제를 부분적으로 차단하여 두 번째 집단 급증의 진폭을 향상시켰습니다.이 절차에 따라 약동학, 수용체 점유 및 생체 내 효능 및 안전성 약리학과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 화합물의 임상 개발 가능성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

감마-아미노낙산 수용체 A형 신경전달을 조절하는 새로운 화합물의 발견 방법

이 논문에서, 우리는 심하게 절연 뇌 조각의 뉴런에 리간드 - 개폐 이온 채널 기능을 연구 할 수있는 유용한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 패치 클램프 기술을 사용하여 기록 뉴런에 약물의 로컬 응용 프로그램에 대한 약물 채워진 micropipette의 사용을 포함한다.

마우스 뇌 슬라이스의 Nicotinic 아 세티 콜린 수용체 기능을 공부하는 약물의 로컬 응용 프로그램

여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

이 방법은 급성 뇌 슬라이스를 사용하여 내인성 모아민 방출의 검출을위한 간단한 기술을 소개합니다. 설정은 모노아민 방출을 위한 조직 홀더를 포함하는 48웰 플레이트를 사용합니다. 방출된 모노아민은 HPLC에 의해 전기화학적 검출과 결합하여 분석된다. 또한,이 기술은 약물 발견을위한 스크리닝 방법을 제공합니다.

급성 뇌 슬라이스에서 내인성 모아민 방출 측정을 위한 판 기반 분석

상기 프로토콜은 기능적 막횡단 트로포미오신 키나제 수용체 B 단백질을 함유하는 고정화된 세포막 단편을 갖는 세포막 친화성 크로마토그래피(CMAC) 컬럼의 제조를 기술한다. 이러한 수용체와 상호 작용하고 복잡한 천연 혼합물에 존재하는 특수 식물 대사 산물의 확인에 CMAC 컬럼의 사용도 설명됩니다.

고정화된 트로포미오신 키나제 수용체 B와 상호작용하는 특수 식물 대사산물을 확인하기 위한 세포막 친화성 크로마토그래피 컬럼

이 프로토콜은 Xenopus laevis 난모세포로 시냅스 막의 미세 이식을 수행함으로써 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산 및 γ-아미노부티르산 수용체의 일관되고 신뢰할 수 있는 반응을 기록할 수 있음을 입증한다.

기능적 연구를 위한 인간 시냅틱 수용체를 재활성화하기 위한 시냅틱 멤브레인의 미세이식

BS3 화학적 가교 분석은 만성 심리사회적 스트레스 조건 하에서 마우스 뇌에서 감소된 세포 표면 GABAA 수용체 발현을 보여줍니다.

BS3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 GABAA 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가

여기에서는 인간 γ-세크레타아제를 재구성하는 효모 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템을 통해 활성에 영향을 미치는 돌연변이를 식별 및 연구하고 γ-secretase 억제제(GSI)를 스크리닝할 수 있습니다. 가족성 알츠하이머병 돌연변이의 기능 상실 특성을 활용하여 γ-secretase 조절제(GSM)를 스크리닝할 수 있습니다.

Saccharomyces cerevisiae γ-Secretase에 의한 아밀로이드 베타 생산에 영향을 미치는 유전자, 돌연변이 및 화학 물질을 스크리닝하는 알츠하이머병 모델

배우세요 GABA A 수용체 리간드 발견을 위한 선별 캐스케이드 방법을 Xenopus oocyte와 설치류 뇌 조각을 활용한 전기생리학 기록 기법으로. 이 방법은 선택적이고 효능 높은 화합물 식별에 활용됩니다.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

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