감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

이 비디오의 전반적인 목표는 새로운 GABA-A 수용체 리간드를 발견할 수 있는 스크리닝 캐스케이드를 설명하는 것입니다. 방사성 리간드 결합, xenopus 난모세포 및 설치류 뇌 절편에서 전기생리학적 기록을 문학적 방식으로 사용하는 이점은 화합물의 프로필을 개선할 수 있다는 것입니다. 궁극적으로 강력한 아형, 선택성 및 효과적인 화합물이 확인됩니다.

이 시연은 쿠미코 캄바라(Kumico Kambara)와 제나 토그나치니(Jenna Tognaccini), HiQScreen의 소니아(Sonia)와 다니엘 베르트랑(Daniel Bertrand), 로슈(Roche)의 마리 클레어 플림린(Marie Claire Pflimlin)이 수행합니다. 압력 배출 시스템 또는 자동 주입 시스템이 장착된 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 팁 직경이 최대 100마이크로미터인 유리 미세 주입 바늘을 사용하여 플라스미드를 함유한 용액 10-50나노리터를 주입합니다. 이 절차를 시작하려면 난모세포를 섭씨 17도로 유지하여 열 충격 단백질의 발현을 방지해야 합니다.

마이크로플레이트를 열 조절이 가능한 보관 장소에 보관하십시오. 그런 다음 OR2의 결합 분석에서 양성 반응을 보인 테스트 화합물을 전기생리학적 기록을 위해 0.1 및 1000마이크로몰로 용해하고 96웰 평평한 바닥 폴리프로필렌 플레이트에 폐기합니다. 두 개의 전극 전압 클램프 기록을 수행하려면 난모세포가 포함된 플레이트를 자동화 시스템에 놓습니다.

집중 활동 관계의 적절한 결정을 위해 이 체계와 함께 아이콘 기반 인터페이스를 사용하여 자동 기록 시스템을 프로그래밍합니다. 곡선 피팅의 경우, 그림에 표시된 농도 활성화 곡선을 사용하여 현재 진폭을 작용제 농도의 로그 함수로 플롯합니다. 전기생리학적 기록을 위해 실온에서 탄수화물이 거품이 일도록 한 dACSF 용액에 뇌를 보관하십시오.

그런 다음 미세한 주걱으로 왼쪽 해마 형성을 해부합니다. 그 후, 조직 초퍼로 해마의 중간 부분에서 400마이크로미터 두께의 횡단 슬라이드를 절단합니다. 페인팅 브러시를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고 실온에서 45분 동안 유지합니다.

그 후, 섭씨 35도에서 분당 1.5밀리리터의 속도로 탄수화물로 거품이 일게 된 rACSF로 슬라이스를 관류합니다. 단일 집단 급증을 기록하려면 현미경 장착 챔버에 뇌 절편을 놓습니다. 분당 3밀리리터의 속도로 rACSF로 슬라이스를 관류합니다.

피펫 풀러를 사용하여 약 2메가옴의 저항으로 붕규산 유리 마이크로피펫을 당깁니다. 마이크로피펫에 2몰 염화나트륨이 함유된 용액을 채우고 피펫 홀더에 넣습니다. 오른쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 피라미드층(stratum pyramidale)에 기록 마이크로피펫을 배치합니다.

그런 다음 절연된 바이폴라 백금 이리듐 전극을 왼쪽 마이크로 매니퓰레이터의 홀더에 놓습니다. 왼쪽 micromanipulator를 사용하여 해마 절편의 CA1 영역에 있는 Schaffer 측부에 자극 전극을 배치합니다. 자극 생성기를 사용하여 30초마다 자극 전극에 전류 펄스를 전달하고 인구 급증이 나타날 때까지 자극 강도를 점차적으로 증가시킵니다.

얻을 수 있는 최대 진폭의 45%에 해당하는 개체군 급증을 유발하도록 자극 강도를 조정합니다. 쌍을 이루는 펄스 억제를 수행하려면 자극 생성기를 사용하여 30초마다 두 개의 전류 펄스를 자극 전극에 전달합니다. 최대 진폭의 45%에 해당하는 인구 급증을 유발하도록 자극 강도를 설정합니다.

화합물을 테스트하려면 DMSO의 최종 농도가 0.1%보다 높지 않도록 ACSF에서 테스트할 화합물을 희석합니다.화합물 용액과 동일한 농도로 대조 용액에 DMSO를 추가합니다. Schaffer 측부 자극에 의해 유발된 단일 또는 쌍의 펄스 집단 스파이크를 최소 30분 동안 30초마다 기록합니다. 인구 급증 모양은 이 기준 기간 동안 안정적이어야 합니다.

다음으로, 테스트할 화합물의 고정 농도를 포함하는 발암화 rACSF가 있는 비커를 준비하고 단일 또는 쌍 펄스 집단 스파이크를 기록하는 동안 용액으로 해마 절편을 관류합니다. 또한 화합물 없이 발탄화된 rACSF로 슬라이스를 관류하여 복합 효과로부터의 회복을 평가합니다. 여기에 표시된 것은 쥐 해마 절편의 개략적인 표현이며, CA1 피라미드 뉴런의 수지상 수목화에 돌출된 CA3 피라미드 세포 축삭에서 유래한 Schaffer 담보입니다.

마이크로피펫은 개체군 급증을 기록하기 위해 피라미드층(stratum pyramidale)에 배치되었고, 필드 흥분성 시냅스후 전위(field excitatory postsynaptic potentials)의 수상돌기 기록을 위해 방사층(stratum radiatum)에 배치되었습니다. 자극 전극은 Schaffer 담보 내에 배치되었습니다. 이 그림은 20밀리초 간격으로 동일한 자극 전극을 통해 가해지는 쌍의 자극에 의해 유발되는 인구 급증을 보여줍니다.

두 번째 자극에 대한 집단 반응은 첫 번째 자극에 대한 반응보다 진폭이 더 작습니다. 개체군 급증은 비선택적 GABA A 수용체 NAM인 베타 CCM의 부재 및 존재 여부에 따라 기록되었습니다. 베타 CCM은 피드포워드 가베르직 억제를 부분적으로 차단하여 두 번째 집단 급증의 진폭을 향상시켰습니다.

이 절차에 따라 약동학, 수용체 점유 및 생체 내 효능 및 안전성 약리학과 같은 다른 방법을 수행하여 확인된 화합물의 임상 개발 가능성과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.